Pengaruh Konsentrasi Induser Dan Penambahan Kofaktor Enzim Terhadap Produksi Ekstrak Kasar Enzim Lipase Ekstraseluler Oleh Pseudomonas aeruginosa

(1)

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN

KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK

KASAR ENZIM LIPASE EKSTRASELULER

OLEH Pseudomonas aeruginosa

SKRIPSI

JIMMY UTAMI

060802052

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

(2)

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN

KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK

KASAR ENZIM LIPASE EKSTRASELULER

OLEH Pseudomonas aeruginosa

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi syarat mencapai gelar sarjana

JIMMY UTAMI

060802052

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

(3)

PERSETUJUAN

Judul

Kategori Nama

Nomor Induk Mahasiswa Pragram Studi

Departemen Fakultas

:

: : : : : :

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK KASAR ENZIM LIPASE EKSTRASELULER OLEH Pseudomonas aeruginosa SKRIPSI

JIMMY UTAMI 060802052

SARJANA S-1 KIMIA KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

Disetujui di Medan, 01 Januari 2011

Komisi Pembimbing :

Pembimbing 2 Pembimbing 1

Dra. Nunuk Priyani, M.Sc. Dr. Yuniarti Yusak, M.S.

NIP.19640428199603 2 001 NIP. 130 809 726

Diketahui/Disetujui oleh :

Departemen Kimia FMIPA USU Ketua,

(4)

PERNYATAAN

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK KASAR ENZIM LIPASE

EKSTRASELULER OLEH Pseudomonas aeruginosa

SKRIPSI

Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja saya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.

Medan, 01 Januari 2011

(5)

PENGHARGAAN

Segala puji bagi Allah, Tuhan pemilik alam semesta yang telah begitu banyak melimpahkan rahmat, nikmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK KASAR ENZIM LIPASE EKSTRASELULER OLEH Pseudomonas aeruginosa , yang disusun sebagai salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Sains pada Fakultas MIPA USU.

Ucapan terima kasih terbesar pertama sekali penulis sampaikan kepada kedua orang tua penulis, Ayahanda Suherman. R dan Ibunda Sri Astuti, atas pengorbanan, doa, cinta dan kasih sayangnya yang tak terhingga kepada penulis selama ini. Dan juga kepada Bu Dadek yang sangat banyak membantu penulis, serta kepada seluruh keluarga.

Pada kesempatan ini dengan segala kerendahan hati, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang tulus kepada:

1. _{Ibu Dr. Yuniarti Yusak, M.S. dan Ibu Dra. Nunuk Priyani, M.Sc. selaku} pembimbing I dan II yang dengan kesabarannya telah memberikan arahan, waktu dan perhatiannya kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini dari awal hingga akhir.

2. _{Ibu Dr. Rumondang Bulan Nst, MS selaku Ketua Departement Kimia} FMIPA USU.

3. _{Ibu Dra. Emma Zaidar Nst, MSi selaku Kepala Laboratorium Biokimia /} KBM FMIPA USU.

4. _{Bapak Prof. Dr. H. Erman Munir, M. Sc selaku Kepala Laboratorium} Mikrobiologi FMIPA USU.

5. _{Ibu Sovia Lenny, SSi, MSi selaku dosen wali yang dengan kesabarannya} telah memberikan arahan dalam memilih mata kuliah selama menjalani studi

6. _{Teman-teman selama kuliah, teman angkatan 05, 04, 03, adik-adik} stambuk 07, 08, 09, rekan-rekan asisten Lab. Biokimia, rekan-rekan asisten dan teman di Lab. Mikrobiologi.

(6)

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN

KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK KASAR

ENZIM LIPASE EKSTRASELULER OLEH Pseudomonas

aeruginosa

ABSTRAK

Produksi ekstrak kasar enzim lipase ekstraseluler oleh bakteri Pseudomonas aeruginosa. Dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada variasi konsentrasi induser minyak wijen yang ditambahkan yaitu 2%, 4%, 6%, 8% dan 10% dan dengan pengaruh penambahan koenzim Ca2+ pada masing-masing induser

Parameter yang diamati adalah kadar protein dari ekstrak kasar enzim lipase yang diproduksi dan kadar asam lemak bebas. Kadar protein ditentukan dengan metode pengukuran kuantitatif berdasarkan besar absorbansinya. Uji aktivitas dari ekstrak kasar enzim lipase dilakukan dengan pengukuran kadar asam lemak bebas yang ditentukan dengan metode titrimetri.

(7)

THE EFFECT OF CONCENTRATION INDUCER AND COFACTOR ENZYME ADDITION for CRUDE PRODUCTION OF EXTRACELLULAR

LIPASE ENZYME BY Pseudomonas aeruginosa

ABSTRACT

Crude extract production of extracellular lipase by Pseudomonas aeruginosa was performed by growing the bacteria on various inducer concentration of sesame oil which were 2, 4, 6, 8 and 10% and with combined by addition of coenzyme Ca2+ on each inducer

The parameters measured were protein content of the crude extract produced lipase and free fatty acid concentration. Protein content was analyzed by quantitative measurement method based on the absorbance. The activity of lipase crude extract was determined by measuring the free fatty acid concentration which determined by titrimetric method.

(8)

DAFTAR ISI

Halaman

Persetujuan ii

Pernyataan iii

Penghargaan iv

Abstrak vi

Abstract vii

Daftar Isi viii

Daftar Tabel xi

Daftar Gambar xii

Daftar Lampiran xiii

Bab 1 Pendahuluan

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Permasalahan 3

1.3 Pembatasan Masalah 3

1.4 Tujuan Penelitian 4

1.5 Manfaat Penelitian 4

1.6 Lokasi penelitian 4

1.7 Metodologi Penelitian 4

Bab 2 Tinjauan Pustaka

2.1 Enzim 6

2.1.1 Kerja Enzim pada Substrat 7

2.1.2 Pengaruh Kadar Enzim dan Substrat 7

2.1.3 Enzim Lipase 8

2.1.4 Hipotesis Operon 9

2.1.4 Ion Logam Sebagai koenzim 11

2.2 Minyak 12

(9)

2.2.2 Analisa Kuantitatif Asam Lemak Bebas 14

2.3 Bakteri 15

2.3.1 Pseudomonas aeruginosa 16

2.4 Media Fermentasi 17

Bab 3 Metodologi Penelitian

3.1 Alat dan Bahan 19

3.1.1 Alat-Alat 19

3.1.2 Bahan-Bahan 20

3.2 Prosedur Penelitian 21

3.2.1 Pembuatan Larutan Pereaksi 21

3.2.2 Sterilisasi Alat 25

3.2.3 Pembuatan Media 26

3.2.4 Sterilisasi Media dan Bahan 26

3.2.5 Pembuatan starter Pseudomonas Aeruginosa 26

3.2.6 Pembuatan Standard Mac Varlan 27

3.2.7 Pembuatan Mac Varlan Bakteri Pseudomonas Aeruginosa 27

3.2.8 Penanaman bakteri pada media cair 27

3.2.9 Penanaman bakteri pada media cair dengan co-enzim Ca2+- 27

3.2.10 Pembuatan ekstrak Kasar Enzim Lipase 28

3.3 Parameter yang Diamati 28

3.3.1 Penentuan Absorbansi Maksimum Larutan Bovine Serum

Albumin 5000µg/mL 28

3.3.2 Penentuan Absorbansi Maksimum Larutan Bovine Serum

Albumin 5000µg/mL 28

3.3.3 Penentuan Kadar Protein Ekstrak Kasar Enzim Lipase

Ekstraseluler Pseudomonas Aeruginosa 28

3.3.4 Penentuan Kadar Asam Lemak Bebas 29

3.4 Skema Penelitian 30

3.4.1 Skema Pembuatan Media 30

3.4.2 Skema Pembuatan Starter Pseudomonas Aeruginosa 32

3.4.3 Skema Penanaman Media untuk menghasilkan

(10)

3.4.4 Skema Parameter yang diamati 35

Bab 4 Hasil dan Pembahasan

4.1 Hasil penelitian 38

4.1.1. Penentuan panjang gelombang maksimum larutan BSA 38

4.1.2. Penentuan kurva standar larutan BSA pada λ 775 nm 40

4.1.3 Penentuan kadar protein enzim lipase dari

Pseudomonas aeruginosa 40

4.1.4 Penentuan kadar protein enzim lipase

dengan penambahan Ca2+ Pseudomonas aeruginosa 41

4.1.5. Uji aktivitas 42

4.2 Pembahasan Hasil Penelitian 44

Bab 5 Kesimpulan dan Saran

5.1 Kesimpulan 50

5.2 Saran 50

Daftar Pustaka 51

(11)

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1

Tabel 2.2

Tabel 2.3

Tabel 4.1

Tabel 4.2

Tabel 4.3

Tabel 4.4

Tabel 4.5

Komposisi Asam Lemak Minyak Wijen

Komposisi Gizi Wijen / 100 gr

Unsur yang ada pada mikrobia

Absorbansi larutan BSA pada λ 775 nm

Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan untuk

konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 %.

Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan untuk

konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 % dengan penambahan

kofaktor enzim.

Aktivitas ekstrak kasar Enzim Lipase

Aktivits ekstrak kasar Enzim Lipase yang menggunakan

kofaktor enzim Ca2+

13

14

17

40

41

42

43

(12)

DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 2.3 Gambar 2.4 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 4.2.2 Gambar 4.2.3 Gambar 4.2.4 Gambar a Gambar b Gambar c Gambar d

Grafik hubungan konsentrasi enzim dan kecepatan

reaksi.

Stereokimianya interaksi ikatan enzim dengan substrat

Struktur Lipid.

Mekanisme Lac_Operon

Grafik Penentuan panjang gelombang maksimum

larutan BSA 5000 µg/mL.

Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan

untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 %.

Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan

untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 % dengan

penambahan kofaktor enzim.

Kadar Asam Lemak Bebas (%) Pada Ekstrak kasar

Enzim Lipase.

Kadar Asam Lemak Bebas (%) Pada Ekstrak Kasar

Enzim Lipase dengan Penambahan kofaktor enzim

Ca2+ .

Pure culture Pseudomonas aeruginosa.

starter Pseudomonas aeruginosa siap pakai.

Hasil biakan Pseudomonas aeruginos pada media cair.

Hasil biakan Pseudomonas aeruginos pada media cair dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+.

(13)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1

Lampiran 2

Lampiran 3

Lampiran 4

Lampiran 5

Lampiran 6

Penentuan kurva standar pada λ 775 nm.

Absorbansi ekstrak kasar enzim lipase pada konsentrasi

minyak wijen 2, 4, 6, 8, 10 %.

Absorbansi ekstrak kasar enzim lipase dengan

penambahan kofaktor enzim Ca2+ pada konsentrasi

minyak wijen 2, 4, 6, 8, 10 %.

Penentuan kadar Asam Lemak Bebas pada ekstrak

kasar enzim lipase pada minyak wijen.

Penentuan kadar Asam Lemak Bebas pada ekstrak

kasar enzim lipase dengan penambahan kofaktor enzim

Ca2+ pada minyak wijen.

Gambar penelitian

55

57

58

60

61

(14)

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN

KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK KASAR

ENZIM LIPASE EKSTRASELULER OLEH Pseudomonas

aeruginosa

ABSTRAK

Produksi ekstrak kasar enzim lipase ekstraseluler oleh bakteri Pseudomonas aeruginosa. Dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada variasi konsentrasi induser minyak wijen yang ditambahkan yaitu 2%, 4%, 6%, 8% dan 10% dan dengan pengaruh penambahan koenzim Ca2+ pada masing-masing induser

Parameter yang diamati adalah kadar protein dari ekstrak kasar enzim lipase yang diproduksi dan kadar asam lemak bebas. Kadar protein ditentukan dengan metode pengukuran kuantitatif berdasarkan besar absorbansinya. Uji aktivitas dari ekstrak kasar enzim lipase dilakukan dengan pengukuran kadar asam lemak bebas yang ditentukan dengan metode titrimetri.

(15)

THE EFFECT OF CONCENTRATION INDUCER AND COFACTOR ENZYME ADDITION for CRUDE PRODUCTION OF EXTRACELLULAR

LIPASE ENZYME BY Pseudomonas aeruginosa

ABSTRACT

Crude extract production of extracellular lipase by Pseudomonas aeruginosa was performed by growing the bacteria on various inducer concentration of sesame oil which were 2, 4, 6, 8 and 10% and with combined by addition of coenzyme Ca2+ on each inducer

The parameters measured were protein content of the crude extract produced lipase and free fatty acid concentration. Protein content was analyzed by quantitative measurement method based on the absorbance. The activity of lipase crude extract was determined by measuring the free fatty acid concentration which determined by titrimetric method.

(16)

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Proses hidrolisis minyak/lemak menjadi asam lemak dan gliserol secara komersial

yang sampai kini digunakan, beroperasi pada suhu 240-250oC dan tekanan 45-50 bar.

Kondisi proses ini membawa konsekuensi kebutuhan biaya investasi yang tinggi,

karena peralatan proses utama pabrik harus tahan terhadap suhu dan tekanan yang

tinggi, serta tahan terhadap asam (korosif). Proses ini juga mengkonsumsi energi yang

besar untuk mempertahankan kondisi operasinya. Oleh karenanya perlu dicari

alternatif proses yang dapat berlangsung pada suhu dan tekanan rendah. Proses

hidrolisis enzimatik menggunakan enzim lipase memenuhi kriteria tersebut.

(Malcolm, D, 1964)

Penelitian-penelitian produksi enzim lipase terdahulu yang pernah dilakukan

pada umumnya menggunakan limbah minyak kelapa sawit sebagai induser untuk

memacu produksinya (Priyani, Nunuk, 2001). Pada penelitian ini digunakan minyak

wijen sebagai indusernya, karena Wijen (Sesamum indicum L.) merupakan komoditas

pertanian yang sangat potensial sebagai penghasil minyak nabati yang dibutuhkan

dalam industri kosmetik, farmasi, makanan, dan lain-lain. Wijen mendapat julukan

The Queen of Oil Seeds Crops, yang mencerminkan bahwa biji wijen memiliki

kandungan gizi yang tinggi dan berdampak positif bagi konsumennya (Handajani,

2006).

Enzim adalah protein yang diproduksi dari sel hidup dan digunakan oleh

sel-sel untuk mengkatalisis reaksi kimia yang spesifik. (Shahib, 1992). Enzim dikatakan

(17)

biologis. Dalam jumlah yang sangat kecil, enzim dapat mengatur reaksi tertentu dan

mempunyai sifat sangat spesifik, karena hanya bekerja pada induser tertentu (Girindra,

1990) yang dalam aktivitasnya enzim kadang-kadang membutuhkan kofaktor yang

bisa berupa senyawa organik atau logam (Soeharsono, 1989).

Enzim lipase atau lengkapnya triasilgliserol lipase adalah enzim yang

menghidrolisis ester karboksilat. Enzim ini mempunyai induser alami berupa

trigliserida dan lipase ekstraseluler berhasil diisolasi dari Pseudomonas aeruginosa

pada tahun 1986. Enzim lipase stabil pada suhu optimumnya yaitu 30o , walaupun

masih aktif pada 51o C. (Nishio, 1987)

Pseudomonas aeruginosa merupakan salah satu spesies dari genus

Pseudomonas. Bakteri ini dapat menggunakan lebih dari 80 macam bahan organik

untuk pertumbuhannya, tetapi Pseudomonas dapat menggunakan arginine dan nitrat

sebagai elektron akseptor sehingga dapat tumbuh pada suasana anaerob. Pseudomonas

aeruginosa tumbuh pada suhu 35-42oC.

Berbagai penelitian telah menunjukkan bahwa Pseudomonas sp merupakan

salah satu anggota bakteri gram negatife yang umumnya menggunakan protein atau

lipid sebagai sumber energi maupun sumber carbon dan juga mampu menguraikan

berbagai jenis induser (Mc Clay, 1996 dan Wischnak, 1998), sedangkan minyak dan

lemak tergolong kepada anggota dari golongan lipid yaitu lipid netral. Minyak dan

lemak yang telah dipisahkan dari jaringan asalnya mengandung sejumlah komponen

selain trigliserida, yaitu: 1. Lipid kompleks (yaitu leshitin, cephalin, fosfatida, lainnya

serta glikolipid), 2. Sterol, berada dalam keadaan bebas atau terikat dengan asam

lemak, 3. Asam lemak bebas, 4. Lilin, 5. Pigmen yang larut dalam lemak, dan 6.

Hidrokarbon. (Ketaren, 1986)

Minyak wijen mengandung kurang lebih 0,3-0,5 % sesameoil, fenol berikatan 1-4

yang dikenal sebagai sesamol, dan sesamine sekitar 0,5-0,1 %.. Minyak wijen juga

mengandung asam-asam lemak, seperti: Palmitat 9,1%, stearat 4,3%, arachidat 0,8%,

oleat 45,4%, dan linoleat 40,4% ( Hilditch, 1947). Dimana menurut penelitian Abigor

(18)

baik dan tetap aktif pada pH 7-7,5. Bakteri pada umumnya akan tumbuh dan

berkembang dengan cepat, membentuk suatu koloni bila ditanam pada media

pembenihan yang sesuai. (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas

Brawijaya,2003), dan dengan penambahkan ion magnesium kedalam media

pertumbuhan dapat menstimulasi pelepasan lipase ektraseluler dari dinding sel

mikroorganisme sehingga dapat meningkatkan pembentukan lipase (Aisaka & Terada,

1979), dimana kofaktor dari ion logam Ca2+ dalam konsentrasi yang rendah akan

mengaktifkan reaksi enzimatik lipase (Malcolm, D, 1964).

1.2 Permasalahan

Berdasarkan penelitian terdahulu dimana kofaktor dapat memantapkan kerja enzim

(Malcolm, D, 1964) maka kami ingin meneliti bagaimana pengaruh konsentrasi

minyak wijen yang digunakan sebagai induser dan penambahan kofaktor enzim Ca2+

terhadap produksi enzim lipase oleh Pseudomonas aeruginosa.

1.3 Pembatasan Masalah

Dalam penelitian ini hanya terbatas pada objek masalah yang berhubungan dengan

penelitian ini saja yaitu :

1. Enzim yang digunakan diperoleh dari bakteri Pseudomonas aeruginosa yang

diperoleh dari Laboratotium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA USU.

2. Bakteri Pseudomonas aeruginosa yang digunakan adalah yang ber- tipe TJB

01 (Warsito, K. 2009).

3. Induser yang digunakan adalah minyak wijen dengan variasi konsentrasi 2%,

4%, 6%, 8%, dan 10%.

4. Kofaktor enzim yang digunakan adalah Ca2+ (Malcolm, D, 1964) yang berasal

dari Kristal CaCl2

5. Buffer yang digunakan adalah buffer fosfat (Rita, R, et all, 1989) dengan pH

7,0 (Abigor dkk 2002).

6. Waktu inkubasi dalam memproduksi enzim lipase adalah 3x24 jam dengan

(19)

7. Parameter yang diamati adalah besar absorbansi dari ekstrak kasar enzim

lipase yang diproduksi dan kadar asam lemak bebas.

8. Untuk mendapatkan ekstrak kasar enzim lipase dilakukan dengan Sentrifuse

dengan kecepatan 6000 rpm.

9. Penentuan kadar enzim lipase kasar yang dilakukan dengan metode

pengukuran kuantitatif menggunakan Spektrofotometri UV-Visible dan

Spektrometri Genecese 20.

10.Penentuan kadar asam lemak bebas dilakukan dengan metode titrasi (Ketaren,

1986).

1.4 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Untuk mengetahui pengaruh perbedaan konsentrasi induser yang ditambahkan

ke dalam media terhadap hasil produksi enzim lipase ekstraseluler oleh bakteri

Pseudomonas aeruginosa.

2. Untuk mengetahui pengaruh penambahan kofaktor enzim terhadap jumlah

produksi enzim lipase ekstraseluler yang dihasilkan.

1.5 Manfaat Penelitian

Dari hasil penelitian diharapkan:

1. Dapat diketahui kondisi optimum dari bakteri Pseudomonas aeruginosa

sehingga dapat memproduksi enzim lipase ekstraseluler secara maksimal.

2. Dapat mengetahui pengaruh penambahan kofaktor enzim terhadap enzim

lipase ektraseluler yang diproduksi oleh bakteri Pseudomonas aeruginosa

TJB01.

1.6 Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia FMIPA-USU, Medan,

Laboratorium Mikrobiologi FMIPA-USU, Medan, dan Laboratorium Proteksi Bahan

(20)

1.7 Metodologi Penelitian

Penelitian ini adalah eksperimental laboratorium, dengan menggunakan biakan murni

Bakteri Pseudomonas aeruginosa yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi

FMIPA USU dan sampel yang digunakan sebagai induser berupa minyak wijen yang

diperoleh dari Supermarket VIGO Medan. Pada penelitian ini untuk mendapatkan

kondisi yang optimum, maka Pseudomonas aeruginosa ditumbuhkan pada media

dengan sumber carbon yang berasal dari minyak wijen dengan konsentrasi yang

divariasikan, sebagai sumber nitrogen yang diujikan adalah 0,3% ammonium nitrat

(NH4NO3) (Chen SY et.al, 2007) dan komposisi senyawa lain yang juga dibuat tetap

yaitu: KH2PO4 dan K2HPO4 (ATCC, 1989) sebagai buffer pada pH 7 (Abigor dkk

(2002) 0,02% MgSO4.7H2O (Koch, et al, 1991) penambahan Co-enzim Ca2+

(Malcolm, D, 1964) yang berasal dari 1,5% CaCL2.2H2O (Gupta, V.K, 2008), dimana

langkah-langkahnya adalah sebagai berikut :

Dalam penelitian ini digunakan tiga variabel yaitu variabel tetap, variabel

bebas dan variabel terikat.

1. Variabel tetap meliputi : Jenis induser, jenis kofaktor enzim, jumlah bakteri yang

dimasukkan, temperatur, pH, tempat produksi, dan lama produksi.

2. Variabel bebas meliputi : Konsentrasi induser, komposisi media.

3. Variabel terikat meliputi : Produksi enzim lipase yang diukur berdasarkan nilai

(21)

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1Enzim

Enzim adalah protein yang diproduksi dari sel hidup dan digunakan oleh sel-sel untuk

mengkatalisis reaksi kimia yang spesifik. Enzim memiliki tenaga katalitik yang luar

biasa dan biasanya lebih besar dari katalisator sintetik. Spesifitas enzim sangat tinggi

terhadap substratnya. Tanpa pembentukan produk samping enzim merupakan unit

fungsional untuk metabolisme dalam sel, bekerja menurut urutan yang teratur. Sistem

enzim terkoordinasi dengan baik menghasilkan suatu hubungan yang harmonis

diantara sejumlah aktivitas metabolic yang berbeda (Shahib, 1992). Enzim dikatakan

sebagai suatu kelompok protein yang berperan sangat penting dalam aktivitas

biologis. Dalam jumlah yang sangat kecil, enzim dapat mengatur reaksi tertentu

sehingga dalam keadaan normal tidak terjadi penyimpangan-penyimpangan hasil akhir

reaksinya. Enzim ini akan kehilangan aktivitasnya akibat panas, asam atau basa kuat,

pelarut organik, atau pengaruh lain yang bisa menyebabkan denaturasi protein. Enzim

dikatakan mempunyai sifat sangat khas, karena hanya bekerja pada substratnya

(Girindra, 1990).

Untuk aktivitasnya kadang-kadang enzim membutuhkan kofaktor yang bisa

berupa senyawa organik atau logam. Senyawa organik itu terikat pada bagian protein

enzim. Bila ikatan itu lemah maka kofaktor tadi disebut co-enzim dan dan jika terikat

erat melalui ikatan kovalen maka dinamakan gugus prostetis. Pada umumnya dua

kofaktor itu tidak dibedakan dan disebut co-enzim saja. Apabila enzim itu terdiri dari

bagian seperti yang diterangkan diatas maka keseluruhan enzim itu dinamakan holo

enzim. Bagian protein dinamakan apo-enzim dan bagian non proteinnya disebut

(22)

enzim atau mentransfer electron yang timbul selama proses katalisis (Soeharsono,

1989).

2.1.1 Kerja Enzim Pada Substrat

Enzim meningkatkan kemungkinan molekul-molekul yang bereaksi saling bertemu

dengan permukaan yang saling berorientasi. Hal ini terjadi karena enzim mempunyai

suatu afinitas yang tinggi terhadap substrat dan mempunyai kemampuan untuk

mengikat substrat tersebut walaupun bersifat sementara. Penyatuan antara substrat

dengan enzim sangat spesifik substrat terikat dengan enzim sedemikian rupa, sehingga

setiap substrat terorientasi secara tepat untuk terjadi reaksi.

Pembentukan ikatan yang sementara (biasanya ikatan nonkovalen) antara

substrat dengan enzim menimbulkan penyebaran elektron dalam molekul substrat dan

penyebaran ini menyebabkan suatu regangan pada ikatan kovalen spesifik dalam

molekul substrat, sehingga ikatan kovalen tersebut menjadi mudah terpecah. Para ahli

biokimia menamakan keadaan dimana terjadi regangan ikatan molekul substrat setelah

berinteraksi dengan enzim disebut pengaktifan substrat (Shahib, 1992).

2.1.2 Pengaruh Kadar Enzim dan Substrat

Kecepatan reaksi bergantung pada konsentrasi enzim yang berperan sebagai

katalisator dalam reaksi itu. Pada gambar 2.1.2 terlihat hubungan jika konsentrasi

enzim yang digunakan tetap, sedangkan substrat dinaikkan. Di sini dapat terlihat

bahwa pada penambahan pertama kecepatan reaksi naik dengan cepat. Tetapi jika

penambahan substrat dilanjutkan, dilanjutkan maka tambahan kecepatan mulai

menurun sampai pada suatu ketika tidak ada tambahan kecepatan reaksi lagi (Girindra,

(23)

K

e

ce

p

at

an

r

e

ak

si

Gambar. 2.1

Pada Substrat yang spesifik, enzim akan mengkatalisis reaksi sehingga

menghasilkan produk yang spesifik, juga pada penambahan pereaksi kimia tertentu

dapat mengakibatkan enzim menunjukkan bentuk stereokimianya dimana interaksi

enzim dengan substrat terjadi dalam ikatan, dimana kelebihan substrat tidak dapat

diikat seluruhnya oleh enzim (Trevar, 1985).

C

2.1.3 Enzim lipase

Lipase yang berasal dari bakteri pada umumnya adalah protein yang memiliki sifat

asam. Dan mempunyai berat molekul dari 20.000 sampai 60.000. Memiliki aktivitas

Kinetika Orde pertama (Fase I)

Gabungan “Orde 0” dan “orde 1”

Orde 0 (Fase II)

Kecepatan maksimum (v)

Konsentrasi substrat

v/2

Substrat

R’ R’

R’

R

A- A-

A-

Gambar 2.2

Enzim

(24)

spesifik protein murni yang berubah-ubah dari 500 sampai 10.000 unit lipase per mg

protein (Fogarty, William, M. 1983).

Gambar 2.3. Lipid (Triasilgliserol)

Enzim lipase atau lengkapnya triasilgliserol lipase adalah enzim yang

menghidrolisis ester karboksilat. Enzim ini mempunyai substrat alami berupa

trigliserida dari asam lemak yang mana reaksinya memerlukan air, dan lipase

ekstraseluler berhasil diisolasi dari Pseudomonas aeruginosa pada tahun 1986. Enzim

lipase memiliki sub unit berupa glikoprotein dan lipoprotein. Sub unit tersebut dapat

sebagai monomer, dimer, oligomer atau polimer. Enzim lipase stabil pada suhu

optimumnya yaitu 30o C, walaupun masih aktif pada 51o C, (Nishio, 1987). Dan

menurut penelitian Abigor dkk (2002) wijen digunakan sebagai katalis enzim lipase

dan dapat bekerja dengan baik dan bertahan hidup pada pH 7-7,5.

Pada banyak mikroorganisme, bagian yang kuat dari lipase ekstraseluler

sebagian masih terikat pada dinding sel. Karena adanya ikatan antara enzim dan

dinding sel mungkin menghambat ekskresi lipase berikutnya dalam media

pertumbuhan dan dengan demikian menurunkan hasil lipase ekstraseluler. Zat yang

dapat menstimulai pelepasan lipase dari dinding sel sehingga dapat meningkatkan

pembentukan lipase yaitu dengan menambahkan ion magnesium kedalam media

pertumbuhan ( Aisaka & Terada, 1979).

2.1.4 Hipotesis Operon

Dari aktivitas β-galaktosidase dalam sel E. Coli diusulkan hipotesis operon untuk

kontrol genetik dari sintesis protein pada prokariota. Jenis peraturan sintesis protein

(25)

kontrol yang diberikan terutama pada transkripsi gen menjadi mRNAs yang sesuai.

Ada cara umum lain dalam sintesis protein, yaitu, dengan kontrol translasi laju sintesis

dari rantai polipeptida dari template mRNA-nya. Kontrol transkripsi tampaknya

menjadi mekanisme utama untuk pengaturan ekspresi gen pada bakteri. Kontrol

Translational, yang tidak dipahami dengan baik, tampaknya merupakan mekanisme

sekunder pada bakteri tetapi sangat penting dalam eukariota.

Dari eksperimen mereka Jacob dan Monod terdapat tiga gen struktural z, y,

dan a coding untuk mensintesis β-galaktosidase, permease dan protein A,

masing-masing, yang semuanya dapat diinduksi oleh laktosa, terletak berdekatan satu sama

lain dalam kromosom E. coli dan DNA mengisi letak lain di dekat gen ini. Bagian i ini

diusulkan menjadi gen regulasi coding untuk sekuens asam amino dari protein yang

disebut represor, ketika gen i ditranskripsi untuk membentuk mRNA yang sesuai,

yang berdifusi terakhir ke ribosom dan ada bertindak sebagai template untuk sintesis

represor. Protein represor mengikat bagian lain pada segmen tertentu pada DNA yang

disebut operator. Pengikatan protein represor ke situs operator dalam DNA

dipostulatkan untuk mencegah atau menekan transkripsi oleh RNA polimerase dari

tiga gen struktural z, y, dan a coding untuk tiga enzim diinduksi oleh 3-galactosides,

Gambar 2.4 Mekanisme Lac_Operon

Untuk menjelaskan tindakan dari inducer, ketika glukosa tidak tersedia, tetapi

(26)

pengikatan spesifik yang kedua pada protein represor, letak inducer, untuk

membentuk sebuah kompleks penginduksi-represor. Ikatan dari inducer disebabkan

represor yang akan dibentuk dari operator pada DNA dengan penurunan afinitas untuk

yang kedua. Setelah kompleks represor-inducer dilepaskan, gen struktural untuk β

-galactosiclase dan dua lainnya protein menjadi tersedia untuk transkripsi oleh RNA

polimerase untuk menghasilkan mRNA yang sesuai. Ketiga protein kemudian

disintesis dari template mRNA pada ribosom, memungkinkan sel untuk menggunakan

laktosa sebagai sumber karbon dan energi.sel-sel yang diambil dari media terakhir,

dicuci, dan ditempatkan dalam sebuah medium, sedangkan-laktosa, D-glukosa, yang

sel selalu dapat digunakan. Karena konsentrasi laktosa dalam sel sekarang akan

menjadi rendah. induser terikat pada protein represor akan terpisahkan jauh,

menyebabkan molekul represor untuk kembali ke bentuk aktif, sehingga sekarang

terikat dengan afinitas yang tinggi ke bagian operator. Akibatnya, gen-gen struktural

untuk β-galaktosidase dan dua protein lain tidak bisa lagi ditranskripsikan, dan karena

kekurangan mRNA, protein ini tidak bisa lagi dibuat. Oleh karena itu protein

represor, melalui kapasitasnya untuk mengikat baik induser atau operator reversibel

tapi tidak keduanya secara bersamaan, sehingga dapat dihitung induksi dan represi

keduanya pada sintesis galaktosidase.

Ketiga gen struktural z, - v, dan, a bersama-sama dengan operator o mereka,

yang ditunjuk oleh Jacoob dan Monoc sebagai operon, khususnya, Lac_Operon.

Sebuah operon tetap terdiri dari kelompok gen struktural fungsional terkait, yang

dapat diaktifkan atau dinonaktifkan secara terkoordinasi, bersama dengan operator

mereka.(Lehninger, 1982)

2.1.5 Ion Logam sebagai kofaktor-enzim

Ion logam dapat digunakan sebagai aktivasi enzim dan pembawa elektron dengan

mekanisme variasi yang berbeda dan lingkungan mikro yang berbeda dalam jenis

(27)

a) secara tepat menjadi katalis pada enzim, b) Berpartisipasi dalam ikatan substrat

pada sisi aktif, c) menjaga konformasi enzim agar tetap sebagai katalis, dan d)

berpartisipasi dalam reaksi redoks. Beberapa logam seperti Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+,

Co2+, Mo2+ berikatan sangat kuat dengan enzim dan membentuk metaloenzim,

sedangkan logam Mg2+, Ca2+, Mn2+ berikatan lemah dengan enzim sehingga

membentuk metal-aktif enzim (Milton, S. H. 1987).

Fakta lain tentang enzim lipase adalah adanya ion logam Ca2+ dalam

konsentrasi yang rendah akan mengaktifkan reaksi enzimatik lipase. Senyawa lain

yang diketahui memiliki fungsi yang sama dengan Ca2+ adalah EDTA. Tetapi kation

divalent lainnya seperti Mg2+, Zn2+, Cu2+, dan Cd2+ pada konsentrasi rendah

menghambat aktivitas enzim ini sampai 70%. Dilain pihak Kalium asetat

mempertinggi aktivitas enzimatik lipase hingga 4 sampai 5 kali dikisaran konsentrasi

1yang lebih tinggi. Natrium Asetat mendorong kenaikan aktivitas enzimatik sampai

dua kali lipat pada konsentrasi rendah dan tidak berpengaruh apa-apa walau dalam

konsentrasi tinggi pada pH 7,0-75. Natrium Klorida hanya sampai batas konsentrasi

rendah yang mempengaruhi aktivitas enzimatik lipase dan pengaruhnya berupa

adanya kenaikan aktivitas enzimatik yang tipis (Schwimmer, S. 1981). Kofaktor akan

terikat pada gugus aktif pada molekul protein enzim, sehingga kerja enzim yang

ditunjukkan oleh aktivitas meningkat.(Lehninger, 1982)

2.2Minyak

Minyak dan lemak tergolong kepada anggota dari golongan lipid yaitu lipid netral.

Lipid itu sendiri dapat diklasifikasikan menjadi 4 kelas yaitu: 1) Lipid netral, 2)

Fosfatida, 3) Spingolipid dan 4) Glikolipid.

Minyak dan lemak yang telah dipisahkan dari jaringan asalnya mengandung

sejumlah komponen selain trigliserida, yaitu: 1) Lipid kompleks (yaitu leshitin,

cephalin, fosfatida, lainnya serta glikolipid), 2) Sterol, berada dalam keadaan bebas

atau terikat dengan asam lemak, 3) Asam lemak bebas, 4) Lilin, 5) Pigmen yang larut

(28)

Rata-rata komposisi minyak terdiri dari 58,2% sebagai sampel jenuh, 28,6%

senyawa aromatik dan 14,2% senyawa polar. Berdasarkan klasifikasi minyak,

senyawa aromatik ini adalah senyawa hidrokarbon yang terdiri dari cincin yang

mengandung enam atom karbon. Hampir kebanyakan senyawa aromatik ini bermassa

rendah dan jumlahnya dalam minyak sekitar 10-30% (Syakti, 2005).

2.2.1 Minyak Wijen

Tanaman wijen (Sesamum indicum L) termasuk family Pedaliaceae, varietas

Sesamum indicum sub spesies ialah S. orientale. (Ketaren, 1986) Minyak wijen

mengandung zat tidak tersabunkan dalam jumlah relative tinggi. Tetapi kandungan

tertinggi adalah sterol dan zat-zat yang tidak dapat dipisahkan dengan pemurnian,

sedangkan kadar bahan non minyak lainnya relative rendah (Bailey, 1951).

Minyak wijen mengandung kurang lebih 0,3-0,5 % sesameoline, fenol

berikatan 1-4 yang dikenal sebagai sesamol, dan sesamine sekitar 0,5-0,1 %.. Minyak

wijen juga mengandung asam-asam lemak, yaitu:

Asam Lemak Rumus Persen

Asam lemak jenuh

Palmitat

Stearat

Arachidat

Asam lemak tidak jenuh

Oleat

Linoleat

linolenat

C16H32O2

C18H36O2

C20H40O2

C18H34O2

C18H32O2

C18H30O2

9,1

4,3

0,8

45,4

40,4

( Hilditch, 1947)

(29)

Komposisi Jumlah (gr) Air

Protein

Lemak

Karbohidrat

Ca

P

Fe

Vitamin B1

Vitamin C

Bagian yang dapat dimakan

6

19,3

57,1

18,1

0,0012

0,614

0,0095

0,00093

0,0058

100

(Ketaren, 1986)

Tabel 2.2. Komposisi Gizi Wijen / 100 gr

2.2.2 Analisis Kuantitatif Asam Lemak Bebas

Kadar Asam lemak bebas dinyatakan sebagai jumlah rata-rata dari bobot asam lemak

yang tidak lagi terikat dengan molekul trigliserida dari setiap gram minyak atau

lemak. Soumano telah meneliti terbentuknya asam lemak yang bebas tersebut pada

saat reaksi interesterifikasi enzimatik minyak nabati dengan biokatalis berbagai jenis

lipase (Soumanou, M.M. 1997).

Untuk menentukan kadar minyak atau lemak dapat digunakan bilangan

penyabunan yaitu jumlah milligram KOH yang diperlukan untuk menyabunkan satu

gram minyak atau lemak. Dalam penetapan bilangan penyabunan biasanya larutan

alkali yang dipergunakan adalah KOH, yang diukur dengan hati-hati dengan

menggunakan buret dan pipet.

Campuran minyak atau lemak dengan larutan KOH didihkan pada pendingin

alir balik sampai terjadi penyabunan yang lengkap, kemudian larutan KOH yang

tersisa ditetapkan dengan jalan titrasi dengan larutan HCl 0,5 N. Bilangan penyabunan

dapat ditetapkan dengan jalan mengurangkan jumlah miliequivalen larutan alkali

(30)

tersebut, dibagikan dengan berat contoh dalam gram. Berat molekul untuk larutan

KOH adalah 56,1 : sedangkan berat molekul larutan NaOH adalah 39,9.

contoh gram

HCl N x HCl ml KOH N x KOH ml Penyabunan

Bilangan = 56,1( )( )

(Ketaren, 1986).

Cara lain untuk menentukan kadar asam lemak bebas dalam minyak nabati

yaitu dengan memodifikasi perhitungan menjadi bilangan asam atau acid value (AV).

Bilangan asam dinyatakan sebagai mg KOH yang dibutuhkan untuk mentitrasi asam

lemak bebas yang terkandung dalam 1 g minyak. Karenanya, pada perhitungan

bilangan asam, harus diketahui berat minyak yang bersangkutan (AOCS, 1989).

Terdapat sejumlah metode penentuan kadar asam lemak bebas selain metode

titri metri yaitu seperti metode yang didasarkan pada pengukuran PH atau tingkat

keasaman, dan teknik-teknik spektoskopi dengan atau tanpa pelarut (Velasco Arjona,

A. et al, 1998).

2.3 Bakteri

Bakteri adalah mikroorganisme bersel satu dan berkembang biak dengan membelah

diri. Ukuran bakteri bervariasi baik penampang maupun panjangnya, tetapi pada

umumnya penampang bakteri adalah sekitar 0,7-1,5 µm dan panjangnya sekitar

1-6µ m. Bentuk bakteri dibagi menjadi 3 yaitu :

1. Sferis (kokus)

Bakteri ada yang berbentuk sferis atau bulat, seperti ada yang ditemukan pada

genus Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria dan lain-lain

2. Batang (basil)

Bakteri yang berbentuk batang lurus misalnya dapat dijumpai pada famili

Enterobacteriaceae seperti Escheria coli, Salmonella typhi, Klebsiella

(31)

Bacillus yaitu Bacillus anthracis penyebab penyakit anthraks. Selain bentuk

batang lurus, dijumpai pula bentuk batang bengkok misalnya pada bakteri

Vibrio cholera penyebab penyakit cholera.

3. Spiral

Bakteri berbentuk spiral dijumpai pada penyebab penyakit sifilis yaitu

Treponema pallidum, bakteri penyebab demam bolak-balik yaitu Borelia

reccurentis (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas

Brawijaya,2003).

2.3.1 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa merupakan salah satu spesies dari genus Pseudomonas.

Pseudomonas aeruginosa bergerak aktif dengan flagella polar dan mempunyai ukuran

lebar 0,5-1 µm dan panjang 3-4 µ m dan bersifat aerob. Bakteri ini dapat menggunakan

lebih dari 80 macam bahan organik untuk pertumbuhannya, tetapi Pseudomonas

dapat menggunakan arginine dan nitrat sebagai elektro akseptor sehingga dapat

tumbuh pada suasana anaerob. Pseudomonas aeruginosa tumbuh pada suhu 35-42oC.

P.aeruginosa menghasilkan pigmen piosianin (Tim Mikrobiologi, Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya,2003).

Menurut Donnel, 1994 klasifikasi bakteri Pseudomonas adalah sebagai

berikut:

Kingdom : Prokaryotae

Divisio : Gracilitutes

Kelas : Protobakteria

Famili : Pseumonadacae

Genus : Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas sp.

Berbagai penelitian telah menunjukkan bahwa Pseudomonas sp merupakan

salah satu anggota bakteri gram negative yang umumnya menggunakan protein atau

lipid sebagai sumber energi maupun sumber carbon dan juga mampu menguraikan

(32)

2.4Media Fermentasi

Untuk mendapatkan biakan murni bakteri, bahan pemeriksaan klinis tersebut ditanam

pada media pembenihan. Media pembenihan yang digunakan untuk isolasi primer

tergantung dari dugaan kemungkinan bakterinya, namun biasanya digunakan media

pembenihan padat yang mengandung agar-agar untuk mendapatkan koloni bakteri

yang terpisah (isolated colony). Bakteri pada umumnya akan tumbuh dan berkembang

dengan cepat, membentuk suatu koloni bila ditanam pada media pembenihan yang

sesuai setelah diinkubasikan selama 18-24 jam pada suhu yang sesuai pula. (Tim

Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,2003).

Medium kultur harus mengandung semua elemen yang dibutuhkan untuk

pertumbuhan mikrobia, dalam proporsi yang serupa dengan yang ada pada sel

mikrobia yaitu :

Unsur Fungsi Fisiologi Berat kering

(%) Hidrogen Oksigen Karbon Nitrogen Sulfur Fosfor Magnesium Mangan Kalsium Besi Kobalt Tembaga, seng Molybdenum

Penyusun senyawa organik

Penyusun protein, asam nukleat, dan koenzim

Penyusun protein, dan beberapa koenzim

Penyusun asam nukleat, fosfolipida, dan

koenzim

Kofaktor pada sejumlah reaksi enzim (ATP)

Kofaktor pada beberapa enzim

Kofaktor pada beberapa enzim (Protease)

Penyusun sitokrom, protein, non-heme dan

kofaktor pada beberapa enzim

Penyusun vitamin B12

Penyusun beberapa enzim

[image:32.595.100.531.397.727.2]

8 20 50 14 1 3 0.5 0.1 0.5 0.2 0.03 0.03

(33)

Umumnya yang disebut makronutrien adalah yang dibutuhkan dalam jumlah besar

seperti C, H, O, N,. Mesonutrien dibutuhkan dalam jumlah lebih sedikit seperti Mg, P,

S, dan mikronutrien dibutuhkan dalam jumlah sangat sedikit seperti Fe, Cu, Zn, dan

Mo. (Hidayat N, dkk. 2006). Salah satu unsur yang sangat penting dalam media adalah

karbon. Secara umum sumber karbon yang optimal digunakan yaitu karbohidrat, hidrokarbon dan

minyak nabati. Beberapa organisme mengkonsumsi beberapa substrat, yang dikombinasi atau secara

(34)

BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1Alat dan Bahan

3.1.1 Alat-alat

1. Gelas beaker Pyrex

2. Gelas ukur Pyrex

3. Gelas erlenmeyer Pyrex

4. Neraca analitik Ohaus

5. Indikator universal Merck

6. Autoklaf Yamato SN210

7. Oven Gallenkamp

8. Tabung reaksi Pyrex

9. Inkubator Fisher Cientific

10.Hot plate Thermolyne

11.Termometer

12.Labu takar Pyrex

13.Cawan Petri Pyrex

14.Jarum Ose

15.Pipet serologi Pyrex

16.Pipet Volumetri Pyrex

17.Pipet man Gilson

18.Bunsen

19.Botol akuades

20.Statif dan klem Pyrex

21.Buret Pyrex

22.Vortex Fisons

(35)

24.Spektrometric Genesis 20 Simadzu

25.Shaker Kika HS 501

26.Sentrifugasi Hettich EBA 85

3.1.2 Bahan-Bahan 1. Minyak Wijen

2. Akuades

3. Starter Pseudomonas Aeruginosa

4. Tripton Soya Agar p.a.(E.Merck)

5. NH4NO3(s) p.a.(E.Merck)

6. CaCl2.2H2O (s) p.a.(E.Merck)

7. MgSO4.7H2O (s) p.a.(E.Merck)

8. K2HPO4 (p) p.a.(E.Merck)

9. KH2PO4 (s) p.a.(E.Merck)

10.Alkohol 96% Teknis 96% (Bratachem)

11.Alkohol 70% Teknis 70% (Bratachem)

12.Na2CO3 (s) p.a.(E.Merck)

13.NaOH (s) p.a.(E.Merck)

14.Kalium Natrium Tartrat (s) p.a.(E.Merck)

15.CuSO4.5H2O (s) p.a.(E.Merck)

16.Folin Ciocalteu (l) p.a.(E.Merck)

17.Bovine Serum Albumin p.a.(E.Merck)

18.HCl (s) p.a.(E.Merck)

19.KOH (s) p.a.(E.Merck)

20.BaCl2.2H2O (s) p.a.(E.Merck)

21.H2SO4 (l) p.a.(E.Merck)

(36)

3.2 Prosedur Penelitian

3.2.1 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.2.1.1 Pembuatan HCl 0,1 N

Dimasukkan 2 mL HCl p.a ke dalam labu takar labu takar 1000 mL kemudian

diencerkan dengan akuades hingga tanda batas setelah itu homogenkan.

3.2.1.2 Pembuatan larutan Na2CO3 2 %

Ditimbang 2 g Kristal Na2CO3, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar

100 mL; tuangkan akuades ¼ tabung dan homogenkan; tambahkan lagi

dengan akuades sampai tanda batas, homogenkan.

3.2.1.3 Pembuatan Buffer Phosfat 0,05 M untuk pH = 7 Dipakai rumus: 2 , 7 0 , 7 ] [ ] [ log 4 2 4 2 − = − HPO K PO KH ] [ ] [ log 2 , 7 0 , 7 4 2 4 2 HPO K PO KH − = ] [ ] [ log 4 2 4 2 HPO K PO KH pKa

pH = −

(37)

Gram garam = % garam x Molaritas x BM

= 38,68 % x 0,05 x 174

= 0,3868 x 0,05 x 174

= 3,3652 g/L

Gram asam = % Asam x Molaritas x BM

= 61,32 % x 0,05 x 136

= 0,6132 x 0,05 x 136

= 4,1698 g/L

(38)

3.2.1.4 Pembuatan larutan KOH 0,001 N a. Pembuatan larutan KOH 0,001 N

Ditimbang 0,056 g KOH dan dimasukkan ke dalam labu takar 250 ml,

kemudian dilarutkan dengan akuades hingga tanda batas setelah itu

dihomogenkan

b. Standarisasi larutan KOH 0,001 N dengan Asam Oksalat

Ditimbang dengan teliti 0,001 g asam okslat (BM=126), kemudian

dilarutkan ke dalam 25 mL aquadest dan ditambahkan 3 tetes indikatot

phenolphthalein kemudian dititrasi dengan larutan KOH yang akan

distandarisasi hingga warna merah rose. Hal yang sama dilakuan 3 kali

ulangan.

Perhitungan

(

)

(

0,126xmLKOH

)

2 x oksalat asam

g KOH larutan

N = (Sudarmaji, S. 1997)

3.2.1.5 Pembuatan larutan Magnesium Sulfat 0,02 %

Ditimbang 0.05 g MgSO4.7H2O(s), kemudian dimasukkan ke dalam labu takar

250 mL; tuangkan akuades ¼ tabung dan homogenkan; tambahkan lagi

dengan akuades sampai tanda batas, homogenkan kemudian disterilkan.

3.2.1.6 Pembuatan larutan Kalium Natrium Tartrat 1 %

Ditimbang 1 g Kalium Natrium Tartrat, kemudian dimasukkan ke dalam labu

takar 100 mL; tuangkan akuades ¼ tabung dan homogenkan; tambahkan lagi

dengan akuades sampai tanda batas, homogenkan.

3.2.1.7 Pembuatan pereaksi Lowry

a. Pembuatan larutan NaOH 0,1 N

Ditimbang dengan teliti 0,4 g NaOH dan dimasukkan ke dalam labu takar 100

mL, tuangkan akuades ¼ tabung dan homogenkan; tambahkan lagi dengan

akuades sampai tanda batas homogenkan.

b. Pembuatan pereaksi A

Larutan 2% Na2CO3 dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, diencerkan

(39)

c. Pembuatan pereaksi B

Ditimbang 0,5 g CuSO4.5H2O dan dilarutkan dengan larutan Kalium Natriun

Tartrat 1% dalam labu takar 100 mL hingga tanda batas setelah itu

dihomogenkan.

d. Pembuatan pereaksi C

Dicampurkan pereaksi C dan pereaksi A deengan perbandingan 1:50,

pereaksi ini harus dalam keadaan segar ketika akan digunakan untuk analisa.

e. Folin-Ciocalteu

Diencerkan pereaksi Folin-Ciocalteu dengan akuades dengan perbandingan

1:50 (Apriyantono. A, 1989)

3.2.1.8 Pembuatan larutan Bovine Serum Albumin (BSA) 5 mg/mL

Ditimbang dengan teliti 1,25 g BSA dan dimasukkan ke dalam labu takar 250

mL dan dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu

dihomogenkan.

3.2.1.9 Pembuatan Larutan standard BSA 1000 µg/mL

Dipipet 20 mL dari larutan induk BSA 5000 µg/mL dimasukkan ke dalam

labu takar 100 mL, dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu

dihomogenkan.

3.2.1.10 Pembuatan Larutan standard BSA 350 µg/mL

Dipipet 35 mL dari larutan standard BSA 1000 µg/mL dimasukkan ke dalam

dihomogenkan.

3.2.1.11 Pembuatan Larutan standard BSA 300 µg/mL

(40)

dihomogenkan.

dihomogenkan.

dihomogenkan.

3.2.1.15 Pembuatan Larutan standard BSA 100 µg/mL

dihomogenkan.

Dipipet 5 mL dari larutan standard BSA 1000 µ g/mL dimasukkan ke dalam

dihomogenkan.

3.2.2 Sterilisasi Alat

Dicuci alat-alat yang akan digunakan sampai bersih, kemudian dikeringkan

dan ditutup rapat dengan kapas setelah itu dibalut dengan kertas. Setelah itu

dimasukkan ke dalam oven. Disterilisasi sampai suhu 221oC dan

(41)

3.2.3 Pembuatan Media

3.2.3.1Pembuatan Media Tripton Soya Agar

Ditimbang 4 g tipton Soya Agar setelah itu dimasukkan ke dalam gelas

Erlenmeyer dan dilarutkan dengan 100 mL air laut, kemudian dipanaskan di

atas hot plate hingga larut dan warna larutan berubah menjadi bening, ditutup

dengan kapas dan alumunium foil.

3.2.3.2Pembuatan Media cair

Ditimbang 1,5 g NH4NO3 (s), 4,1698 g KH2PO4 (s) dan 3,3652 g K2HPO4 (s),

dimasukkan ke dalam Botol duran 500 mL, dan dipipet0,1 mL larutan MgSO4

0,02%, dilarutkan dengan akuades sampai garis batas, ditutup rapat, kemudian

distirer hingga larutan menjadi homogen.

3.2.3.3Pembuatan Media cair dengan penambahan Kofaktor enzim Ca2+

Ditimbang 7,5 g CaCl2.2H2O (s), 1,5 g NH4NO3 (s), 4,1698 g KH2PO4 (s) dan

3,3652 g K2HPO4 (s), dimasukkan ke dalam Botol duran 500 mL, dan dipipet

0,1 mL larutan MgSO4 0,02%, dilarutkan dengan akuades sampai garis batas,

ditutup rapat, kemudian di stirer hingga larutan menjadi homogen.

3.2.4 Sterilisasi Media dan Bahan

Dimasukkan +/- 1 L akudes ke dalam autoklaf, kemudian disusun media dan

bahan yang akan diterilkan pada keranjang alat dan dimasukkan ke dalam

autoklaf. Disterilkan pada suhu 121oC pada tekanan 15 Psi selama 15 menit

3.2.5 Pembuatan starter Pseudomonas Aeruginosa

Dimasukkan media tripton yang telah steril ke dalam cawan petri sebanyak ¼

volume cawan lalu diinokulasi biakan murni bakteri Pseudomonas Aeruginosa

ke dalam media tripton, yang dilakukan pada kondisi septik, selanjutnya

ditutup dengan alumunium foil dan klem-bab kemudian dibalut kertas setelah

itu diinkubasi dalam inkobator pada suhu 35oC selama 3-5 hari hingga

(42)

3.2.6 Pembuatan Standard Mac Varlan

Diukur 0,05 mL BaCl2 0,048 M dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi,

ditambahkan 9,95 mL H2SO4 0,35 N kemudian ditutup dengan alumunium foil

dan divortex. (Larlan,V, 1980)

3.2.7 Pembuatan Mac Varlan Bakteri Pseudomonas Aeruginosa

Dipipet 10 mL air suling steril ke dalam tabung reaksi. Diinokulasi bakteri

Pseudomonas Aeruginosa ke dalam tabung setelah itu divortex dan dilakukan

hal yang sama dalam kondisi septik hingga larutan bakteri sesuai dengan

standar Mac Varlan.

3.2.8 Penanaman bakteri pada media cair

Dipipet sebanyak 20 mL media cair dan dimasukkan ke dalam botol essence

50 mL, kemudian dimasukkan Sebanyak 2 mL larutan Mac Varlan dari bakteri

Pseudomonas Aeruginosa dan ditambahkan induser minyak wijen steril

dengan konsentrasi 2 % dalam kondisi septik, ditutup rapat botol dalam

keadaan terbungkus klem-bab. Dishaker media dengan kecepatan 150 rpm

pada suhu ruang selama 72 jam. Dilakukan prosedur yang sama untuk variasi

konsentrasi induser 4, 6, 8, dan 10%.

3.2.9 Penanaman bakteri pada media cair dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+

Dipipet sebanyak 20 mL media cair dengan kofaktor enzim Ca2+ dan

dimasukkan ke dalam botol essence 50 mL, kemudian dimasukkan Sebanyak 2

mL larutan Mac Varlan dari bakteri Pseudomonas Aeruginosa dan

ditambahkan induser minyak wijen steril dengan konsentrasi 2 % dalam

kondisi septik, ditutup rapat botol dalam keadaan terbungkus klem-bab.

Dishaker media dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang selama 72 jam.

Dilakukan prosedur yang sama untuk variasi konsentrasi induser 4, 6, 8, dan

(43)

3.2.10 Pembuatan Ekstrak Kasar Enzim Lipase

Dipipet sebanyak 10 mL media hasil penanaman berdasarkan masing-masing

konsentrasi induser dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian

disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit; didekantasi

supernatan yang terbentuk. Dan diuji kadar protein dan aktivitasnya.

3.3 Parameter yang Diamati

3.3.1 Penentuan absorbansi maksimum larutan Bovine Serum Albumin 5000µg/mL

Dipipet 1 mL larutan larutan BSA 5000 µg/mL dan dimasukkan ke dalam

tabung reaksi. Ditambahkan 6 mL pereaksi C Lowry dikocok dan dibiarkan

selama 10 menit pada suhu kamar. Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan

Folin-Ciocalteu, dikocok dan dibiarkan selama 30 menit. Diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 730 – 780 nm untuk menetukan

panjang gelombang dengan absorbansi maksimum. Grafik hasil absorbansi

dapat dilihat pada hasil penelitian (halaman 36-37)

3.3.2 Penentuan Kurva standard larutan Bovine Serum Albumin

Dipipet 1 mL larutan larutan dari masing-masing larutan BSA dengan

konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 µg/mL dan masing-masing

dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dtambahkan 6 mL pereaksi C Lowry

dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Selanjutnya

ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu, dikocok dan dibiarkan selama 30

menit. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 775 nm kemudian

dibuat kurva standarnya.

3.3.3 Penentuan Kadar Protein Ekstrak Kasar Enzim Lipase Ekstraseluler

Pseudomonas Aeruginosa

Dipipet 1 mL larutan enzim dari masing-masing supernatant tiap-tiap

perlakuan dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 6 mL

pereaksi C Lowry dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar.

Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu, dikocok dan

(44)

775 nm. Dihitung kadar protein dengan menggunakan kurva standar (Boyer,

1993).

3.3.4 Penentuan kadar Asam Lemak Bebas

Ditimbang sampel minyak wijen seberat 2,5 g, dimasukkan ke dalam

Erlenmeyer, ditambahkan 1 mL ekstrak kasar enzim lipase dan ditambahkan

25 mL Alkohol 96%, ditutup dengan plastic dan karet dan dipanaskan hingga

mendidih kemudian didinginkan. Ditambahkan 3 tetes indicator Penolftalein.

Kemudian dititrasi dengan larutan KOH 0,001 N hingga terjadi perubahan

warna dari bening menjadi merah rose dan dicatat volume KOH 0,001 N yang

(45)

3.4 Skema Penelitian

3.4.1 Skema Pembuatan Media

3.4.1.1 Skema Pembuatan Media Tripton

Dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer 250 mL

Ditambahkan 100 mL air laut

Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih

Didinginkan

Ditutup dengan kapas dan alumunium foil

Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC dan

tekanan 15 Psi selama 15 menit. 4 g Tripton Soya Agar (s)

(46)

3.4.1.2 Skema Pembuatan Media Cair

Dimasukkan ke dalam botol duran 500 mL

Ditambahkan 0,1 g MgSO4.7H2O (s)

Ditambahkan 4,1698 g KH2PO4 (s)

Ditambahkan 3,3652 g K2HPO4 (s)

Ditambahkan 500 mL akuades

Dimasukkan stirrer dan Ditutup rapat

tekanan 15 Psi selama 15 menit

3.4.1.3 Skema Pembuatan Media Cair dengan penambahan Kofaktor enzim Ca2+

Dimasukkan ke dalam botol duran 500 mL

Ditambahkan 7,5 g CaCl2.2H2O (s),

Ditambahkan 0,1 g MgSO4.7H2O (s)

Ditambahkan 4,1698 g KH2PO4 (s)

Ditambahkan 3,3652 g K2HPO4 (s)

Ditambahkan 500 mL akuades

Dimasukkan stirrer dan Ditutup rapat

tekanan 15 Psi selama 15 menit. 1,5 g NH4NO3 (s)

Hasil 1,5 g NH4NO3 (s)

(47)

3.4.2 Skema Pembuatan starter Pseudomonas Aeruginosa

Disterilkan didalam autoklaf

Dimasukkan ke dalam cawan petri sebanyak ¼

volume cawan

Diinokulasi biakan murni bakteri Pseudomonas

Aeruginosa ke dalam media tripton.

Ditutup dengan alumunium foil dan klem-bab

lalu dibalut kertas

Diinkubasi dalam inkobator pada suhu 35oC

selama 4-5 hari Media Triptonl (l)

(48)

3.4.3 Skema Penanaman media untuk menghasilkan ekstrak kasar enzim 3.4.3.1 Skema Penanaman bakter pada media cair

Dipipet sebanyak 20 mL Dipipet sebanyak 2 mL

Ditambahkan induser minyak wijen

dengan variasi 2%, 4%, 6%, 8%, 10%.

Ditutup rapat dan dibungkus klem-bab

Dishaker dengan kecepatan 150 rpm

pada suhu 25oC selama 72 jam

Disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm

selama 20 menit

Didekantasi supernatan yang terbentuk.

Dibagi dua

Diukur kadar protein Diuji aktivitasnya dengan

Dengan menggunakan penentuan kadar Asam

Spektrofotomoter UV-Visible Lemak Bebas Media cair (l) Larutan Mac Varlan Bakteri

Pseudomonas Aeruginosa (l)

Ekstrak kasar Enzim Lipase

Campuran Ekstrak dan Media

Hasil 1 mL Ekstrak

kasar enzim

Larutan Media bakteri

1 mL Ekstrak kasar enzim

Endapan sel bakteri

(49)

3.4.3.2 Skema Penanaman bakteri pada media cair dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+

Dipipet sebanyak 20 mL Dipipet sebanyak 2 mL

Ditambahkan induser minyak wijen

dengan variasi 2%, 4%, 6%, 8%, 10%.

Ditutup rapat dan dibungkus klem-bab

Dishaker dengan kecepatan 150 rpm

pada suhu 25oC selama 72 jam

Disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm

selama 20 menit

Didekantasi supernatan yang terbentuk.

Dibagi dua

Diukur kadar protein Diuji aktivitasnya dengan

Dengan menggunakan penentuan kadar Asam

Spektrofotomoter UV-Visible Lemak Bebas Media cair dengan

kofaktor enzim

2+

Larutan Mac Varlan Bakteri Pseudomonas Aeruginosa (l)

Ekstrak kasar Enzim Lipase

Campuran Ekstrak dan Media

Hasil 1 mL Ekstrak

kasar enzim

Larutan Media bakteri

1 mL Ekstrak kasar enzim

Endapan sel bakteri

(50)

3.4.4 Skema Parameter yang diamati

3.4.4.1 Skema Penentuan absorbansi maksimum larutan BSA 5000µg/mL

Diukur sebanyak 1 mL

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi

Ditambahkan 6 mL pereaksi C Lowry

Dikocok dan dibiarkan selama 10 menit

pada suhu kamar

Ditambahkan 0,5 mL larutan

Folin-Ciocalteu

Diukur absorbansi maksimumnya pada

panjang gelombang 730 – 780 nm

3.4.4.2 Skema Penentuan Kurva standard larutan Bovine Serum Albumin

Diukur masing-masing sebanyak 1 mL

pada suhu kamar

Folin-Ciocalteu

Diukur absorbansi pada panjang

gelombang 775 nm Larutan BSA 5000µg/mL

Hasil

Larutan BSA konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 µg/mL

(51)

3.4.4.3 Skema Penentuan Kadar Protein Ekstrak Kasar Enzim Lipase Ekstraseluler Pseudomonas Aeruginosa

Diukur masing-masing sebanyak 1 mL

pada suhu kamar

Folin-Ciocalteu

Diukur absorbansi pada panjang

gelombang 775 nm

Dihitung kadar protein dengan

menggunakan kurva standar Supernatan enzim lipase

(52)

3.4.4.4 Skema Penentuan Kadar Asam Lemak Bebas

Dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer

Ditambahkan 1 mL ekstrak kasar enzim

lipase

Ditambahkan 25 mL Alkohol 96%

Ditutup dengan pelastik dan karet

Dipanaskan hingga mendidih dan

didinginlan

Ditambahkan 3 tetes indicator PP

Dititrasi dengan KOH 0,001 N sampai

terjadi perubahan warna dari bening

menjadi merah rose.

Dihitung volume KOH yang terpakai 2,5 g minyak wijen

(53)

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

Dari hasil penelitian tentang produksi enzim lipase oleh Pseudomonas aeruginosa

dalam menghasilkan ekstrak kasar enzim lipase dilakukan beberapa penentuan

4.1.1. Penentuan panjang gelombang maksimum larutan BSA

Terhadap 1 mL larutan BSA 5000 µg/mL dengan metode lowry diukur absorbansinya

pada panjang gelombang 720 – 780 nm. Hasilnya menunjukkan bahwa absorbansi

[image:53.595.166.469.506.771.2]

maksimum diperoleh pada λ 775 nm. Hasil lengkapnya adalah sebagai berikut :

(54)

(55)

4.1.2. Penentuan kurva standar larutan BSA pada λ 775 nm

Larutan BSA dengan konsentrasi bertingkat diukur absorbansinya pada panjang

[image:55.595.106.540.231.418.2]

gelombang 775 nm. Hasilnya sebagai berikut :

Tabel 4.1.2. Absorbansi larutan BSA pada λ 775 nm

Konsentrasi BSA (μgg/mL) (x)

Absorbansi (y)

50 0,067

100 0,070

150 0,075

200 0,073

250 0,074

300 0,074

350 0,087

Dengan menggunakan rumus persamaan garis regresi y = ax + b diperoleh

nilai

y = 0,00004(x) + 0,065 (Lampiran 1), dimana x adalah kadar ekstrak kasar enzim lipase dengan tetapan a (slope grafik) dan b (intercept) yang diperoleh dari:

( ) ( )( )

( )

₂

( )

2

∑

− − = x x n y x xy n a

( )( ) ( )( )

( ) ( )

₂ 2 2

∑

− − = x x n xy x y x b

4.1.3 Penentuan kadar protein enzim lipase dari Pseudomonas aeruginosa

Terhadap supernatant dari biakan Pseudomonas aeruginosa yang ditumbuhkan pada

media dengan konsentrasi minyak wijen yang berbeda maka didapat masing – masing

(56)

hasil kadar enzim dengan menggunakan persamaan garis regresi y = 0.00004 (x) +

0.065 yaitu sebagai berikut :

[image:56.595.97.537.210.359.2]

Tabel 4.1.3 Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 %.

Perlakuan

Kadar protein Enzim (μg/mL) Konsentrasi

2 % 4 % 6 % 8 % 10 %

Perulangan I 10550 27700 47825 67025 60375

Perulangan II 3550 4950 5800 7752 6250

Perulangan III 4000 4225 5875 16250 11550

Rata-rata 6033,33 12291,67 19833,33 30342,33 26058,33

4.1.4 Penentuan kadar protein enzim lipase dengan penambahan Ca2+

Pada media biakan yang ditumbuhi Pseudomonas aeruginosa ditambahkan ion Ca2+

sebagai Kofaktor enzim dengan konsentrasi 1.5% pada setiap setiap konsentrasi

substrat yang berbeda, yang pengukuran absorbansinya pada setiap konsentrasi dapat

dilihat pada (lampiran III) sehingga diperoleh hasil kadar enzim dengan menggunakan

persamaan garis regresi sebagai berikut :

Tabel 4.1.4 Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 % dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+.

(57)

Konsentrasi substrat

2 % 4 % 6 % 8 % 10 %

Perulangan I 5400 5825 29800 35550 55775

Perulangan II 3900 3850 5800 6075 11875

Perulangan III 4775 4850 5025 5225 5525

Rata-rata 4691,67 4841,67 13541,67 15616,67 24391,67

4.1.5. Uji aktivitas

Uji aktivitas terhadap ekstrak kasar enzim lipase dilakukan untuk mengetahui aktivitas

enzim dalam menggunakan asam lemak pada minyak normal. Pengukuran kadar ALB

(%) dilakukan dengan metode titrimetri dengan titran KOH. Uji aktivitas pada ekstrak

kasar enzim lipase tersebut diukur berdasarkan perbedaan kadar asam lemak bebas

dengan menggunakan: % 100 1000 × ×× × = Sampel Berat ALB BM KOH mL KOH N ALB Kadar

N KOH merupakan normalitas KOH yang digunakan ( 0,001 N)

Volume KOH adalah volume hasil titrasi

BM ALB adalah berat molekul ALB yang dihitung sebagai Oleat (Mr = 282)

Berat sampel merupakan berat dari minyak wijen yang diukur kadar ALB-nya, dan

penentuan aktivitas dalam unit dinyatakan dengan,

[image:57.595.98.537.85.215.2]

sehingga diperoleh hasil sebagai berikut :

Tabel 4.1.5.1. Aktivitas ekstrak kasar Enzim Lipase

Sampel Ekstrak kasar Enzim (%) Berat Wijen (gram) Volume KOH (mL)

Rata - rata

Kadar ALB

(g ALB/g Minyak)

%

Unit

x 10-4

(µmol/menit)

I II III

(58)

Untuk uji aktivitas pada ekstrak kasar enzim lipase yang menggunakan kofaktor

enzim Ca2+ diukur dengan cara yang sama yatu berdasarkan perbedaan kadar asam

lemak bebas pada minyak wijen setelah penambahan enzim lipase yang mengandung

[image:58.595.80.550.84.192.2]

kofaktor enzim Ca2+ sehingga diperoleh hasil sebagai berikut :

Tabel 4.1.5.2. Aktivitas ekstrak kasar Enzim Lipase dengan menggunakan kofaktor enzim Ca2+

Ekstrak

kasar Enzim

(%)

Berat Wijen

(gram)

Volume KOH (mL)

Rata -

rata

Kadar ALB

(g ALB/g Minyak)

%

Unit

x 10-4

µmol/menit

I II III

2 2,5 6,8 6,9 6,5 6,73 0,0759 6,23

4 2,5 7,5 7,6 7,5 7,57 0,0854 7,01

6 2,5 7,5 7,6 7,6 7,57 0,0854 7,01

8 2,5 9,6 9,8 9,6 9,67 0,1091 8,96

10 2,5 12,6 12,8 12,2 12,53 0,1413 11,60

4.2. Pembahasan Hasil Penelitian

Grafik berikut memperlihatkan hubungan antara hasil ekskresi enzim oleh

Pseudomonas aeruginosa dengan penambahan substrat dengan konsentrasi yang

berbeda dan perbedaan kadar enzim pada masing – masing perlakuan dapat dilihat

pada grafik dibawah ini.

2 2,5 8,2 8,3 8,9 8,5 0,0959 7,87

4 2,5 9,2 8,7 9,0 8,9 0,1004 8,24

6 2,5 8,8 8,9 9,1 8,9 0,1004 8,24

8 2,5 9,5 9,8 9,0 9,1 0,1026 8,42

10 2,5 8,8 8,7 8,8 8,8 0,0992 8,14

550 950 800 752 250 000 225 875 16250 550 550 700 825 67025 60375₆₀₀₀₀ 70000 80000 12000 14000 16000 18000 ( μ g /m L)