Optimasi Produksi Lipase Aktinomiset Endofit Asal Tanaman Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.)

(1)

OPTIMASI PRODUKSI LIPASE AKTINOMISET ENDOFIT ASAL

TANAMAN JATI BELANDA (

Guazuma ulmifolia

Lamk.)

EKA NURHASANNUDIN

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

ABSTRAK

EKA NURHASANNUDIN. Optimasi Produksi Lipase Aktinomiset Endofit Asal Tanaman Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.). Dibawah bimbingan YULIN LESTARI dan SRI BUDIARTI.

Aktinomiset endofit asal tanaman jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) berhasil diisolasi dan terbukti memiliki aktivitas lipase. Optimasi produksi lipase aktinomiset endofit belum dikaji, sedangkan informasi ilmiah tersebut diperlukan untuk pengembangan potensinya lebih lanjut. Tujuan penelitian ini adalah mengoptimasi cara produksi lipase aktinomiset endofit asal tanaman jati belanda. Kedua isolat AJB 4(1) dan AJB 4(4) diremajakan pada media Yeast Starch Agar (YSA) dan Oatmeal Agar (OA). Kedua isolat dilakukan esei aktivitas lipase pada media YSA yang mengandung 3% minyak zaitun dan 2 mL 0.1% pewarna Rhodamine B. Optimasi pertama dilakukan terhadap biomassa aktinomiset endofit terhadap suhu dan waktu inkubasi. Optimasi kedua dilakukan terhadap 3 macam substrat, yaitu extra virgin oil, minyak zaitun, dan palm oil serta dilakukan karakterisasi lipase dengan menambahkan senyawa aktivator dan inhibitor. Isolat AJB 4(4) memiliki aktivitas lipase berdasarkan zona berpendar orange yang dihasilkan pada media Rhodamine B. Biomassa isolat AJB 4(4) terbesar yaitu sebesar 0.3757 g didapat pada waktu inkubasi 15 hari pada suhu ruang (25oC-28oC). Pengukuran aktivitas spesifik menggunakan substrat extra virgin oil pada inkubasi 15 hari dan suhu ruang menunjukkan hasil terbesar yaitu 4.7428 unit/mg dibandingkan substrat minyak zaitun dan palm oil sebesar 1.059 unit/mg dan 2.329 unit/mg. Hasil karakterisasi aktivitas lipase menunjukkan bahwa penambahan ion Na+ dan Zn2+ sebesar 1 mM serta 5 mM dapat meningkatkan aktivitasnya. Penelitian ini memberikan informasi bahwa optimasi produksi lipase dapat meningkatkan aktivitas lipase hingga 3 kali lipat.

Kata kunci: Aktinomiset endofit, jati belanda, optimasi, aktivitas lipase.

ABSTRACT

EKA NURHASANNUDIN. Optimization of the Production of Lipase of Endophytic Actinomycetes from Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) Under the direction of YULIN LESTARI and SRI BUDIARTI.

Endophytic actinomycetes originated from jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) have been isolated and proven to have lipase activity. Optimization of lipase production from endophytic actinomycetes has not been studied, while its scientific information is required for further potential development. The purpose of this study was to optimize the production of lipase from endophytic actinomycetes originated from jati belanda plant. Both AJB 4(1) and AJB 4(4) were grown in Yeast Starch Agar (YSA) and Oatmeal Agar (OA) media. Both isolates were then grown on YSA media containing 3% olive oil and 2 ml of 0.1% dye Rhodamine B and then assayed for lipase activity. The first optimization was conducted for endophytic actinomycetes biomass production in response to temperature and time of incubation. The second optimization was done to examine three kinds of substrates, e.g. extra virgin oil, olive oil, and palm oil. Characterization of lipase activity was done by examining the effect of adding lipase activator and inhibitor compounds. AJB isolates 4(4) showed a lipase activity based on fluorescent orange zone that was produced on media Rhodamine B. AJB 4(4) produced the greatest biomass (0.3757 g) at 15 days of incubation at room temperature (25oC-28oC). Meanwhile, the highest specific lipase activity (4.743 units/mg) was obtained using extra virgin oil as substrate after 15 days incubation at room temperature compared with the result obtained using olive oil and palm oil substrate (1.059 units/mg and 2.329 units/mg). The addition of Na+ ions and Zn2+ at 1 mM and 5 mM repectively could increase lipase activity. This study provides information that optimization can increase the lipase activity by 3-fold.

(3)

OPTIMASI PRODUKSI LIPASE AKTINOMISET ENDOFIT ASAL

Guazuma ulmifolia

Lamk.)

EKA NURHASANNUDIN

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

(4)

Judul Skripsi : Optimasi Produksi Lipase Aktinomiset Endofit Asal Tanaman

Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.)

Nama

: Eka Nurhasannudin

NIM

:

G34070060

Disetujui

Pembimbing I, Pembimbing II,

Dr. Ir. Yulin Lestari Dr. dr. Sri Budiarti

NIP 19620710 198803 2 002 NIP 19580813 199303 2 001

Diketahui

Ketua Departemen Biologi

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.

NIP 19641002 198903 1 002

(5)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Optimasi Produksi Lipase Aktinomiset Endofit Asal Tanaman Jati Belanda (Guazuma Ulmifolia Lamk.)” ini dilakukan mulai Februari 2011 sampai dengan November 2011 di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Institut Pertanian Bogor (IPB) serta laboratorium Balai Penelitian Tanah, Litbang Pertanian Bogor.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Yulin Lestari dan Dr. dr. Sri Budiarti atas bimbingan, pengarahan, saran, motivasi, dan dana yang diberikan selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Demikian pula kepada Dr. Ir. R. R. Dyah Perwitasari, M.Sc. sebagai dosen penguji dan wakil komisi pendidikan atas komentar dan saran yang diberikan. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada keluarga tercinta yang senantiasa memberi doa dan dukungan. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Jaka, Ibu Henny, Bapak Puji, Mba Yessy, Mbak Icha, Kak Sari, Tera, dan Bang Joe di laboratorium Mikrobiologi Biologi IPB serta Ibu Ratih di laboratorium Balai Penelitian Tanah, Litbang Pertanian Bogor atas segala bantuan dan saran selama melakukan penelitian ini. Terima kasih juga kepada Anggi, Gesti, Soraya (pasukan Lestari), Diyah, Ikra, Nia, Susan, Lida, Gisa, Ari, Faisal, Adi, dan seluruh teman-teman biologi khususnya angkatan 44 yang telah memberi bantuan dan semangat.

Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, April 2012

(6)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 20 Mei 1989 dari pasangan C. Ade Lesmana dan Nurwendah Rachmawati. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar dan menengah di SDN Serua X pada tahun 2001, SMPN 2 Pamulang pada tahun 2004, dan SMAN 1 Ciputat pada tahun 2007. Setelah itu, penulis melanjutkan pendidikan tinggi pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).

Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Biologi Dasar pada tahun 2010/2011-2011/2012. Penulis juga pernah aktif dalam Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) sebagai anggota Pengembangan Sumber Daya Manusia (PSDM) tahun 2008/2009. Beberapa kepanitiaan juga pernah diikuti, yaitu koordinator logistik dan transportasi Biologi Interaktif tahun 2009 dan International Scholarship and Education Expo (ISEE) tahun 2010, serta berpartisipasi dalam kepanitiaan simposium internasional Globalization of Jamu Brand Indonesia sebagai anggota koordinator transportasi. Penulis mempunyai prestasi non-akademik, juara III Lari 4x400 M putra pada Pekan Atletik TPB tahun 2008, juara III futsal pada Olimpiade Mahasiswa IPB (OMI) tahun 2008, juara I estafet 4x400 putra pada OMI tahun 2009, dan juara I futsal dalam Goblet of Biotech di Universitas Atma Jaya Jakarta Tahun 2011.

(7)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... vi

DAFTAR GAMBAR ... vi

DAFTAR LAMPIRAN ... vi

PENDAHULUAN Latar Belakang ... 1

Tujuan Penelitian ... 2

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ... 2

Bahan ... 2

Peremajaan Isolat Aktinomiset Endofit ... 2

Esei Aktivitas Lipase Aktinomiset Endofit ... 2

Optimasi Produksi Lipase Aktinomiset Endofit... . ... 2

Pengukuran Aktivitas Lipase dan Kadar Protein ... 2

Pengukuran Aktivitas Spesifik Lipase ... 3

Karakterisasi Lipase ... 3

HASIL Pertumbuhan Isolat Aktinomiset Endofit ... 3

Aktivitas Lipase Aktinomiset Endofit ... 4

Produksi Optimum Lipase Aktinomiset Endofit ... 4

Pengaruh Penambahan Kation Terhadap Aktivitas Lipase ... 4

PEMBAHASAN ... 5

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ... 7

Saran ... 7

DAFTAR PUSTAKA ... 8

(8)

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Produksi biomassa (g) isolat AJB 4(4) pada media Yeast Malt Broth (YMB) selama 20 hari inkubasi pada suhu ruang dan 30oC ... 4

2 Aktivitas spesifik lipase isolat AJB 4(4) ... 5

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Morfologi koloni isolat aktinomiset endofit umur 21 hari pada media OA dan YSA (a) AJB 4(1) pada mediaA, (b) AJB 4(1) pada media YSA, (c) AJB 4(4) pada media OA, dan (d) AJB 4(4) pada media YSA ... 3

2 Morfologi mikroskopis rantai spora (a) isolat AJB 4(4) dan (b) isolat AJB 4(1) (400x) ... 3

3 Lipase tipe VII (1000 ppm) (a) dan isolat AJB 4(4) (b) memperlihatkan aktivitas lipase, sedangkan AJB 4(1) (c) tidak memperlihatkan aktivitas lipase pada media penapisan agar Rhodamine B ... 3 4 Kurva pertumbuhan biomassa sel dan aktivitas lipase isolat AJB 4(4) pada inkubasi suhu ruang

selama 20 hari ... 5

5 Pengaruh penambahan kation logam terhadap aktivitas lipase isolat AJB 4(4) ... 5

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Komposisi media yang digunakan (per 1 liter) ... 12

2 Kurva standar asam margarat (asam heptadekanoat) ... 12

(9)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Penggunaan enzim dalam bioteknologi semakin berkembang secara cepat. Banyak industri yang telah memanfaatkan kerja enzim, salah satunya adalah enzim lipase. Enzim lipase (triacyglycerol hydrolase, EC 3.1.1.3) dapat menghidrolisis senyawa triacyglycerol menjadi asam lemak dan acyglycerol (Litthaeur et al. 2002). Enzim tersebut juga berperan dalam metabolisme lipoprotein dalam darah dengan menghidrolisis trigliserida dan fosfolipid yang terdapat pada kilomikron, IDL (Intermediate Density Lipoprotein) dan HDL (High Density Lipoprotein) (Dugi et al. 2000).

Sumber lipase dapat diperoleh dari berbagai jenis mikrob seperti fungi dan bakteri. Jenis fungi yang potensial penghasil lipase adalah Geotricum spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., dan Candida spp, sedangkan jenis bakteri yang potensial sebagai penghasil lipase adalah Pseudomonas spp., Achromobacter spp., Staphylococcus spp., dan Streptomyces spp. (Ghost et al. 1996). Enzim yang berasal dari mikrob tersebut secara komersial banyak digunakan dalam industri farmasi, makanan, detergen serta kesehatan.

Tanaman jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) dapat bermanfaat sebagai pelangsing tubuh, sehingga ekstrak tanaman ini banyak digunakan di dalam ramuan tradisional jamu pelangsing. Penelitian dari tanaman jati belanda menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun jati belanda yang mengandung alkaloid, triterpenoid, dan steroid secara in vitro mampu menghambat aktivitas lipase yang diisolasi dari Rhizopus arrhizus (Iswantini et al. 2003). Menurut Rahardjo et al. (2005) ekstrak etanol daun jati belanda secara in vivo mampu menghambat aktivitas lipase serum Rattus norvegitus. Lestari & Muhtadi (1997) menyatakan, pemberian ekstrak etanol daun jati belanda sebanyak 1g/kg bobot badan pada tikus hiperlipidemia mampu menurunkan kadar kolesterolnya.

Cara inovatif untuk mengefisienkan sumber senyawa bioaktif adalah dengan memanfaatkan mikrob endofit yang berasosiasi dengan tanaman obat tersebut. Menurut Strobel & Daisy (2003) berbagai jenis senyawa bioaktif dengan beragam fungsi yang terkandung di dalam tumbuhan,

diduga dapat pula dihasilkan oleh mikrob endofit pada tumbuhan tersebut. Lu et al. (2000) melaporkan bahwa Colletotrichum sp. merupakan mikrob endofit pada tanaman Artemisia annua yang dipercaya masyarakat sebagai obat malaria ternyata menghasilkan metabolit artemisinin yang sangat potensial sebagai anti malaria. Castilo et al. (2002) telah membuktikan bahwa tanaman Snakevine (Kennedia nigrisca) yang digunakan untuk mengobati luka dan infeksi yang ternyata mengandung mikrob endofit Streptomyces sp. strain NRRL 30562. Aktinomiset endofit asal tanaman pegagan (Centella asiatica) dan belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) terbukti menghasilkan senyawa inhibitor ACE yang berperan sebagai antihipertensi (Sari 2011). Aktinomiset endofit juga memiliki kemampuan dalam menghasilkan asam indol asetat (IAA) yang mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman padi (Yusepi 2011).

Streptomyces toxytricini mampu

menghasilkan senyawa lipstatin sebagai senyawa antihiperlipidemia yang bekerja sebagai inhibitor enzim pankreatik lipase (Weibel et al. 1987). Adanya kemampuan mikrob endofit menghasilkan senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya, merupakan peluang yang dapat dioptimalkan untuk memproduksi metabolit sekunder secara efisien dan cepat.

Aktinomiset merupakan bakteri Gram positif berfilamen dan dapat berperan sebagai penghasil beragam senyawa bioaktif yang dapat berfungsi antara lain sebagai antibiotik, enzim inhibitor, dan senyawa bioaktif lainnya (Lestari 2006). Menurut Raja dan Prabakarana (2011) aktinomiset dikenal sebagai penghasil antibiotik terbesar, karena dari 16.500 antibiotik yang telah ditemukan, lebih dari setengahnya dihasilkan oleh aktinomiset.

(10)

potensinya lebih lanjut. Oleh karena itu kajian tentang optimasi produksi lipase aktinomiset endofit asal tanaman jati belanda sangat penting untuk dilakukan.

Tujuan Penelitian

Mengoptimasi produksi lipase aktinomiset endofit asal tanaman jati belanda.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari hingga November 2011 di laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA-IPB serta laboratorium Balai Penelitian Tanah, Litbang Pertanian Bogor.

Bahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini ialah isolat aktinomiset endofit AJB 4(1) dan AJB 4(4) yang berasal dari koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, media Oatmeal Agar (OA), Yeast Starch Agar (YSA), Yeast Malt Broth (YMB) (Lampiran 1), dan media Rhodamine B, antibiotik asam nalidiksat (20 mg/mL) dan sikloheksamida (50 mg/mL), lipase tipe VII dari Candida rugosa (Sigma Chemical Co), beberapa senyawa aktivator dan inhibitor seperti Co2+, Cu2+, Na+, Zn2+, dan EDTA serta modifikasi media untuk produksi enzim dengan penambahan substrat minyak zaitun, extra olive oil, dan palm oil (Bertolli 8.5 Fl oz).

Peremajaan isolat aktinomiset endofit

Isolat aktinomiset endofit AJB 4(1) dan AJB 4(4) diremajakan dengan cara menumbuhkan koloni pada media OA dan YSA. Isolat diinkubasi pada suhu ruang (25-28oC) selama 21 hari.

Esei aktivitas lipase aktinomiset endofit

Aktinomiset endofit AJB 4(1) dan AJB 4(4) hasil peremajaan diinokulasikan pada media YSA yang mengandung 3% minyak zaitun dan 2 mL 0.1% pewarna Rhodamine B yang telah disterilisasi menggunakan milipore (Swannex) 0.2 µm (Kouker & Jaeger 1987), kemudian isolat aktinomiset endofit diinkubasi pada suhu 25oC selama 120 jam. Lipase tipe VII dari Candida rugosa digunakan sebagai kontrol positif aktivitas lipase. Aktivitas lipase pada media penapisan dapat dideteksi di bawah sinar UV sebagai zona berpendar berwarna orange.

Optimasi produksi lipase aktinomiset endofit

Optimasi tahap I:

Optimasi pertama dilakukan terhadap biomassa sel pada beragam waktu inkubasi dan suhu. Sebanyak 3 disc agar (Ф 8 mm) isolat aktinomiset endofit dikulturkan ke dalam 50 ml YMB. Kultur diinkubasi pada inkubator bergoyang pada suhu ruang, 30oC, 40oC, dan 50oC dengan kondisi aerasi 150 rpm selama 20 hari. Pada hari ke 5, 10, 15, dan 20 dilakukan pengambilan kultur sel dan disentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit kemudian dilakukan pengukuran bobot kering biomassa aktinomiset endofit.

Optimasi tahap II:

Optimasi kedua dilakukan terhadap aktivitas lipase dengan beragam substrat. Isolat aktinomiset endofit diinokulasikan pada 50 mL media YMB kemudian kultur starter diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Kultur starter dimasukkan ke dalam media produksi yang mengandung (per 100 mL) substrat 1% minyak zaitun, 1% extra virgin oil, dan 1% palm oil yang masing-masing substrat ditambahkan 0.02% CaCl2.

2H2O, 0.01% MgSO4. 7H2O, dan 0.04%

FeCl3. 6H2O (Eltaweel et al. 2005). Inkubasi

dilakukan pada inkubator bergoyang pada suhu ruang dengan kondisi aerasi 150 rpm selama 15 hari. Pada hari ke 15 dilakukan pengambilan kultur sel dan disentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh mengandung enzim lipase ekstrak kasar yang kemudian diukur aktivitas spesifik dan kadar proteinnya.

Pengukuran aktivitas lipase

Enzim ekstrak kasar diukur aktivitas lipasenya dengan menggunakan metode Kwon & Rhee (1986). Satu mL enzim ekstrak kasar dicampurkan ke dalam larutan yang mengandung 2.5 mL minyak zaitun + 0.005 M buffer fosfat (1:1) dan 20 µL CaCl2,

(11)

4

Aktivitas lipase aktinomiset endofit

Pengukuran aktivitas lipase dilakukan untuk mengetahui kemampuan aktinomiset endofit uji dalam menghasilkan lipase. Isolat AJB 4(4) memiliki aktivitas lipase yang diindikasikan dengan adanya pendaran orange pada media agar Rhodamine B saat penyinaran UV. Kontrol positif menggunakan lipase tipe VII menghasilkan pendaran orange yang sangat terang,dan diameter yang besar hal ini dikarenakan sudah dalam kondisi enzim murni, berbeda dengan lipase AJB 4(4) yang masih merupakan enzim ekstrak kasar. Isolat AJB 4(1) (kontrol negatif) tidak memilki aktivitas lipase karena tidak menghasilkan pendaran orange saat disinari sinar UV. (Gambar 3).

Produksi optimum lipase aktinomiset endofit

Tabel 1 Produksi biomassa (g) isolat AJB 4(4) pada media Yeast Malt Broth (YMB) selama 20 hari inkubasi pada suhu ruang dan 30oC

Hari Ke- Biomassa (g) Suhu Ruang Suhu 30oC 5 10 0.3180c 0.3529ab 0.2858a 0.3105a 15 20 0.3757a 0.3374bc 0.3400a 0.3222a Keterangan: Angka-angka yang diikuti huruf

yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan taraf nyata 5%

Optimasi dilakukan selama 20 hari dan setiap 5, 10, 15, dan 20 hari dilakukan pengukuran biomassa kering. Hasil pengukuran biomassa menunjukkan bahwa bobot terbesar didapatkan pada waktu inkubasi 15 hari dan suhu ruang sebesar 0.3757 g (Tabel 1), sedangkan pada suhu 40oC dan 50oC isolat AJB 4(4) tidak dapat tumbuh. Telah maksimalnya biomassa isolat pada hari panen 15 hari menunjukkan pertumbuhan isolat tersebut sudah mencapai tahap optimum. Isolat AJB 4(4) kemudian mengalami penurunan pertumbuhan pada hari selanjutnya kemungkinan karena persaingan antar sel aktinomiset, berkurangnya nutrisi pada media, dan dihasilkannya metabolit sekunder yang kemungkinan dapat berperan sebagai inhibitor.

Optimasi terhadap substrat dilakukan dengan menggunakan 3 macam substrat, yaitu minyak zaitun, extra virgin oil, dan palm oil. Isolat AJB 4(4) ditumbuhkan pada media produksi dengan menambahkan ketiga jenis substrat tersebut sebagai pendekatan kajian hidrolisis lipid isolat AJB 4(4). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ketiga substrat tersebut mampu dihidrolisis oleh isolat AJB 4(4). Aktivitas lipase tertinggi dihasilkan pada substrat extra virgin oil sebesar 0.083 unit/mL. Aktivitas lipase yang diperoleh masih dalam enzim ekstrak kasar, oleh karena itu dilakukan pengukuran kadar potein untuk mendapatkan aktivitas spesifik lipase. Kadar protein tertinggi didapatkan pada penggunaan substrat minyak zaitun sebesar 0.0373 mL/mg. Berdasarkan aktivitas lipase dan kadar proteinnya maka aktivitas spesifik lipase tertinggi dihasilkan dengan menggunakan substrat extra virgin oil sebesar 4.743 unit/mg, sedangkan pada substrat minyak zaitun dan palm oil masing-masing sebesar 1.059 unit/mg dan 2.329 unit/mg (Tabel 2).

Pengukuran aktivitas lipase isolat AJB 4(4) dilakukan setiap 5 hari sekali selama 20 hari pada kondisi optimum produksi biomassa. Aktivitas lipase tertinggi diperoleh pada hari ke-15 sebesar 0.0865 unit/mg protein (Gambar 4). Aktivitas lipase menurun pada hari ke-20 sebesar 0.0610 unit/mg protein. Terdapat hubungan yang berbanding lurus antara berat biomassa dengan aktivitas lipase isolat AJB 4(4).

Pengaruh penambahan kation terhadap aktivitas lipase

(12)

OA yang ditambahkan antibiotik sikloheksamida (50 mg/mL) untuk menekan pertumbuhan cendawan dan asam nalidiksat (20 mg/mL) untuk menekan pertumbuhan bakteri Gram negatif.

Pada penelitian ini dilakukan modifikasi metode penapisan aktivitas lipase dengan mengganti trioleoylglyserol dengan minyak zaitun 3%. Hasil penapisan aktivitas lipase pada media agar Rhodamine B menunjukkan bahwa isolat AJB 4(4) memiliki aktivitas lipase. Hofelman et al. (1983) menyatakan bahwa, lipase dapat divisualisasikan pada agar yang mengandung trioleoylglyserol dan pewarna Rhodamine B. Kouker & Jaeger (1987) mengungkapkan bahwa proses pengikatan Rhodamine B dengan asam lemak dan mono atau trigliserida sangat spesifik dan sensitif. Selain itu keberadaan ikatan antara Rhodamine B dengan asam lemak dan mono atau trigliserida dapat dideteksi di bawah sinar UV yang menghasilkan pendaran berwarna orange. Spesifitas dari metode ini ditunjukkan ketika enzim esterase diuji, tidak ada zona berpendar yang dihasilkan. Sensitifitas metode ini telah dibuktikan melalui fakta bahwa aktivitas lipase dapat dideteksi hingga 60 nmol asam lemak yang dilepaskan per menit, sedangkan panapisan dengan metode titrimetric dapat dideteksi apabila aktivitas lipase mencapai 1200 nmol asam lemak yang dilepaskan per menit. Isolat AJB 4(1) tidak menghasilkan pendaran orange pada media Rhodamine B ketika disinari UV, sehingga isolat AJB 4(1) kemungkinan tidak memiliki aktivitas lipase. Pendaran warna yang dihasilkan dipengaruhi oleh indikator yang digunakan. Budiatman et al. (1993) menggunakan indikator spirit blue pada uji aktivitas lipase bakteri lipase pada pencernaan ayam, menunjukkan hasil positif menghasilkan zona berpendar berwarna biru. Media yang digunakan untuk optimasi adalah media YMB, media yang memiliki kandungan maltosa dan ekstrak khamir sehingga cukup baik untuk pertumbuhan aktinomiset endofit uji. Ekstrak khamir merupakan substrat terbaik pada sebagian mikrob yang mengandung vitamin B dan dapat berfungsi sebagai sumber nitrogen serta sumber karbon (Prescott et al. 1999). Aerasi diperlukan pada saat optimasi hal ini karena aktinomiset merupakan bakteri aerob yang memerlukan oksigen. Aktinomiset cenderung tumbuh baik pada kisaran suhu ruang (25oC-28oC) karena termasuk bakteri mesofilik yang hidup di tanah atau jaringan

tumbuhan sehingga kurang toleran pada suhu yang lebih tinggi (Doran et al. 1990). Kesesuaian suhu diperlukan untuk pertumbuhan aktinomiset yang optimum. Pada penelitian ini kultur aktinomiset endofit uji tidak tumbuh pada kisaran suhu 40oC dan 50oC.

Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikrob yaitu komposisi media pertumbuhan yang digunakan, suhu, pH, dan aerasi. Media tumbuh yang biasa digunakan terdiri atas media sintetik dan media kompleks. Media sintetik merupakan media sederhana yang seluruh komponennya telah diketahui (Madigan et al. 2000). Aktinomiset, khususnya Streptomyces, merupakan bakteri kemoorganotropik yang dapat tumbuh pada media sintetik yang hanya mengandung sumber karbon organik, sumber nitrogen inorganik (NH4+ atau NO3-), dan beberapa garam mineral lainnya (Wendisch & Kutzner 1991). Media kompleks mengandung komponen nutrisi yang lengkap seperti pepton, ekstrak daging, dan ekstrak khamir. Media YMB yang digunakan pada penelitian termasuk media kompleks.

(13)

7

Enzim lipase merupakan enzim yang menghidrolisis ester karboksilat. Enzim ini mempunyai substrat alami berupa trigliserida dari asam lemak. Pada penelitian digunakan 3 macam substrat yakni minyak zaitun, palm oil, dan extra virgin oil, ketiganya mengandung asam lemak. Kadar protein yang dihasilkan dari ketiga substrat menunjukkan hasil yang berbeda, hal ini kemungkinan disebabkan oleh enzim dan protein hasil metabolisme lain yang dihasilkan mikrob. Selama masa pertumbuhan, dihasilkan pula enzim ekstraseluler lain dan protein hasil metabolisme mikrob, sehingga terjadi peningkatan kadar protein (Soputro 1987).

Aktivitas spesifik lipase isolat AJB 4(4) dilakukan pada suhu ruang dan waktu inkubasi selama 15 hari. Hasil tertinggi pada substrat extra virgin oil, yakni sebesar 4.743 unit/mg. Nilai ini lebih besar jika dibandingkan dengan penelitian Wirawan (2010) sebesar 1.139 unit/mg atau meningkat sebesar 316.4 %. Hal tersebut juga didukung hasil penelitian Massadeh & Sabra (2011), penggunaan substrat extra virgin oil menghasilkan aktivitas spesifik lipase asal Bacillus stearothermophilus terbesar (10.623 unit/mg). Extra virgin oil mengandung sejumlah polifenol dengan kadar lebih tinggi dan asam lemak tak jenuh rantai tunggal dalam jumlah besar yang sebagian besar berupa asam oleat. Kandungan asam oleat pada extra virgin oil sebesar 77-85 %, sedangkan pada minyak zaitun dan palm oil masing-masing sebesar 5-8 % dan 38-42 % (Kreisberg & Oberman 2003). Aktivitas spesifik lipase pada substrat palm oil sebesar 2.329 unit/mg atau meningkat 104.47 %. Pada penggunaan substrat minyak zaitun didapatkan nilai aktivitas lipase sebesar 1.059 atau terjadi penurunan 7.02 % jika dibandingkan dengan penelitian Wirawan (2010). Terdapat perbedaan kondisi inkubasi pada pengukuran aktivitas lipase, dimana Wirawan (2010) mengukur pada suhu 50oC. Enzim lipase masih stabil pada suhu 50oC sedangkan sel aktinomiset endofit akan mengalami kematian pada suhu tersebut.

Pemberian kation Ca2+ sebanyak 20 uL dimaksudkan karena ion Ca2+ merupakan aktivator utama dari enzim lipase. Hal ini juga dinyatakan Pahoja et al. (2001) bahwa adanya ion Ca2+ meningkatkan aktivitas lipase Caesalpinia bonducella L menjadi 106.40 %. Hal yang sama terjadi pada lipase Brassica napus L. adanya ion Ca2+

meningkatkan aktivitas lipase hingga mencapai 165.30 % (Sana et al. 2004).

Ion logam dapat digunakan sebagai aktivator enzim dan pembawa elektron. Fungsi dari ion logam tersebut pada enzim adalah sebagai katalis, berpartisipasi dalam ikatan substrat pada sisi aktif, menjaga konformasi enzim agar tetap sebagai katalis, dan berpartisipasi dalam reaksi redoks (Harvey 2000). Pada konsentrasi tertentu ion logam dapat bertindak sebagai aktivator dan pada konsentrasi tertentu pula dapat bertindak sebagai inhibitor.

Karakterisasi enzim lipase dilakukan dengan penambahan beberapa kation seperti Co2+, Cu2+, Na+, dan Zn2+ dengan konsentrasi akhir 1 mM dan 5 mM. Penambahan kation logam Co2+ dan Cu2+ umumnya menurunkan aktivitas lipase. Kambourova et al. (2003) melaporkan bahwa lipase ekstraselular diproduksi oleh Bacillus stearothermophilus MC 7 terhambat dengan adanya ion divalen seperti Cu2+, Olusesan et al. (2011) juga melaporkan ion Cu2+ menurunkan aktivitas lipase 1.7 % pada isolat Bacillus subtillis NS 8. Kation Na+ dan Zn2+ dapat menaikkan aktivitas lipase isolat AJB 4(4). Pada konsentrasi akhir 1 mM kation Na+ dan Zn2+ mampu menaikkan aktivitas lipase 96.8 % dan 34.07 % atau sebesar 0.16 unit/mg protein dan 0.109 unit/mg protein. Berbeda dengan penelitian Massadeh & Sabra (2011) yang menunjukkan ion Zn2+ menurunkan aktivitas lipase isolat Bacillus stearothermophilus. Beberapa enzim memerlukan molekul anorganik bagi aktivitasnya, penurunan aktivitas lipase akibat penambahan kation menunjukkan bahwa kation yang ditambahkan merupakan inhibitor bagi enzim tersebut, sebaliknya akan terjadi peningkatan aktivitas karena penambahan kation akan berfungsi sebagai kofaktor enzim.

(14)

Hal tersebut menunjukkan enzim tersebut merupakan metalolipase atau lipase yang aktivitasnya dipengaruhi keberadaan logam.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Produksi biomassa optimum isolat AJB 4(4) diperoleh pada suhu ruang dan waktu inkubasi 15 hari sebesar 0.3757 g. Optimasi produksi terhadap lipase isolat AJB 4(4) dapat meningkatkan aktivitasnya hingga 3 kali lipat pada substrat extra virgin oil. Aktivitas lipase isolat AJB 4(4) meningkat dengan penambahan kation Na+ dan Zn2+ 1 mM serta 5 mM namun menurun dengan penambahan senyawa EDTA 1 mM dan 5 mM.

Saran

Perlu dilakukan optimasi pada berbagai kondisi pH untuk mengetahui pH optimum produksi lipase isolat AJB 4(4), identifikasi isolat AJB 4(4), dan pengujian menggunakan substrat lemak hewani.

DAFTAR PUSTAKA

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal Biochem 72:248-254. Budiatman S, Fardiaz D, Nurtama B,

Robiatul D, Gesang M. 1993. Proses Interesterifikasi Minyak Kelapa sawit dan Minyak Inti Sawit untuk Mendapatkan Produk-Produk yang Bernilai Tinggi Tahap I. [laporan penelitian]. Bogor: Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor.

Castillo et al. 2002. Munumbicins, wide-spectrum antibiotics produce by

Streptomyces NRRL 30562,

endophytic on: Kenedia nigrisca. Microbiology 148:2675-2685.

Christakopoulos P et al. 1992, Production and characterization of extracellular lipase from Calvatia gigantea. Appl Microbiol Biotechnol l32:194-197. Doran JL, Leskiw BK, Aippersbach, Jensen

E. 1990. Isolation and characterization of a 8-lactamase-inhibitory protein

from Streptomyces clavuligerus and cloning and analysis of the corresponding gene. J Bacteriol 172:4909-4918.

Dugi et al. 2000. In vivo evidence for both lipolytic and nonlipolytic function of hepatic lipase in the metabolism of HDL. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20:793-800.

Eltaweel MA, Rahman RNZ, Salleh AB, Basri M. 2005. An organic solvent-stable lipase from Bacillus sp. strain 42. Annals Microbiol 55:187-192. Ghosh PK, Saxena RK, Gupta R, Yadav RP,

Davidson S. 1996. Microbial lipases: production and applications. Sci Prog 79:119-157.

Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. Boston: The McGraw-Hill Companies, Inc.

Hofelman M, Kittsteiner R, Schreire P. 1983. Ultra thin-layer agar gel: a novel print technique for ultra thin-layer isoelectric focusing of enzymes. Anal Biochem 20:72-81.

Iswantini et al. 2003. Identifikasi senyawa bioaktif daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) sebagai pelangsing dengan menggunakan metode enzimatis. Gakuryoku 9: 138-142.

Kambourova M, Kirilova N, Mandeva R, Derekova A. 2003. Purification and properties of thermostable lipase from a thermophilic Bacillus stearothermophilus MC. J Mol Catal B: Enzym 7:307-313.

Kouker G, Jaeger KE. 1987. Spesific and sensitive plate assay for bacterial lipases. Appl Environ Microbiol 53:211.

Kreisberg RA, A Oberman. 2003. Medical

management of hyperlipidemia/dyslipidemia. J Clin

Endo 88:2445-2461.

Kudo T. 1997. Family Streptomycetaceae. In : Miyadoh S (ed). Atlas of Actinomycetes. The Society for Actinomycetes Japan.

(15)

9

Lestari Y. 2006. Identification of indigenous

Streptomyces spp. producing

antibacterial compounds. J Mikrobiol Indones 11:99-101.

Lestari K., Muchtadi A. 1997. Uji Aktivitas Antihiperlipidemia Daun Jati Belanda (Guazuma ulmifolia) pada Tikus. [laporan penelitian]. Bandung: Universitas Padjadjaran.

Lima V et al. 2004. Evaluation of the potential for use in biocatalysis of a lipase from a wild strain of Bacillus megaterium. J Mol Catal B: Enzym 31:53-61.

Litthauer D, Ginster A, Skein E. 2002. Pseudomonas luteola lipase: a new member of the 203-residue Pseudomonas lipase family. Enzyme Microb Technol 30:219-226.

Lizumi T et al. 1990. Purification and characterization of a thermostable lipase from newly isolated Pseudomonas sp. KWI-56. Agric Biol Chem 54:1253-1258.

Lu H, WX Zou, JC Meng, J Hu, RX Tan. 2000. New Bioactive metabolites produced by Colletotrichum sp. an endophytic fungus in Artemisia annua. Plant Sci 151:73-76.

Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Biology of Microorganisms Ed ke-9. New Jersey: Prentice Hall.

Massadeh MI, Sabra FM. 2011. Production and characterization of lipase from Bacillus stearothermophilus. Afr J Biotech 10:13139-13146.

Nurkanto A. 2007. Identifikasi aktinomiset tanah hutan pasca kebakaran Bukit Bangkirai Kalimantan Timur dan potensinya sebagai pendegradasi selulosa dan pelarut fosfat. Biodiversitas 8:314-319.

Olusesan AT et al. 2011. Purification, characterization and thermal inactivation kinetics of a non regioselective thermostable lipase from a genotypically identified extremophilic Bacillus NS 8. N Biotechnol 28:738-745.

Pahoja VM, Dahot MU, Sethar MA. 2001. Characteristic properties of lipase crude extract of Caesalpinia bounducella L. seeds. J Biol Sci 1:775-778.

Prescott LM, Harley JP, Klein DA. 1999. Microbiology. New York: Mc Graw Hill.

Rahardjo et al. 2005. Influence of etanol extract of jati belanda leaves (Guazuma ulmifolia Lamk.) on lipase enzyme activity of Rattus norvegicus serum. Inovasi 4:48-53.

Raja A, Prabakarana P. 2011. Actinomycetes and drug-an overview. Am J Drug Discov Dev 1:75-84.

Sana, Hossin I, Haque EM, Shaha RK.. 2004. Identification, purification and characterization of lipase from germination oil seed (Brassica napus L.). Pak J Biol Sci 7:246- 252.

Sari WE. 2011. Aktivitas antihipertensi aktinomiset endofit asal tanaman pegagan dan belimbing wuluh [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Shah KR, Bhatt SA. 2011. Purification and characterization of lipase from Bacillus subtilis Pa2. J Biochem Technol 3:292-295.

Sharon C, Furogoh S, Yamakido T, Ogawa HI, Kato Y. 1998. Purification and caracterization of a lipase from Pseudomonas aeroginusa KKA-5 and its role in castor oil hydrolysis. J Industrial Microbiol & Biotechnol 20:304-307.

Sirisha E, Rajasekar N, Narasu LM. 2010. Isolation and optimization of lipase producing bacteria from oil contaminated soils. Adv Biol Res 4:249-252.

Soputro L. 1987. Produksi α amilase pada fermentasi Aspergillus niger dan

Aspergillus oryzae dengan

suplemantasi limbah tapioka dan dedak padi. [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Strobel G, Daisy B. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiol Mol Biol Rev 40:1081-1085.

(16)

Wendisch FK, Kutzner HJ. 1991. The family Streptomycetaceae : ecophysiology, isolation, identification, application. Springer Verlag 1:460-516.

Weibel EK, Hadvary P, Houchuli E, Kupfer E, Lengsfeld H. 1987. Lipstatin, an inhibitor of pancreatic lipase, produced by Streptomyces toxytricini. I. producing organism, fermentation, isolation and biological activity. J Antibiot 40:1081-5.

Wirawan B. 2010. Potensi bakteri endofit asal tanaman obat sebagai penghasil senyawa antihiperlipidemia melalui aktivitas lipase. [skripsi]. Bogor:

Fakutas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Yamamato K, Fujiwara N. 1988. Purification and some properties of a castoroil-hydrolyzing lipase from Pseudomonas sp. Agric Biol Chem 52:3015-302.

Yusepi TT. 2011. Kemampuan aktinomiset endofit dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman padi (Oryza sativa L.) melalui aktivitas asam indol asetat. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

(17)

11

LAMPIRAN

(18)

ABSTRAK

ABSTRACT

(19)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Penggunaan enzim dalam bioteknologi semakin berkembang secara cepat. Banyak industri yang telah memanfaatkan kerja enzim, salah satunya adalah enzim lipase. Enzim lipase (triacyglycerol hydrolase, EC 3.1.1.3) dapat menghidrolisis senyawa triacyglycerol menjadi asam lemak dan acyglycerol (Litthaeur et al. 2002). Enzim tersebut juga berperan dalam metabolisme lipoprotein dalam darah dengan menghidrolisis trigliserida dan fosfolipid yang terdapat pada kilomikron, IDL (Intermediate Density Lipoprotein) dan HDL (High Density Lipoprotein) (Dugi et al. 2000).

Sumber lipase dapat diperoleh dari berbagai jenis mikrob seperti fungi dan bakteri. Jenis fungi yang potensial penghasil lipase adalah Geotricum spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., dan Candida spp, sedangkan jenis bakteri yang potensial sebagai penghasil lipase adalah Pseudomonas spp., Achromobacter spp., Staphylococcus spp., dan Streptomyces spp. (Ghost et al. 1996). Enzim yang berasal dari mikrob tersebut secara komersial banyak digunakan dalam industri farmasi, makanan, detergen serta kesehatan.

Tanaman jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) dapat bermanfaat sebagai pelangsing tubuh, sehingga ekstrak tanaman ini banyak digunakan di dalam ramuan tradisional jamu pelangsing. Penelitian dari tanaman jati belanda menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun jati belanda yang mengandung alkaloid, triterpenoid, dan steroid secara in vitro mampu menghambat aktivitas lipase yang diisolasi dari Rhizopus arrhizus (Iswantini et al. 2003). Menurut Rahardjo et al. (2005) ekstrak etanol daun jati belanda secara in vivo mampu menghambat aktivitas lipase serum Rattus norvegitus. Lestari & Muhtadi (1997) menyatakan, pemberian ekstrak etanol daun jati belanda sebanyak 1g/kg bobot badan pada tikus hiperlipidemia mampu menurunkan kadar kolesterolnya.

Cara inovatif untuk mengefisienkan sumber senyawa bioaktif adalah dengan memanfaatkan mikrob endofit yang berasosiasi dengan tanaman obat tersebut. Menurut Strobel & Daisy (2003) berbagai jenis senyawa bioaktif dengan beragam fungsi yang terkandung di dalam tumbuhan,

diduga dapat pula dihasilkan oleh mikrob endofit pada tumbuhan tersebut. Lu et al. (2000) melaporkan bahwa Colletotrichum sp. merupakan mikrob endofit pada tanaman Artemisia annua yang dipercaya masyarakat sebagai obat malaria ternyata menghasilkan metabolit artemisinin yang sangat potensial sebagai anti malaria. Castilo et al. (2002) telah membuktikan bahwa tanaman Snakevine (Kennedia nigrisca) yang digunakan untuk mengobati luka dan infeksi yang ternyata mengandung mikrob endofit Streptomyces sp. strain NRRL 30562. Aktinomiset endofit asal tanaman pegagan (Centella asiatica) dan belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) terbukti menghasilkan senyawa inhibitor ACE yang berperan sebagai antihipertensi (Sari 2011). Aktinomiset endofit juga memiliki kemampuan dalam menghasilkan asam indol asetat (IAA) yang mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman padi (Yusepi 2011).

Streptomyces toxytricini mampu

menghasilkan senyawa lipstatin sebagai senyawa antihiperlipidemia yang bekerja sebagai inhibitor enzim pankreatik lipase (Weibel et al. 1987). Adanya kemampuan mikrob endofit menghasilkan senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya, merupakan peluang yang dapat dioptimalkan untuk memproduksi metabolit sekunder secara efisien dan cepat.

Aktinomiset merupakan bakteri Gram positif berfilamen dan dapat berperan sebagai penghasil beragam senyawa bioaktif yang dapat berfungsi antara lain sebagai antibiotik, enzim inhibitor, dan senyawa bioaktif lainnya (Lestari 2006). Menurut Raja dan Prabakarana (2011) aktinomiset dikenal sebagai penghasil antibiotik terbesar, karena dari 16.500 antibiotik yang telah ditemukan, lebih dari setengahnya dihasilkan oleh aktinomiset.

(20)

potensinya lebih lanjut. Oleh karena itu kajian tentang optimasi produksi lipase aktinomiset endofit asal tanaman jati belanda sangat penting untuk dilakukan.

Tujuan Penelitian

Mengoptimasi produksi lipase aktinomiset endofit asal tanaman jati belanda.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari hingga November 2011 di laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA-IPB serta laboratorium Balai Penelitian Tanah, Litbang Pertanian Bogor.

Bahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini ialah isolat aktinomiset endofit AJB 4(1) dan AJB 4(4) yang berasal dari koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, media Oatmeal Agar (OA), Yeast Starch Agar (YSA), Yeast Malt Broth (YMB) (Lampiran 1), dan media Rhodamine B, antibiotik asam nalidiksat (20 mg/mL) dan sikloheksamida (50 mg/mL), lipase tipe VII dari Candida rugosa (Sigma Chemical Co), beberapa senyawa aktivator dan inhibitor seperti Co2+, Cu2+, Na+, Zn2+, dan EDTA serta modifikasi media untuk produksi enzim dengan penambahan substrat minyak zaitun, extra olive oil, dan palm oil (Bertolli 8.5 Fl oz).

Peremajaan isolat aktinomiset endofit

Isolat aktinomiset endofit AJB 4(1) dan AJB 4(4) diremajakan dengan cara menumbuhkan koloni pada media OA dan YSA. Isolat diinkubasi pada suhu ruang (25-28oC) selama 21 hari.

Esei aktivitas lipase aktinomiset endofit

Aktinomiset endofit AJB 4(1) dan AJB 4(4) hasil peremajaan diinokulasikan pada media YSA yang mengandung 3% minyak zaitun dan 2 mL 0.1% pewarna Rhodamine B yang telah disterilisasi menggunakan milipore (Swannex) 0.2 µm (Kouker & Jaeger 1987), kemudian isolat aktinomiset endofit diinkubasi pada suhu 25oC selama 120 jam. Lipase tipe VII dari Candida rugosa digunakan sebagai kontrol positif aktivitas lipase. Aktivitas lipase pada media penapisan dapat dideteksi di bawah sinar UV sebagai zona berpendar berwarna orange.

Optimasi produksi lipase aktinomiset endofit

Optimasi tahap I:

Optimasi pertama dilakukan terhadap biomassa sel pada beragam waktu inkubasi dan suhu. Sebanyak 3 disc agar (Ф 8 mm) isolat aktinomiset endofit dikulturkan ke dalam 50 ml YMB. Kultur diinkubasi pada inkubator bergoyang pada suhu ruang, 30oC, 40oC, dan 50oC dengan kondisi aerasi 150 rpm selama 20 hari. Pada hari ke 5, 10, 15, dan 20 dilakukan pengambilan kultur sel dan disentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit kemudian dilakukan pengukuran bobot kering biomassa aktinomiset endofit.

Optimasi tahap II:

Optimasi kedua dilakukan terhadap aktivitas lipase dengan beragam substrat. Isolat aktinomiset endofit diinokulasikan pada 50 mL media YMB kemudian kultur starter diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Kultur starter dimasukkan ke dalam media produksi yang mengandung (per 100 mL) substrat 1% minyak zaitun, 1% extra virgin oil, dan 1% palm oil yang masing-masing substrat ditambahkan 0.02% CaCl2.

2H2O, 0.01% MgSO4. 7H2O, dan 0.04%

FeCl3. 6H2O (Eltaweel et al. 2005). Inkubasi

dilakukan pada inkubator bergoyang pada suhu ruang dengan kondisi aerasi 150 rpm selama 15 hari. Pada hari ke 15 dilakukan pengambilan kultur sel dan disentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh mengandung enzim lipase ekstrak kasar yang kemudian diukur aktivitas spesifik dan kadar proteinnya.

Pengukuran aktivitas lipase

Enzim ekstrak kasar diukur aktivitas lipasenya dengan menggunakan metode Kwon & Rhee (1986). Satu mL enzim ekstrak kasar dicampurkan ke dalam larutan yang mengandung 2.5 mL minyak zaitun + 0.005 M buffer fosfat (1:1) dan 20 µL CaCl2,

(21)

4

Aktivitas lipase aktinomiset endofit

Pengukuran aktivitas lipase dilakukan untuk mengetahui kemampuan aktinomiset endofit uji dalam menghasilkan lipase. Isolat AJB 4(4) memiliki aktivitas lipase yang diindikasikan dengan adanya pendaran orange pada media agar Rhodamine B saat penyinaran UV. Kontrol positif menggunakan lipase tipe VII menghasilkan pendaran orange yang sangat terang,dan diameter yang besar hal ini dikarenakan sudah dalam kondisi enzim murni, berbeda dengan lipase AJB 4(4) yang masih merupakan enzim ekstrak kasar. Isolat AJB 4(1) (kontrol negatif) tidak memilki aktivitas lipase karena tidak menghasilkan pendaran orange saat disinari sinar UV. (Gambar 3).

Produksi optimum lipase aktinomiset endofit

Tabel 1 Produksi biomassa (g) isolat AJB 4(4) pada media Yeast Malt Broth (YMB) selama 20 hari inkubasi pada suhu ruang dan 30oC

Hari Ke- Biomassa (g) Suhu Ruang Suhu 30oC 5 10 0.3180c 0.3529ab 0.2858a 0.3105a 15 20 0.3757a 0.3374bc 0.3400a 0.3222a Keterangan: Angka-angka yang diikuti huruf

yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan taraf nyata 5%

Optimasi dilakukan selama 20 hari dan setiap 5, 10, 15, dan 20 hari dilakukan pengukuran biomassa kering. Hasil pengukuran biomassa menunjukkan bahwa bobot terbesar didapatkan pada waktu inkubasi 15 hari dan suhu ruang sebesar 0.3757 g (Tabel 1), sedangkan pada suhu 40oC dan 50oC isolat AJB 4(4) tidak dapat tumbuh. Telah maksimalnya biomassa isolat pada hari panen 15 hari menunjukkan pertumbuhan isolat tersebut sudah mencapai tahap optimum. Isolat AJB 4(4) kemudian mengalami penurunan pertumbuhan pada hari selanjutnya kemungkinan karena persaingan antar sel aktinomiset, berkurangnya nutrisi pada media, dan dihasilkannya metabolit sekunder yang kemungkinan dapat berperan sebagai inhibitor.

Optimasi terhadap substrat dilakukan dengan menggunakan 3 macam substrat, yaitu minyak zaitun, extra virgin oil, dan palm oil. Isolat AJB 4(4) ditumbuhkan pada media produksi dengan menambahkan ketiga jenis substrat tersebut sebagai pendekatan kajian hidrolisis lipid isolat AJB 4(4). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ketiga substrat tersebut mampu dihidrolisis oleh isolat AJB 4(4). Aktivitas lipase tertinggi dihasilkan pada substrat extra virgin oil sebesar 0.083 unit/mL. Aktivitas lipase yang diperoleh masih dalam enzim ekstrak kasar, oleh karena itu dilakukan pengukuran kadar potein untuk mendapatkan aktivitas spesifik lipase. Kadar protein tertinggi didapatkan pada penggunaan substrat minyak zaitun sebesar 0.0373 mL/mg. Berdasarkan aktivitas lipase dan kadar proteinnya maka aktivitas spesifik lipase tertinggi dihasilkan dengan menggunakan substrat extra virgin oil sebesar 4.743 unit/mg, sedangkan pada substrat minyak zaitun dan palm oil masing-masing sebesar 1.059 unit/mg dan 2.329 unit/mg (Tabel 2).

Pengukuran aktivitas lipase isolat AJB 4(4) dilakukan setiap 5 hari sekali selama 20 hari pada kondisi optimum produksi biomassa. Aktivitas lipase tertinggi diperoleh pada hari ke-15 sebesar 0.0865 unit/mg protein (Gambar 4). Aktivitas lipase menurun pada hari ke-20 sebesar 0.0610 unit/mg protein. Terdapat hubungan yang berbanding lurus antara berat biomassa dengan aktivitas lipase isolat AJB 4(4).

Pengaruh penambahan kation terhadap aktivitas lipase

(22)

OA yang ditambahkan antibiotik sikloheksamida (50 mg/mL) untuk menekan pertumbuhan cendawan dan asam nalidiksat (20 mg/mL) untuk menekan pertumbuhan bakteri Gram negatif.

Pada penelitian ini dilakukan modifikasi metode penapisan aktivitas lipase dengan mengganti trioleoylglyserol dengan minyak zaitun 3%. Hasil penapisan aktivitas lipase pada media agar Rhodamine B menunjukkan bahwa isolat AJB 4(4) memiliki aktivitas lipase. Hofelman et al. (1983) menyatakan bahwa, lipase dapat divisualisasikan pada agar yang mengandung trioleoylglyserol dan pewarna Rhodamine B. Kouker & Jaeger (1987) mengungkapkan bahwa proses pengikatan Rhodamine B dengan asam lemak dan mono atau trigliserida sangat spesifik dan sensitif. Selain itu keberadaan ikatan antara Rhodamine B dengan asam lemak dan mono atau trigliserida dapat dideteksi di bawah sinar UV yang menghasilkan pendaran berwarna orange. Spesifitas dari metode ini ditunjukkan ketika enzim esterase diuji, tidak ada zona berpendar yang dihasilkan. Sensitifitas metode ini telah dibuktikan melalui fakta bahwa aktivitas lipase dapat dideteksi hingga 60 nmol asam lemak yang dilepaskan per menit, sedangkan panapisan dengan metode titrimetric dapat dideteksi apabila aktivitas lipase mencapai 1200 nmol asam lemak yang dilepaskan per menit. Isolat AJB 4(1) tidak menghasilkan pendaran orange pada media Rhodamine B ketika disinari UV, sehingga isolat AJB 4(1) kemungkinan tidak memiliki aktivitas lipase. Pendaran warna yang dihasilkan dipengaruhi oleh indikator yang digunakan. Budiatman et al. (1993) menggunakan indikator spirit blue pada uji aktivitas lipase bakteri lipase pada pencernaan ayam, menunjukkan hasil positif menghasilkan zona berpendar berwarna biru. Media yang digunakan untuk optimasi adalah media YMB, media yang memiliki kandungan maltosa dan ekstrak khamir sehingga cukup baik untuk pertumbuhan aktinomiset endofit uji. Ekstrak khamir merupakan substrat terbaik pada sebagian mikrob yang mengandung vitamin B dan dapat berfungsi sebagai sumber nitrogen serta sumber karbon (Prescott et al. 1999). Aerasi diperlukan pada saat optimasi hal ini karena aktinomiset merupakan bakteri aerob yang memerlukan oksigen. Aktinomiset cenderung tumbuh baik pada kisaran suhu ruang (25oC-28oC) karena termasuk bakteri mesofilik yang hidup di tanah atau jaringan

tumbuhan sehingga kurang toleran pada suhu yang lebih tinggi (Doran et al. 1990). Kesesuaian suhu diperlukan untuk pertumbuhan aktinomiset yang optimum. Pada penelitian ini kultur aktinomiset endofit uji tidak tumbuh pada kisaran suhu 40oC dan 50oC.

Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikrob yaitu komposisi media pertumbuhan yang digunakan, suhu, pH, dan aerasi. Media tumbuh yang biasa digunakan terdiri atas media sintetik dan media kompleks. Media sintetik merupakan media sederhana yang seluruh komponennya telah diketahui (Madigan et al. 2000). Aktinomiset, khususnya Streptomyces, merupakan bakteri kemoorganotropik yang dapat tumbuh pada media sintetik yang hanya mengandung sumber karbon organik, sumber nitrogen inorganik (NH4+ atau NO3-), dan beberapa garam mineral lainnya (Wendisch & Kutzner 1991). Media kompleks mengandung komponen nutrisi yang lengkap seperti pepton, ekstrak daging, dan ekstrak khamir. Media YMB yang digunakan pada penelitian termasuk media kompleks.

(23)

7

Enzim lipase merupakan enzim yang menghidrolisis ester karboksilat. Enzim ini mempunyai substrat alami berupa trigliserida dari asam lemak. Pada penelitian digunakan 3 macam substrat yakni minyak zaitun, palm oil, dan extra virgin oil, ketiganya mengandung asam lemak. Kadar protein yang dihasilkan dari ketiga substrat menunjukkan hasil yang berbeda, hal ini kemungkinan disebabkan oleh enzim dan protein hasil metabolisme lain yang dihasilkan mikrob. Selama masa pertumbuhan, dihasilkan pula enzim ekstraseluler lain dan protein hasil metabolisme mikrob, sehingga terjadi peningkatan kadar protein (Soputro 1987).

Aktivitas spesifik lipase isolat AJB 4(4) dilakukan pada suhu ruang dan waktu inkubasi selama 15 hari. Hasil tertinggi pada substrat extra virgin oil, yakni sebesar 4.743 unit/mg. Nilai ini lebih besar jika dibandingkan dengan penelitian Wirawan (2010) sebesar 1.139 unit/mg atau meningkat sebesar 316.4 %. Hal tersebut juga didukung hasil penelitian Massadeh & Sabra (2011), penggunaan substrat extra virgin oil menghasilkan aktivitas spesifik lipase asal Bacillus stearothermophilus terbesar (10.623 unit/mg). Extra virgin oil mengandung sejumlah polifenol dengan kadar lebih tinggi dan asam lemak tak jenuh rantai tunggal dalam jumlah besar yang sebagian besar berupa asam oleat. Kandungan asam oleat pada extra virgin oil sebesar 77-85 %, sedangkan pada minyak zaitun dan palm oil masing-masing sebesar 5-8 % dan 38-42 % (Kreisberg & Oberman 2003). Aktivitas spesifik lipase pada substrat palm oil sebesar 2.329 unit/mg atau meningkat 104.47 %. Pada penggunaan substrat minyak zaitun didapatkan nilai aktivitas lipase sebesar 1.059 atau terjadi penurunan 7.02 % jika dibandingkan dengan penelitian Wirawan (2010). Terdapat perbedaan kondisi inkubasi pada pengukuran aktivitas lipase, dimana Wirawan (2010) mengukur pada suhu 50oC. Enzim lipase masih stabil pada suhu 50oC sedangkan sel aktinomiset endofit akan mengalami kematian pada suhu tersebut.

Pemberian kation Ca2+ sebanyak 20 uL dimaksudkan karena ion Ca2+ merupakan aktivator utama dari enzim lipase. Hal ini juga dinyatakan Pahoja et al. (2001) bahwa adanya ion Ca2+ meningkatkan aktivitas lipase Caesalpinia bonducella L menjadi 106.40 %. Hal yang sama terjadi pada lipase Brassica napus L. adanya ion Ca2+

meningkatkan aktivitas lipase hingga mencapai 165.30 % (Sana et al. 2004).

Ion logam dapat digunakan sebagai aktivator enzim dan pembawa elektron. Fungsi dari ion logam tersebut pada enzim adalah sebagai katalis, berpartisipasi dalam ikatan substrat pada sisi aktif, menjaga konformasi enzim agar tetap sebagai katalis, dan berpartisipasi dalam reaksi redoks (Harvey 2000). Pada konsentrasi tertentu ion logam dapat bertindak sebagai aktivator dan pada konsentrasi tertentu pula dapat bertindak sebagai inhibitor.

Karakterisasi enzim lipase dilakukan dengan penambahan beberapa kation seperti Co2+, Cu2+, Na+, dan Zn2+ dengan konsentrasi akhir 1 mM dan 5 mM. Penambahan kation logam Co2+ dan Cu2+ umumnya menurunkan aktivitas lipase. Kambourova et al. (2003) melaporkan bahwa lipase ekstraselular diproduksi oleh Bacillus stearothermophilus MC 7 terhambat dengan adanya ion divalen seperti Cu2+, Olusesan et al. (2011) juga melaporkan ion Cu2+ menurunkan aktivitas lipase 1.7 % pada isolat Bacillus subtillis NS 8. Kation Na+ dan Zn2+ dapat menaikkan aktivitas lipase isolat AJB 4(4). Pada konsentrasi akhir 1 mM kation Na+ dan Zn2+ mampu menaikkan aktivitas lipase 96.8 % dan 34.07 % atau sebesar 0.16 unit/mg protein dan 0.109 unit/mg protein. Berbeda dengan penelitian Massadeh & Sabra (2011) yang menunjukkan ion Zn2+ menurunkan aktivitas lipase isolat Bacillus stearothermophilus. Beberapa enzim memerlukan molekul anorganik bagi aktivitasnya, penurunan aktivitas lipase akibat penambahan kation menunjukkan bahwa kation yang ditambahkan merupakan inhibitor bagi enzim tersebut, sebaliknya akan terjadi peningkatan aktivitas karena penambahan kation akan berfungsi sebagai kofaktor enzim.

(24)