SELEKSI TANAMAN PADI TRANSGENIK GENERASI T1 DAN T2
YANG MEMBAWA KANDIDAT GEN TOLERANSI ALUMINIUM
FAIZAL KURNIA SYAVITRI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
ABSTRAK
FAIZAL KURNIA SYAVITRI. Seleksi Tanaman Padi Transgenik Generasi T1 dan T2 yang Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium. Di bawah bimbingan MIFTAHUDIN dan TATIK CHIKMAWATI.
Penggunaan varietas padi toleran aluminium (Al) merupakan salah satu pemecahan masalah yang dihadapai oleh pertanian tanaman pangan di tanah masam. Pengembangan varietas padi toleran Al dapat dilakukan melalui rekayasa genetika. Tanaman padi transgenik generasi T1 dan T2 telah diperoleh dari hasil transformasi gen B11, suatu kandidat gen toleransi Al ke tanaman padi T309 akan tetapi sampai saat ini belum diketahui kebenaran tanaman transgenik tersebut. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk melakukan seleksi dan verifikasi tanaman padi transgenik generasi T1 dan T2 yang membawa kandidat gen toleransi Al. Hasil seleksi tanaman padi transgenik generasi T1 dan T2 pada media seleksi antibiotik paromomisin diperoleh beberapa nomor tanaman padi transgenik yang lolos seleksi. Penggunaan media seleksi paromomisin dapat menyeleksi tanaman transgenik dari tanaman non transgenik tanpa menyebabkan efek albino seperti yang terjadi pada seleksi menggunakan antibiotik kanamisin. Hasil analisis PCR menggunakan primer dari gen nptII menunjukkan adanya pita DNA berukuran 600 pb pada tanaman transgenik, tetapi tidak dihasilkan pita ukuran tersebut pada non transgeniknya. Karakter tinggi tanaman dan jumlah anakan dari tanaman non transgenik dan tanaman transgenik tidak berbeda secara nyata.
Kata kunci: Tanah masam, Toleran aluminium, Padi transgenik.
ABSTRACT
FAIZAL KURNIA SYAVITRI. The Selection of T1 and T2 Generation of Transgenic Rice Carrying Aluminium Tolerant Gene Candidate. Supervised by MIFTAHUDIN and TATIK CHIKMAWATI.
The use of aluminum (Al) tolerant rice variety is one of the alternative solutions to solve the food crop production problem in acid soils. The Al tolerant rice variety can be developed by genetic engineering. The T1 and T2 generation of transgenic rice has been developed from the transformation of rice using B11 gene, which was an Al tolerance gene candidate. However the true transgenic rice carrying the B11 gene has not been confirmed yet. This research was conducted to select and verify the T1 and T2 transgenic rice which contained the Al tolerant gene candidate. The result showed that the selection media containing paromomycin antibiotic could select the putatif transgenic rice without albinism effect that appeared in selection using canamycin antibiotic. The selection obtained true transgenic lines. The PCR analysis using the primers developed from nptII gene showed a 600 bp DNA band in the transgenic plant, but it was none in the wild type. The plant height and number of tiller characters were not significantly different between the wild type and the transgenic plant.
SELEKSI TANAMAN PADI TRANSGENIK GENERASI T1 DAN T2
YANG MEMBAWA KANDIDAT GEN TOLERANSI ALUMINIUM
FAIZAL KURNIA SYAVITRI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Seleksi Tanaman Padi Transgenik Generasi T1 dan T2 yang
Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium
Nama
: Faizal Kurnia Syavitri
NIM
: G34070067
Disetujui:
Pembimbing I
Dr. Ir. Miftahudin, M.Si
NIP 19620419 198903 1 001
Pembimbing II
Dr. Ir. Tatik Chikmawati, M.Si
NIP 19640306 199002 2 001
Diketahui,
Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP 19641002 198903 1 002
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Seleksi Tanaman Padi Transgenik Generasi T1 dan T2 yang Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium” dilakukan mulai Februari 2011 sampai dengan Juli 2012 di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si. dan Dr. Ir. Tatik Chikmawati, M.Si. atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. Sulistijorini, M.Si sebagai penguji wakil komisi pendidikan. Selanjutnya ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk Bapak, Ibu, Zakkie, serta Liba Silvia atas segala do’a, pengertian serta kasih sayang yang tercurah untuk penulis. Terima kasih kepada Kak Pam, Kak Andik, Ibu Dasum, Pak Pieter, Pak Aka, Mbak Winda, Mas Kifli, Mbak Jumi, Sasti, Ari, Ikra, Eka, Adhi, Alma, Irfan, Fibo dan seluruh staf Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Departemen Biologi, serta teman-teman yang selama ini ikut membantu terlaksananya penelitian ini khususnya di Biologi angkatan 44.
Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, September 2012
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bojonegoro Jawa Timur pada tanggal 4 Mei 1989 dari pasangan Drs. Syafi’i dan Dra. Tri Asih W. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Penulis lulus dari SMP Negeri 1 Kalitidu pada tahun 2004, kemudian melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 2 Bojonegoro dan lulus tahun 2007. Pada tahun yang sama, penulis diterima di Departemen Biologi Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB).
Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Biologi Dasar, Fisiologi Tumbuhan Dasar dan Sistematika Tumbuhan Berpembuluh pada tahun 2010-2012. Pada tahun 20120, penulis melakukan Praktik Lapang di Balai Penelitian Tanaman Serat dan tembakau dengan topik Toksisitas Gula Hasil Ekstrak Tembakau Terhadap Serangga Hama Penggerek Buah Kapas Dan Werang Kapas. Pada tahun 2010 penulis juga pernah mengikuti lomba karya tulis ilmiah di UIN Malang serta lomba inovasi teknologi di ITS Surabaya.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL...viii
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR LAMPIRAN ... viii
PENDAHULUAN ... 1
Latar Belakang ... 1
Tujuan ... 1
BAHAN DAN METODE ... 2
Waktu dan Tempat ... 2
Bahan dan Alat ... 2
Metode ... 2
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada Media Seleksi Antibiotik. ... 2
Penanaman di Rumah Kaca. ... 2
Isolasi DNA. ... 2
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR. ... 2
Analisis Data. ... 3
HASIL ... 3
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada Media Seleksi Antibiotik. ... 3
Pertumbuhan Tanaman Transgenik. ... 4
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR. ... 5
PEMBAHASAN ... 5
SIMPULAN DAN SARAN ... 7
Simpulan ... 7
Saran ... 8
DAFTAR PUSTAKA ... 8
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Hasil perkecambahan biji dengan antibiotik higromisin, kanamisin dan paromomisin pada dua jenis media berbeda ………... 2 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan 100 mg/L
kanamisin ………... 3 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan 25 mg/L
paromomisin ………... 4 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan antibiotik
kanamisin dan paromomisin... 5 Karakter pertumbuhan tanaman non transgenik dan tanaman transgenik ………...……...
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Perkecambahan pada media antibiotik kanamisin ………... 2 Perkecambahan biji pada media seleksi antibiotik paromomisin... 3 Perbedaan pertumbuhan kecambah padi pada dua jenis antibiotik ………... 4 Hasil amplifikasi DNA generasi T1 dengan menggunakan primer nptII………...
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Konstruk pGWB5………..…... 2 Konstruk pBIN11………...…...
3 Komposisi media MS………...
4
5 5
3
4
3
5
3 6
3
3
3 4
3 5
3
6
3
113
123
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman padi (Oryza sativa L.) termasuk tanaman pangan penting di Indonesia. Produksi padi di Indonesia masih tergolong rendah sebesar 67,31 ton gabah kering giling (GKG) per hektar, atau jauh di bawah rata-rata produksi negara lain seperti negara Australia (BPS 2011). Salah satu upaya dapat dilakukan untuk meningkatkan produksi padi adalah dengan memanfaatkan lahan kering yang tersedia cukup luas di luar Pulau Jawa. Di Indonesia terdapat sekitar 47,6 juta hektar (32,4%) lahan kering yang umumnya didominasi oleh tanah masam podsolik merah kuning (Karama & Abdurrachman 1993). Usaha pertanian di tanah masam akan mengalami banyak kendala, diantaranya kelarutan aluminium (Al) yang tinggi (Kochian et al. 1995) yang dapat menghambat pertumbuhan akar. Ismunadji & Partohardjono (1985) juga mengatakan akar akan menjadi pendek dan tebal, percabangan tidak normal, dan tudung akar rusak. Hal tersebut berakibat akar padi tidak mampu menyerap air dan nutrisi dengan baik.
Penggunaan varietas padi toleran terhadap cekaman Al menjadi salah satu alternatif pemecahan masalah pertanian pada tanah masam. Perakitan tanaman padi toleran cekaman Al dapat ditempuh melalui persilangan secara konvensional, memanfaatkan keragaman somaklonal, induksi mutasi maupun rekayasa genetik (Purwoko et al. 2000). Dalam rangka mengembangkan galur padi toleran Al, Miftahudin et al. (2010) telah melakukan transformasi kandidat gen toleransi Al pada padi varietas T309. Saat ini telah diperoleh generasi T1 dan T2 (Miftahudin et al. 2010). Karakterisasi tanaman T1 dan T2 perlu dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman tersebut adalah tanaman transgenik yang membawa gen toleran Al yang diinginkan. Diharapkan tanaman transgenik yang telah terbentuk dapat digunakan untuk mengembangkan galur padi toleran Al yang adaptif terhadap tanah masam.
Dalam proses transformasi telah disisipkan gen-gen yang memiliki ketahanan terhadap antibiotik sebagai marka penyeleksi yaitu gen yang umum digunakan adalah neomicin fosfotransferase II (nptII) dan higromisin fosfotransferase (hpt). Gen nptII digunakan untuk ketahanan terhadap antibiotik
kanamisin dan paromomisin. Pemakaian antibiotik kanamisin atau paromomisin sebagai agen penyeleksi pada proses seleksi tanaman hasil transformasi didasarkan pada asumsi bahwa gen penyandi ketahanan terhadap antibiotik kanamisin atau paromomisin tersebut telah terintegrasi ke dalam kromosom tanaman trnasgenik. Kanamisin dan paromomisin merupakan antibiotik aminoglikosida yang berasal dari sumber yang berbeda. Kanamisin diproduksi oleh Streptomyces kanamyceticus dan paromomisisn diproduksi oleh Streptomyces rimosus, sedangkan gen hpt merupakan gen penyandi antibiotik higromisin. Higromisin umumnya lebih toksik dibandingkan kanamisin. Higromisin mempunyai kemampuan membunuh sel-sel peka lebih cepat dan penyeleksi yang lebih disukai untuk transformasi pada tanaman monokotiledon terutama graminae (Bashir et al. 2004). Higromisin merupakan antibiotik aminoglikosida yang diproduksi oleh Streptomyces hygroscopicus dan merupakan sistem marker penyeleksi yang sesuai untuk sistem tanaman dan hewan. Antibiotik ini menghambat sintesis protein dengan cara menggangu translokasi dan menyebabkan kesalahan translasi pada ribosom 80S (Bashir et al. 2004).
Seleksi tanaman transgenik dilakukan dengan menumbuhkan sel, jaringan atau organ, seperti biji, pada media yang mengandung antibiotik. Sel, jaringan atau organ yang hidup atau lolos dari seleksi akan merupakan tanaman yang berpotensi membawa gen yang ditransformasikan. Selain dengan cara seleksi antiobiotik, seleksi tanaman transgenik juga dapat dilakukan
dengan menggunakan teknik polymerase
chain reaction (PCR) menggunakan primer yang didesain dari sekuen gen yang ditransformasikan atau dari sekuen gen antibiotik yang diintegrasikan bersama-sama dengan gen interes tersebut (Amirhusin 2004). Pada penelitian ini telah dilakukan seleksi dan verifikasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 dengan menggunakan metode seleksi antibiotik dan PCR.
Tujuan
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2011 sampai Juli 2012 di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB, Bogor.
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan adalah biji padi transgenik generasi T1 no 3.1; 4.1 dan K4 yang telah ditransformasi dengan kandidat gen toleransi Al yang dikonstruksi pada plasmid pGWB5-B11 (Lampiran 1) dan biji padi transgenik generasi T2 no. 39 dan 44 yang telah ditransfomrasi dengan kandidat gen toleran Al yang dikonstruksi pada plasmid pBIN-11 (Lampiran 2) dan biji tanaman non transgenik.
Metode
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada Media Seleksi Antibiotik.
Biji tanaman padi transgenik generasi T1 dan T2 diseleksi pada media seleksi antibiotik secara aseptik pada media padat dan cair. Biji disterilisasi dengan merendamnya dalam larutan Bayclean (20% v/v) ditambah 2 tetes Tween-80 selama 20 menit, kemudian dilanjutkan dengan pembilasan dengan air steril sebanyak 3 kali (Zainati 2010). Selanjutnya biji ditanam pada media padat Murashige and Skoog (Lampiran 3) ditambah 25-100 mg/L Kanamisin atau 20 mg/L Higromisin selama 6 hari. Pada seleksi menggunakan media cair percobaan dilakukan dengan merendam biji padi dalam 20 ml akuades steril ditambah 25mg/L Paromomisin selama 6 hari. Kemudian biji diinkubasi pada suhu ruang dengan kondisi pencahayaan 16 jam terang dan 8 jam gelap. Kemampuan kecambah padi yang tahan terhadap antibiotik diamati pada hari ke-6. Biji dari tanaman non transgenik disertakan sebagai pembanding dalam seleksi. Jumlah biji yang berkecambah dan tumbuh normal serta biji yang tidak berkecambah dihitung dan digunakan sebagai kriteria keberhasilan integrasi kandidat gen toleransi Al ke dalam tanaman transgenik generasi T1dan T2.
Penanaman di Rumah Kaca
Sebanyak 31 kecambah tanaman T1 dan T2 yang tahan antibiotik kemudian ditanam di rumah kaca pada pot yang berisi media tanah:kompos dengan perbandingan 3:1 (b/b). Tanaman dipelihara dengan mengikuti praktek pemeliharaan padi sawah. Pengamatan karakter pertumbuhan dilakukan sejak tanaman berumur 21 hari sampai minggu ke-8. Peubah yang diamati meliputi tinggi tanaman dan jumlah anakan.
Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan teknik isolasi cepat (Miftahudin et al. 2004). Daun padi muda dan segar berumur 4 minggu digerus dalam N2-cair. Kemudian ditambah buffer lisis ( SDS 2%, glisin 0.1M, NaCl 0.05M EDTA pH 8 0.01M) dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipipet, ditambah PCIAA (Phenol, Chloroform dan Iso Amyl Alchohol), dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Selanjutnya supernatan dipipet, ditambah CIAA (Chloroform dan Iso Amyl Alchohol), dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Lalu supernatan dipipet kembali dan ditambah isopropanol, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 15000 rpm selama 5 menit. Pelet DNA dibilas dengan Etanol 70% dan sentrifugasi kemudian dikeringanginkan. Kuantitas DNA diukur menggunakan spektrofotometer UV, sedangkan kualitas DNA diamati dengan menggunakan teknik elektroforesis pada 1% gel agarose dalam 1x buffer TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), dengan tegangan 65 volt selama 30 menit. Larutan DNA yang telah diperoleh disimpan pada suhu -20 oC sampai saatnya digunakan untuk analisis.
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR
100 ng DNA padi, 1x penyangga PCR, 0.2 mM masing-masing dNTPs, 0.4 μM masing -masing primer, 1 Unit Taq DNA Polymerase dan dH2O sampai volume akhir reaksi 20 μl. Program PCR yang digunakan adalah 94°C selama 5 menit (pra-denaturasi), kemudian dilanjutkan dengan 94°C selama 30 detik (denaturasi), 56°C selama 30 detik (penempelan primer), dan 72°C selama 1,5 menit (pemanjangan) yang diulang sebanyak 35 siklus dan diakhiri dengan 72°C selama 10 menit. Hasil PCR dielektroforesis pada 1% gel agarose dalam 1x buffer TBE dengan tegangan 70 volt selama 45 menit. Pita DNA kemudian diwarnai dengan pewarna ethidium bromide 5 μg/ml dan diamati di atas UV transluminator.
Analisis Data
Data segregasi biji transgenik dianalisis menggunakan uji khi-kuadrat pada taraf uji α=5%
HASIL
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada Media Seleksi Antibiotik.
Pada tahap seleksi dengan antibiotik higromisin dengan menggunakan media padat (media agar) dan cair, semua tanaman transgenik dan tanaman non transgenik yang ditumbuhkan pada media seleksi dengan konsentrasi 20 mg/L, tidak mampu berkecambah sampai hari ke 6.
Seleksi berikutnya dilakukan pada media antibiotik kanamisin dengan menggunakan media padat dan cair dengan beberapa konsentrasi dimulai dari konsentrasi 25, 50, dan 100 mg/L. Media seleksi kanamisin dengan konsentrasi 25 mg/L dan 50 mg/L, tidak mamu menyeleksi tanaman putatif transgenik. Baik transgenik dan non
transgenik mampu berkecambah pada media kanamisin dengan konsentrasi tersebut. Peningkatan konsentrasi terus dilakukan hingga konsentrasi 100 mg/L. Pada tingkat konsentrasi 100 mg/L dari 364 benih padi yang terdiri dari 115 tanaman nontransgenik dan 249 tanaman transgenik terseleksi, namun terjadi gejala albinisma, sehingga hasil seleksi tidak dapat digunakan untuk analisis selanjutnya. Hasil seleksi dengan antibiotik kanamisin konsentrasi 100 mg/L disajikan pada Tabel 1 dan 2.
Pada seleksi dengan antibiotik kanamisin konsentrasi 100 mg/L, tanaman non transgenik tidak menghasilkan akar (Gambar 1A), sedangkan tanaman transgenik menghasilkan kecambah normal tetapi menunjukkan gejala albinisma (Gambar 1B).
Untuk menghindari albinisma pada hasil seleksi antibiotik, digunakan antibiotik alternatif yang memiliki fungsi yang sama dengan kanamisin, yaitu paromomisin. Tanaman putatif transgenik kemudian diseleksi dengan antibiotik paromomisin dengan konsentrasi 25 mg/L. Seleksi dengan antibiotik paromomisin dilakukan dengan media cair. Pada teknik ini selain pertumbuhan kecambah lebih cepat, juga tidak membutuhkan teknik aseptik. Hasil percobaan pada media paromomisin menunjukkan bahwa tanaman putatif transgenik dapat terseleksi dengan baik. Hanya tanaman yang membawa gen nptII yang tahan terhadap media seleksi dan tumbuh normal (Tabel 1).
Sebanyak 74 benih padi yang terdiri dari 16 tanaman non transgenik dan 58 tanaman transgenik diseleksi pada media cair dengan menggunakan antibiotik paromomisin dengan konsentrasi 25 mg/L. Hasil seleksi dengan antibiotik paromomisin disajikan pada Gambar 2 dan Tabel 3.
A B
Tabel 1 Hasil perkecambahan biji dengan antibiotik higromisin, kanamisin dan paromomisin pada dua jenis media berbeda
Media Antibiotik
Higromisin Kanamisin Paromomisin
Media padat Tidak tumbuh Tumbuh, albino - Media cair Tidak tumbuh Tumbuh, albino Tumbuh, normal
Tabel 2 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan 100 mg/L Kanamisin
Gambar 2 Perkecambahan biiji pada media seleksi antibiotik paromomisin: A. Non transgenik tidak berkecambah B. Tanaman transgenik T1 berkecambah normal.
Biji tanaman non transgenik yang dikecambahkan pada media yag diberi perlakuan antibiotik paromomisin tidak mampu berkecambah, sedangkan biji tanaman transgenik generasi T1 dan T2 berkecambah (Gambar 2). Pada Gambar 3 terlihat perbedaan perkecambahan tanaman transgenik dengan menggunakan antibiotik paromomisin (Gambar 3A) dan kanamisin (Gambar 3B). Pada media paromomisin hasil seleksi menunjukkan perkecambahan normal dengan tunas yang berwarna hijau, sedangkan pada media kanamisin terjadi gejala albinisma pada kecambah.
Hasil uji khi-kuadrat pada Tabel 4 menunjukkan bahwa tanaman T1 nomor 3.1 dan T2 nomor 39 menunjukkan segregasi model pewarisan gen tunggal dengan rasio
kecambah tahan antibiotik terhadap peka antibiotik 3:1 (nilai χ2 hitung lebih kecil dari χ2
tabel).
Pertumbuhan Tanaman Transgenik.
Tabel 3 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan
Gambar 3 Perbedaan pertumbuhan kecambah padi pada dua jenis antibiotik. A Kecambah normal pada media antibiotik paramomisin, B Kecambah albino pada media antibiotik
kanamisin. Garis skala =0,5 cm untuk A dan 1 cm untuk B
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR.
Hasil PCR padi transgenik generasi T1 dengan primer spesifik gen nptII disajikan pada Gambar 4. Visualisasi dengan elektroforesis menunjukkan pita DNA tanaman transgenik memiliki posisi migrasi sama atau sejajar dengan pita hasil PCR plasmid rekombinan (kontrol positif). Pita tersebut merupakan hasil amplifikasi gen nptII dengan ukuran sesuai dengan yang diharapkan, yaitu 600 pb. Dengan demikian hasil tersebut menunjukkan bahwa gen nptII telah berhasil disisipkan ke dalam kromosom tanaman transgenik. Diharapkan gen toleransi Al juga telah tersisipkan pada kromosom tanaman tersebut.
PEMBAHASAN
Tabel 5 Karakter pertumbuhan tanaman non transgenik dan tanaman transgenik
A B C D E F G
Gambar 4 Hasil amplifikasi DNA generasi T1 dengan menggunakan primer nptII : A. Kontrol negatif; B. Tanaman non transgenik; C. Tanaman transgenik no T1- 3.1; D. T1-4.1; E. T1-K4; F. Plasmid Pembawa Konstruk Gen; G. Penanda DNA 100 pb.
Dalam seleksi menggunakan antibiotik higromisin hasil menunjukkan tidak adanya tanaman yang mampu berkecambah baik menggunakan media padat (agar) maupun media cair. Ada beberapa hal yang menyebabkan tidak terjadinya perkecambahan biji pada media higromisin. Pertama, bisa terjadi karena gen hpt, yaitu gen yang menyandikan antibiotik higromisin tidak masuk ke dalam tanaman pada saat proses transformasi sehingga tidak ada gen yang menyandikan antibiotik pada saat perkecambahan pada media seleksi. Dalam proses transformasi ada tiga komponen penting yang terlibat. Pertama adalah gen virulen kromosom, yang terdapat pada kromosom Agrobacterium dan berfungsi dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman. Kedua, gen virulen (vir) yang terdapat dalam plasmid Ti dan menpunyai fungsi untuk menginduksi dan integrasi T-DNA. Komponen ketiga adalah daerah T-DNA. Daerah T-DNA, dibatasi oleh LB (left border) dan RB (right border) yang mengandung gen penting bagi Agrobacterium. Proses transformasi dimulai dengan melekatnya Agrobacterium pada sel tanaman. Kemudian gen-gen terinduksi pada daerah vir oleh suatu
signal yang spesifik di dalam sel bakteri sehingga dihasilkan produk dari ekspresi gen-gen virulen untuk memproses T-DNA dan mentransfernya dari dalam sel bakteri. Proses dan transfer T-DNA dimediasi oleh berbagai protein yang dikode oleh gen virulen. Pembentukan T-kompleks berfungsi untuk menjaga T-DNA dalam perjalanannya menuju inti sel tanaman inang (Rahmawati 2006). Kemungkinan hal yang dapat menyebabkan kesalahan dalam proses transformasi adalah pada daerah T-DNA yang dibatasi oleh LB dan RB (daerah yang membawa gen) yang tidak dapat masuk dalam tanaman sel inang.
Pendapat lain juga menyatakan bahwa tanaman transgenik yang tidak mampu mengekspresikan ketahanan higromisin atau terseleksi dalam media higromisin padahal tanaman tersebut tidak membawa gen penyandi hpt akan menunjukkan gejala nekrotik, serupa dengan tanaman non transgenik. Pada kasus yang demikian diduga telah terjadi mekanisme pembungkaman gen hpt. (Mulyaningsih et al. 2010). Mekanisme pembungkaman gen dalam proses transformasi genetik dapat terjadi pada berbagai proses. Pembungkaman gen dapat terjadi pada fase transkripsi dan pasca transkripsi. Pembungkaman pada tahap transkripsi diidentifikasi oleh ketiadaan transkrip dari gen tersebut. Sedangkan pembungkaman gen pada pasca transkripsi terjadi karena gen tersebut mengandung sekuen yang homolog (Lucy et al.2000).
Berbeda dengan hasil dari Roslim (2009) yang melakukan transformasi plasmid pGWB5-B11 ke tanaman tembakau tidak menunjukkan adanya gejala albinisma pada tanaman yang terseleksi. Pada tanaman padi seleksi kanamisin dengan konsentrasi 100 mg/L memberikan gejala albinisma. Diduga warna putih pada kecambah yang terseleksi antibiotik kanamisin disebabkan oleh penghambatan antibiotik terhadap metabolisme sel tumbuhan. Penghambatan proses metabolisme oleh antibiotik disebabkan oleh pengikatan ribosom 30S yang menyebabkan terjadinya kesalahan translasi mRNA. Pada tumbuhan, ribosom 30S berada pada organel kloroplas dan mitokondria. Pada kloroplas pengikatan antibiotik pada ribososm 30S menyebabkan rusaknya klorofil dan menghambat pembentukan asam amino (Braun & Bennett 2001).
Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi kemampuan atau efektifitas bahan kimia yang digunakan untuk seleksi tanaman adalah bahan-bahan penyeleksi tersebut bersifat toksik untuk sel tanaman, sehingga mungkin hal inilah yang menyebabkan albinisma. Jadi toksin yang paling efektif adalah toksin yang menghambat pertumbuhan sel-sel nontransforman secara berlahan-lahan. Tekanan seleksi akan optimal apabila menggunakan konsentrasi toksin yang paling rendah yang mampu membunuh jaringan nontransforman. Akan tetapi pada penelitian ini, seleksi padi transgenik dengan konsentrasi kanamisin yang rendah tidak mampu menekan perkecambahan biji padi nontransgenik (Mulyaningsih et al. (2010).
Daboussi et al. (1989) menyebutkan gen tahansi antibiotik umumnya mengkode suatu enzim yang dapat menginaktifkan suatu antibiotik, sehingga tanaman transgenik yang membawa gen tersebut menjadi tahan terhadap antibiotik. Oleh karena itu, salah satu ciri keberhasilan sisispan gen gen asing yang umumnya dikombinasikan dengan gen antibiotik sebagai alat seleksi pada tanaman adalah apabila planlet atau biji hasil transformasi menunjukkan tahansi terhadap antibiotik.
Dalam penelitian ini ditunjukkan bahwa antibiotik kanamisin tidak sesuai untuk seleksi padi transgenik. Hail ini juga sesuai yang dikatakan oleh Jefferson (1999) bahwa antibiotik kanamisin tidak efektif sebagai penanda untuk seleksi tanaman kacang-kacangan dan famili Gramineae, seperti padi. Seleksi dengan antibiotik paromomisin lebih baik dalam menyeleksi tanaman transgenik. Hal ini sesuai dengan Riva et al. (2006) yang mengatakan bahwa hanya sel yang memiliki kontruksi plasmid gen penyandi antibiotik yang dapat tumbuh, sedangkan sel nontransforman yang tidak memiliki kontruksi plasmid-gen penyandi antibiotik tidak dapat tumbuh.
Hasil uji khi-kuadrat (Tabel 4) menunjukkan bahwa semua nomor tidak bersegregasi pewarisan gen tunggal, kecuali nomor T1-3.1 dan T2-39 yang bersegregasi dengan perbandingan 3:1 untuk sifat tahan dan peka terhadap antibiotik. Hal ini mengindikasikan bahwa penyisisipan gen nptII hanya terjadi satu copy gen dalam satu tempat kromosom padi. Diharapkan nomor T1-3.1 dan T2-39 tersebut juga hanya membawa satu copy gen B11 dan dapat digunakan untuk analisis selanjutnya sehingga bisa dikembangkan menjadi galur padi transgenik yang toleran Al
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
bukan transgenik. Tanaman transgenik generasi T1 nomor 3.1 membawa satu copy gen nptII, dan diharapkan juga membawa satu copy gen B11.
Saran
Perlu dilakukan verifikasi sisipan gen pada tanaman transgenik dengan menggunakan kombinasi primer dari promotor 35S dan primer dari toleran aluminium yang dintroduksikan ke genom tanaman padi.
DAFTAR PUSTAKA
Amirhusin B. 2004. Perakitan Tanaman Transgenik Tahan Hama. J Lit Per 23:1-7
Bashir K, Rafiq M, Fatima T, Husnain T, and Riazuddin. 2004. Hygromycin based selection of transformants in a local inbred line of Zea mays (L). Pakistan J Biol Sci 7:318-323.
Braun R, Bennett DJ. 2001. Antibiotic tahance in genetically modified (GM) crops. EFB Task Group Pub Prec Biotec 10:1-4.
[BPS] Badan Pusat Statistik. Produksi Padi Indonesia. 2011. Jakarta: Badan pusat statistika.
Daboussi MJ, Djeballi A, Gerlinger C, Blaiseau PL, Bouvier I. 1989. Transformation of seven species of filamentous fungi using the nitrate reductase gene of Aspergillus nidulans. Curr Genet 15: 453-456.
Ismunadji M, Partohardjono S. 1985. Program hasil penelitian pengapuran tanah masam untuk peningkatan produksi tanaman pangan. Balittan. Puslitbangtan.
Jefferson RA. 1999. Method for selecting transformed cells. Australia: Patentlens
Kochian LV. 1995. Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46: 237-260.
Karama AS dan Abdurachman A. 1993. Optimasi pemanfaatan sumberdaya lahan berwawasan lingkungan. Prosiding Simposium Penelitian Tanaman Pangan. III. Puslitbangtan. Badan Litbang pertanian, Departemen Pertanian. Bogor 23-25 Agustus. Hlm. 98-112
Lucy AP, Guo H, Li W, Ding SW. 2000. Suppresion of post transcriptional gen silencing by a plan viral protein localized in nucleus. EMBO J 19:1672-1680
Miftahudin, Scoles GJ, Gustafson JP. 2004. Development of PCR-based codominant markers flanking the Alt3 gene in rye. Genome 47:231-238.Roslim DI. 2009. Isolasi dan karakterisasi kandidat gen toleran aluminium pada padi. Makalah Seminar Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.
Miftahudin, Chikmawati T, dan Pardal SJ. 2010. Pengembangan galur padi toleran aluminium melalui rekayasa genetika. Laporan Penelitian Riset Insentif Terapan. LPPM. IPB.
Mulyaningsih ES, Aswidinnoor H, Sopandie D, Pieter BF Ouwerkerk dan Loedin IHS. 2010. Pewarisan gen hpt (Hygromycine phosphotransferase) berdasarkan analisis PCR dan ekspresinya pada populasi padi transforman mengoverekpresikan gen HD ZIP OSHOX-6. Berita Biologi 10: 59-66
Purwoko BS, Hanarida I, Dewi IS, and
Rahmawati H. 2006. Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi Menggunakan Transformasi Agrobacterium. Jurnal Agro Biogen 2:36-44.
Rashid H, Yokoi S, Toriyama K, and Hinata K. 1996. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in Indica rice. Plant Cell 15:727-730.
Riva GA, Cabrera JG, Padron RV, and Pardo CA. 2006. The Agrobacterium tumefasiens gene Transfer to Plant Cell. [terhubung berkala] www.ejbiotechnology.info, [26 Juni 2012].
Roslim DI. 2011. Isolasi dan karakterisasi gen toleran aluminium dari tanaman padi [disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana. Insitut Pertanian Bogor.
Zainati F. 2010. Induksi Embriogenesis somatik pada padi varietas IR64 dan Situ Bagendit. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Insitut Pertanian Bogor.
Lampiran 3 Komposisi larutan MS (Murashige & Skoog) dan vitamin B5
Komposisi larutan MS
Kode Senyawa Konsentrasi stok(mg/L) Final konsentrasi(mg/L)
A NH4NO3 82500 1650
B KNO3 95000 1900
C CaCl2.2H2O 88000 440
D H3BO3 KH2PO4 CoCl2.6H2O Na2MoO4.2H2O KI
1240 34000
5.2 50 166
6.2 170 0.026
0.25 0.83 E MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O
74000 3010.8 1720
5.2
370 22.3 8.6 0.025 F Na-EDTA
FeSO4.7H2O
74.4 5.56
37.2 27.8
Komposisi vitamin B5
Komponen Konsentrasi stok (mg/L) Final konsentrasi (mg/L)
Myo-inositol 10000 100
Thiamine-HCl 1000 10
Nicotinic acid 100 1
Pyridoxine-HCl 100 1`
Lampiran 1 Konstruk vektor pGWB5-B11_573bp (Roslim, 2011)
NptII : gen tahan kanamisin HPT : gen tahan Higromisin
GFP : reporter green fluorescence protein
LB 35S CaMV HPT Tnos Tnos Gen B11_573 bp 35S CaMV RB
HindIII
pGWB5 pGWB5
GATEWAY Cassette
SacI
attB1 attB2
GFP Tnos NptII Pnos
XbaI
Lampiran 2 Konstruk vektor ekspresi pBIN F = pBIN HB_500bp (Pambudi, 2012)
RB Tnos Gen B11_500 bp 35S CaMV Pnos Gen nptII LB
(tahansi kanamisin) Tg7
AscI HindIII
ClaI
pBD80 pBD80
PmeI
SalI XbaI
BamHlI
ApaI PspOMI
Acc65I KpnI
EcoRI PacI
Bsu36I VspI
DraIII
