Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi Kekeringan

ANALISIS MOLEKULER DAN FENOTIPE GALUR PADI

TRANSGENIK IR64 GENERASI T

3

YANG MENGANDUNG

PENANDA AKTIVASI UNTUK TOLERANSI KEKERINGAN

HABIB VIO NANDA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi Kekeringanadalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Maret 2015

ABSTRAK

HABIB VIO NANDA. Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi Kekeringan. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO HAMISENO dan TRI JOKO SANTOSO.

Padi transgenik cv. IR64 penanda aktivasi telah dikembangkan dengan cara mengintroduksikan konstruk penanda aktivasi transposon Ac/Ds. Tanaman padi transgenik tersebut belum dianalisis fenotipenya yang berkaitan dengan toleransi cekaman kekeringan. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi galur-galur tanaman padi transgenik cv. IR64 generasi T3 yang menunjukkan toleransi terhadap kekeringan. Metode seleksi tanaman dilakukan dengan menumbuhkan tanaman padi, menguji toleransinya terhadap kekeringan, mendeteksi keberadaan gen bar dan hpt, dan mengidentifikasi perubahan karakter agronomisnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebanyak 33 dari 84 tanaman diketahui toleran terhadap kekeringan. Setelah dilakukan analisis PCR diperoleh sebanyak 23 tanaman positif mengandung gen bar dan mengindikasikan mutan yang stabil. Secara umum, tanaman padi transgenik cv. IR64 generasi T3 mengalami perubahan karakter agronomis jika dibandingkan dengan tanaman nontransgenik. Sebanyak sembilan tanaman mengalami peningkatan tinggi tanaman, sebanyak enam tanaman memiliki umur panen lebih cepat, dan sebanyak 21 tanaman memiliki bobot 100 butir gabah isi yang lebih tinggi dari tanaman nontransgenik.

Kata kunci: Padi (Oriza sativa L.), penanda aktivasi, toleran kekeringan

ABSTRACT

HABIB VIO NANDA. Molecular and Phenotipic Analysis of

T

3

Generation

Transgenic Rice cv. IR64 Containing Activation Tagging Construct for Tolerance to Drought Stress. Supervised by DJAROT SASONGKO HAMISENO and TRI JOKO SANTOSO.

nine plants increased of its height, six plants had a faster harvesting time, and 21 plants had higher weight of 100 seeds compared by non-transgenic plants.

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

pada

Departemen Biokimia

ANALISIS MOLEKULER DAN FENOTIPE GALUR PADI

TRANSGENIK IR64 GENERASI T

3

YANG MENGANDUNG

PENANDA AKTIVASI UNTUK TOLERANSI KEKERINGAN

HABIB VIO NANDA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul Skripsi : Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi Kekeringan

Nama : Habib Vio Nanda NIM : G84100054

Disetujui oleh

Dr Djarot Sasongko Hamiseno, MS Pembimbing I

Dr Tri Joko Santoso, MSi Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, M App Sc Ketua Departemen

PRAKATA

Puji dan syukur penulis limpahkan hehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa atas segala rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul “Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi Kekeringan”.

Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Djarot Sasongko H. MS dan Dr Tri Joko Santoso, MSi selaku dosen pembimbing yang telah memberikan saran, kritik, dan bimbingannya selama penyusunan karya ilmiah. Selain itu, terima kasih juga penulis sampaikan kepada teman-teman Biokimia 47 dan semua pihak yang telah membantu kelancaran penelitian ini.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan karya ilmiah ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dan berguna dalam penulisan ini. Penulis juga berharap karya tulis ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Bogor, Maret 2015

DAFTAR ISI

ABSTRAK iv

PRAKATA iv

DAFTAR ISI v

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

PENDAHULUAN 1

METODE 2

Bahan 2

Alat 3

Prosedur Penelitian 3

HASIL 6

PEMBAHASAN 11

SIMPULAN DAN SARAN 14

Simpulan 14

Saran 14

DAFTAR PUSTAKA 14

LAMPIRAN 17

DAFTAR TABEL

1 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun menggulung) 4 2 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun mengering) 4

3 Kuantitas dan kemurnian DNA daun padi 8

4 Tanaman yang dapat pulih setelah perlakuan cekaman kekeringan 9 5 Tinggi tanaman padi IR64 transgenik generasi T3 10

6 Umur panen padi IR64 transgenik generasi T3 10

7 Bobot 100 butir gabah tanaman padi IR64 transgenik generasi T3 11

DAFTAR GAMBAR

1 Vektor penanda aktivasi berdasarkan transposon 2 2 Kecambah biji padi yang ditambah dengan larutan basta 6 3 Kecambah biji padi di dalam trey tanpa perlakuan basta 7

4 Tanaman padi sebelum perlakuan kekeringan 7

5 Tanaman padi setelah perlakuan kekeringan selama 8 hari 8 6 Amplifikasi PCR padi transgenik menggunakan primer gen hpt 9 7 Amplifikasi PCR padi transgenik menggunakan primer gen bar 10

DAFTAR LAMPIRAN

1 Bagan alir penelitian 17

PENDAHULUAN

Tanaman padi telah banyak digunakan sebagai model dalam penelitian untuk mendapatkan padi yang memiliki sifat unggul. Hal ini dilakukan untuk meningkatkan produksi ataupun kualitas padi seperti yang diinginkan (Mulyaningsih et al. 2010). Salah satu sifat unggul yang diinginkan ada pada tanaman padi yaitu toleransi tanaman terhadap cekaman abiotik, seperti kekeringan. Kekeringan berpengaruh buruk terhadap pertumbuhan tanaman dan dapat menurunkan produktivitas tanaman sebesar 70% (Bray et al. 2000). Dalam kondisi kekurangan air, tanaman harus memiliki sistem pertahanan untuk menanggapi cekaman kekeringan agar dapat bertahan hidup (Widyasari et al. 2004). Mengatasi masalah tersebut, penggunaan tanaman padi yang toleran terhadap kekeringan merupakan langkah sederhana yang dapat dilakukan (Lestari dan Mariska 2006). Tanaman padi yang toleran terhadap kekeringan ini dapat dikembangkan melalui teknik rekayasa genetika. Proses isolasi dan identifikasi terkait gen yang toleran terhadap kekeringan dapat dilakukan, sehingga fungsi dari gen-gen tersebut dapat dipelajari lebih lanjut (Santoso et al. 2013).

Berdasarkan penjelasan Trijatmiko et al. (2005), bahwa proses identifikasi terkait fungsi suatu gen dapat dilakukan dengan dua pendekatan, yaitu forward genetics dan reverse genetics. Pendekatan forward genetics dilakukan dengan menguji perbedaan fenotipe tanaman mutan dengan tipe liar atau melakukan skrining populasi mutan over ekspresi dengan teknik penanda aktivasi (activation tagging), selanjutnya dilakukan analisis fungsi gen dari tanaman mutan kemudian dilanjutkan ke sekuen gennya. Pendekatan reverse genetics dilakukan dengan berpedoman dari informasi sekuen gen yang telah diketahui (Sisharmini et al. 2009; Santoso et al. 2013).

Penelitian ini menggunakan sampel tanaman padi transgenik kultivar IR64 yang diketahui mengandung vektor penanda aktivasi. Penanda aktivasi adalah potongan DNA yang dapat meningkatkan ekspresi gen-gen di daerah sekitar insersi. Vektor penanda aktivasi berdasar transposon yang digunakan dalam penelitian ini adalah pAc-DsATag-Bar-gosGFP (Gambar 1) (Trijatmiko et al. 2005). Vektor penanda aktivasi ini mengandung dua elemen. Elemen pertama, yaitu elemen Ac (activator) yang mengkode enzim transposase di bawah kontrol promotor Ac. Elemen kedua, yaitu elemen Ds (dissociation) berisi elemen 4x enhancer dari promotor 35S CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) dan gen yang menyandi ketahanan terhadap basta di bawah kendali promotor Ubiquitin (Sisharmini 2009). Transposon Ac/Ds dapat diidentifikasi menggunakan gen hpt dan gen bar. Gen hpt merupakan marka penyeleksi yang mengidentifikasi keberadaan transposon Ac, sedangkan gen bar merupakan marka penyeleksi untuk mengidentifikasi keberadaan transposon Ds (Marsch-Martinez et al. 2002).

2

Gambar 1 Vektor penanda aktivasi berdasarkan transposon yang terdiri atas 2 elemen, yaitu Ac dan Ds. Keterangan: Elemen Ac (bawah) dan elemen Ds (atas) pada daerah T-DNAnya (Trijatmiko et al. 2005).

Populasi tanaman padi transgenik kultivar IR64 dibentuk dengan cara mengintroduksikan konstruk penanda aktivasi transposon Ac/Ds ke dalam genom tanaman padi IR64 dengan bantuan A. tumefaciens. Populasi tersebut sudah diketahui positif mengandung konstruk penanda aktivasi, namun belum diketahui perubahan karakternya akibat aktivasi dari sisipan konstruks tersebut. Karakter agronomis suatu tanaman dapat diamati berdasarkan sifat yang tampak secara visual. Identifikasi karakter agronomi dalam penelitian ini meliputi tinggi tanaman, jumlah malai produktif, umur panen, dan bobot 100 butir (Sisharmini et al. 2013). Populasi tanaman padi transgenik kultivar IR64 generasi T3 diindikasikan mengandung individu yang memiliki sifat beraneka ragam sebagai akibat dari insersi transposon Ac/Ds (Marsch-Martinez et al. 2002).

Penelitian ini bertujuan mengevaluasi galur-galur tanaman padi transgenik varietas IR64 generasi T3 yang mengandung elemen transposon penanda aktivasi yang tahan terhadap cekaman kekeringan. Penelitian ini diharapkan dapat memperoleh galur-galur yang toleran terhadap cekaman kekeringan sehingga dapat langsung dikembangkan menjadi varietas tanaman baru. Selain itu, galur-galur tanaman padi toleran kekeringan dapat digunakan sebagai materi tanaman untuk mengidentifikasi dan mengisolasi gen-gen yang terkait dengan toleransi terhadap kekeringan.

METODE

Bahan

3 pirolidon (PVP), dan merkaptoetanol), larutan TE (Tris-EDTA), DNA hasil PCR, 2x KAPA2G Fast, primer hpt dan bar, cetakan DNA, DMSO, ddH2O, bubuk agarosa, Gel Red, loading dye, 1x bufer TAE, dan marker 1 kb (0.1 µg/µL).

Alat

Alat-alat yang digunakan adalah microfuge, pipet mikro, neraca analitik, autoklaf, vorteks, UV Illuminator ChemiDoc EQ Biorad, elektroforesis, erlenmeyer, kertas aluminium, penangas air, microwave, gelas ukur, mesin PCR Bio-Rad 100.

Prosedur Penelitian

Seleksi Benih Padi Menggunakan Larutan Basta (Santoso et al. 2013)

Sebanyak 30 galur padi transgenik dan kontrol, masing-masing 20 biji terhadap basta. Kecambah yang tahan terhadap basta akan tumbuh, sedangkan yang tidak tahan terhadap basta pertumbuhannya akan terhambat. Setelah 6 hari, kecambah yang tumbuh dipindahkan kedalam pot yang berisi media tanah:pasir dan pupuk (1:1:1).

Penumbuhan padi tanpa perlakuan basta (Santoso et al. 2013)

Varietas padi yang digunakan adalah varietas IR64 transgenik penanda aktivasi generasi T3, yang memiliki gen mutan dari hasil transformasi transposon Ac/Ds, serta kontrol yang digunakan adalah varietas IR64, cabacu, gajah mungkur, dan IR20. Sebanyak 60 benih diambil dari tiap varietas. Benih di oven selama semalam pada suhu 50 oC. Benih padi kemudian ditanam menggunakan tray dengan media yang terdiri atas tanah, pasir, dan pupuk (1:1:1). Setiap lubang tray berisi 5 benih padi. Benih tersebut disiram dengan air secukupnya pada pagi dan sore hari hingga tumbuh tunas.

Perlakuan Toleransi Kekeringan (Santoso et al. 2013)

4

Tabel 1 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun menggulung pada fase vegetatif)

Skor/Skala Keterangan

0 Daun-daun sehat

3 Daun-daun melipat (sangat berbentuk huruf V)

5 Daun betul-betul kuncup (membentuk huruf U)

7 Ujung-ujung daun bersentuhan (bentuk O)

9 Daun menggulung ketat

Tabel 2 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun mengering pada fase vegetatif)

Skor/Skala Keterangan

0 Tidak ada gejala

1 Ujung daun sedikit mengering

3 Ujung daun mengering sampai ¼ panjang dari semua daun

5 ¼ sampai ½ dari semua daun betul-betul kering

7 Lebih dari 2/3 dari semua daun betul-betul kering

9 Tanaman mati

Isolasi DNA daun padi (Doyle & Doyle 1987)

Sampel yang digunakan untuk isolasi adalah daun padi mutan varietas IR64. Daun padi dipanen dengan mengambil daun padi yang masih muda. Daun padi kemudian dimasukkan ke dalam tabung effendorf yang telah diberi label dan ditempatkan di dalam cool box. Daun padi yang sudah dipanen selanjutnya digerus. Penggerusan dilakukan dengan merendam tabung effendorf yang berisi daun padi dengan nitrogen cair supaya daun membeku, dan dihaluskan dengan menggerus daun dengan sumpit di dalam tabung tersebut. Daun yang sudah halus kemudian ditambah dengan buffer CTAB 1000 µL. Buffer CTAB dengan kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel.

Tahap selanjutnya dilakukan proses inkubasi selama 15 menit di dalam penangas air dengan suhu 65 oC. Tahapan ini dilakukan untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstrak yang ditambahkan ke dalam sampel. Sebanyak 100 µL Na-asetat dan 1000 µL larutan Chisam ditambahkan ke dalam suspensi, selanjutnya dilakukan sentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Na-asetat adalah senyawa yang berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-potassium asetat-protein-debris sel. Suspensi bagian atas kemudian dipisahkan ke dalam tabung baru yang telah diberi label. Ke dalam tabung ditambahkan Na-asetat sebanyak 1/10 dan isopropanol sebanyak 2/3 dari rata-rata suspensi yang diambil dari hasil sentrifus. Penambahan isopropanol yang berfungsi untuk pengendapan protein dan dilanjutkan proses presipitasi DNA dengan menggunakan etanol yang berfungsi sebagai penghilang pengotor.

5 Pengukuran kuantitas dan kemurnian DNA (Thermo Fisher Scientific 2009)

Ekstrak DNA padi hasil isolasi diukur konsentrasinya dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop. Volume yang digunakan untuk pengukuran pada nanodrop sebanyak 1 µL. Larutan blanko yang digunakan adalah buffer TE sebanyak 1 µL. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan untuk mengetahui kemurnian ekstrak DNA dilakukan dengan menggunakan perbandingan absorbansi 260/280 (A260/280).

Kalibrasi nanodrop harus dilakukan sebelum digunakan untuk pengukuran sampel DNA. Buffer TE sebanyak 1 µL ke dalam pedestal dan ditutup kembali. Toolbar blank ditekan dan tunggu hingga tertulis masukkan sampel. Sampel dimasukkan sebanyak 1 µL ke dalamnya dan tekan tombol F1. Tombol reports diklik dan dilanjutkan dengan tombol exports, print, graph, dan print ke Microsoft XPS document writer.

Menurut Brown (2001) DNA yang murni mempunyai nilai absorbansi 260 dibagi dengan nilai absorbansi 280 (A260/280) berkisar 1.8 hingga 2.0. Apabila nilainya kurang dari 1.8 maka sampel DNA masih mengandung kontaminan protein dan untuk menghilangkannya ditambahkan proteinase. Apabila nilainya lebih dari 2.0 maka sampel DNA masih mengandung kontaminan RNA, dan untuk menghilangkannya ditambahkan ribonuklease.

DNA yang telah diperoleh dari hasil isolasi dan telah dilakukan uji kuantitatif selanjutnya diencerkan. Pengenceran yang dilakukan adalah pengenceran 10 kali dan dibuat stok sebanyak 50 µL. Stok DNA yang diperoleh diambil sebanyak 5 µL dan ditambahkan dengan Nuclease Free Water (NF) sebanyak 45 µL ke dalam tube 0.5 mL.

Amplifikasi DNA menggunakan PCR (Sambrook et al. 2001)

Amplifikasi gen tanaman padi mutan yang toleran terhadap kekeringan dilakukan dengan menggunakan primer hpt dan bar. Amplifikasi PCR dilakukan pada volume total reaksi 10 µ l yang mengandung 1 µl DNA genomik cetakan, ddH2O sebanyak 2.5 µL, 5 µL 2X Kapa 2G, 0.5 µL sepasang primer spesifik masing-masing dengan konsentrasi 5 µ M, dan 0.5 µL DMSO.

Setiap reaksi dilakukan pada tabung mikro 200 µl. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan program sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 3 menit sebanyak 1 siklus, dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri atas denaturasi pada suhu 95 ºC selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 63ºC selama 15 detik, pemanjangan primer pada suhu 72 oC selama 20 detik. Pemanjangan primer terakhir selama 7 menit pada suhu 72 oC. Produk PCR (amplikon) kemudian dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa.

Elektroforesis gel agarosa (Sambrook et al. 2001)

6

PCR disertakan juga DNA standar (1 kb) sebagai pembanding. Sampel dielektroforesis dengan tegangan 95 volt selama kurang lebih 40 menit.

Analisis Karakter Agronomi (Sisharmini et al. 2013)

Analisis karakter agronomi ini dilakukan dengan mengamati tinggi tanaman, bobot 100 butir, dan umur panen padi. Tinggi tanaman padi diukur mulai dari pangkal batang di atas permukaan tanah hingga ujung daun tertinggi. Tinggi tanaman padi ini dapat digolongkan ke dalam tiga golongan, yaitu tinggi (>130 cm), sedang (110-130 cm), dan rendah (<110cm) (Departemen Pertanian 2003). Umur panen padi dihitung dari hari mulai tanam sampai gabah matang penuh (hari setelah tanam). Penggolongan umur panen berdasarkan Samaullah (2009), yaitu ultra genjah (<90 hari), sangat genjah (90-104 hari), genjah (105-124 hari), sedang (125-150 hari), dan dalam (>150 hari). Penghitungan bobot 100 butir dilakukan dengan menghitung dari berat 100 biji isi.

HASIL

Penumbuhan Padi IR64 Transgenik T3 dan Seleksi benih pada Larutan basta

Benih padi yang berhasil berkecambah setelah dilakukan seleksi dengan perlakuan basta berjumlah 200 benih dengan persentase rata-rata sebesar 42.97% (Lampiran 2). Sebanyak 6 kecambah dari 200 benih yang berkecambah tersebut berhasil tumbuh di pot sampai masa perlakuan kekeringan. Galur padi yang tumbuh tersebut adalah galur 4.12.1.19, galur 5.3.2.21, dan galur 5.3.2.40. Seleksi benih padi dengan perlakuan basta dapat dilihat pada Gambar 2. Sementara itu, benih yang berkecambah tanpa perlakuan basta terdapat 680 benih dan yang ditumbuhkan di pot sebanyak 320 kecambah (sebanyak 300 kecambah padi transgenik dan 20 kecambah padi kontrol). Dari 320 kecambah tersebut, sebanyak 78 tanaman (sebanyak 72 kecambah padi transgenik dan 6 kecambah padi kontrol) yang berhasil tumbuh di pot sampai masa perlakuan kekeringan (dapat dilihat pada Lampiran 3).

Gambar 2 Kecambah biji padi yang ditambah dengan larutan basta (a) Kontrol tanpa basta; (b) Kontrol dengan basta;

7

Gambar 3 Kecambah biji padi di dalam tray tanpa perlakuan basta Kuantitas dan kemurnian DNA

Jumlah sampel yang diuji kualitas dan kuantitasnya sebanyak 34 sampel. Kemurnian DNA yang diperoleh dari pengujian berada pada rentang 1.92-2.00. nilai kemurnian ini diperoleh dari perbandingan antara nilai absorbansi 260 dengan nilai absorbansi 280 (Brown 2001). Sementara itu, kemurnian DNA yang diperoleh berkisar antara 132.80-2106.90 ng/µL. Hasil pengujian kuantitas dan kemurnian DNA ini dapat dilihat pada Tabel 3.

Galur Padi IR64 Transgenik yang Toleran terhadap Kekeringan

Hasil pengujian menunjukkan bahwa terdapat 34 tanaman dari 84 tanaman padi IR64 yang diuji merupakan tanaman toleran terhadap kekeringan (Tabel 4). Tanaman yang toleran tersebut terdiri atas galur IR64 (kontrol), 4.5.1.4, 4.5.1.6, 4.5.1.14, 4.5.1.37, 4.5.2.14, 4.5.2.19, 4.12.1.19, 4.12.2.13, 4.12.2.14, 5.3.2.21, 5.3.2.24, 5.3.2.40, 5.3.8.26, 5.3.8.30, dan 5.3.8.31. Tanaman yang toleran kekeringan dapat dilihat dari kemampuan recovery (pulih) setelah dilakukan cekaman kekeringan selama 8 hari perlakuan. Penampakan tanaman padi setelah dilakukan perlakuan kekeringan selama 8 hari perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.

Keberadaan gen hpt dan bar Menggunakan Teknik PCR

Pengujian ini dilakukan terhadap 34 sampel tanaman. Sebanyak 10 sampel tanaman positif mengandung gen hpt dan gen bar, sedangkan 23 sampel tanaman positif mengandung gen bar dan tidak mengandung gen hpt (Lampiran 5). Keberadaan gen hpt dan bar ini ditunjukkan adanya amplikon masing-masing berukuran 500 bp (dapat dilihat pada Gambar 6 dan Gambar 7).

8

Gambar 5 Tanaman padi setelah perlakuan kekeringan selama 8 hari. (a) Kontrol dan (b) Sampel

Tabel 3 Kuantitas dan kemurnian DNA daun padi

Galur Konsentrasi (ng/µL) A260 A280 A260/A280

9 Tabel 4 Tanaman yang dapat pulih setelah perlakuan cekaman kekeringan

Galur Jumlah tanaman yang diberi

perlakuan kekeringan

10

Gambar 7 Amplifikasi PCR tanaman padi transgenik menggunakan primer bar. Keterangan: M= marker, P= plasmid, K= kontrol negatif, E= 4.5.1, F= 4.5.2, G= 4.12.1, H= 4.12.2, I= 5.3.2, J= 5.3.8.

Karakter Agronomi Galur Padi IR64 transgenik generasi T3

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa tinggi tanaman padi berada pada kelompok sedang dan rendah. Jumlah tanaman padi pada kelompok sedang adalah 9 tanaman (27.27%) dan kelompok rendah berjumlah 24 tanaman (72.73%) (Tabel 5). Umur panen juga menghasilkan dua kelompok umur, yaitu umur genjah dengan jumlah 6 tanaman dan umur sedang dengan jumlah 27 tanaman (Tabel 6). Sementara itu, untuk bobot 100 butir gabah terdapat tiga kelompok. Sebanyak 2 tanaman memiliki bobot antara 0-0.99 gram, sebanyak 10 tanaman memiliki bobot anatara 1.00-1.99 gram, dan sebanyak 21 tanaman memiliki bobot antara 2.00-3.00 gram (Tabel 7). Data hasil pengamatan karakter agronomi padi IR64 untuk setiap individu dapat dilihat pada Lampiran 6.

Tabel 5 Tinggi tanaman padi IR64 transgenik generasi T3

Galur Tinggi tanaman (cm) Jumlah tanaman Persentase (%) IR64 transgenik

penanda aktivasi

Rendah (<110) 24 72.73

Sedang (110-130) 9 27.27

Tinggi (>130) - -

IR64 nontransgenik 84 cm

Tabel 6 Umur panen padi IR64 transgenik generasi T3

Galur Umur panen (hari) Jumlah tanaman Persentase (%)

IR64 transgenik penanda aktivasi

Ultragenjah (<90) - -

Sangat genjah (90-104) - -

Genjah (105-124) 6 18.18

Sedang (125-150) 27 81.82

Dalam (>150) - -

11 Tabel 7 Bobot 100 butir gabah tanaman padi IR64 transgenik generasi T3

Galur Bobot 100 butir (g) Jumlah tanaman Persentase (%) IR64 transgenik

Penumbuhan Padi IR64 Transgenik T3 dan Seleksi

Benih dengan Perlakuan Basta

Hasil pengujian ketahanan tanaman padi IR64 terhadap herbisida Basta disajikan pada Lampiran 2. Sebanyak 456 kecambah yang diberi perlakuan basta (kecambah direndam dengan larutan basta konsentrasi 200 mg/L), diperoleh 200 tanaman yang tahan terhadap basta. Hal ini ditandai dengan mulai munculnya daun dari benih yang berkecambah (Gambar 2c). Namun dari 200 tanaman yang tahan terhadap basta tersebut, hanya diperoleh sebanyak 6 tanaman yang tumbuh di pot sampai masa perlakuan kekeringan. Hal ini dapat disebabkan oleh faktor lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan tanaman padi, seperti suhu dan tanah. Menurut Suwarto dan Farid (2004), peningkatan suhu dapat mengakibatkan kelembaban tanah berkurang, sehingga penyerapan unsur hara pada tanaman dapat berkurang. Hal ini dapat dikaitkan dengan keadaan rumah kaca untuk penumbuhan padi yang digunakan dalam penelitian ini, karena suhu di dalam rumah kaca tersebut mencapai 40 oC.

Proses seleksi dengan larutan basta dilakukan untuk mendapatkan tanaman yang tahan terhadap herbisida basta, karena tanaman ini mengandung gen katahanan terhadap basta. Seperti yang diketahui, padi hasil konstruk rakitan penanda aktivasi yang digunakan dalam penelitian ini selain mengandung elemen 4× enhancer, juga membawa gen ketahanan terhadap herbisida basta (Santoso et al. 2013). Sehingga dapat diketahui bahwa sebanyak 6 tanaman yang tumbuh tersebut positif mengandung gen ketahanan terhadap basta. Ketahanan terhadap herbisida Basta merupakan ekspresi dari gen bar yang telah terintegrasi dan terekspresi pada tanaman yang diuji.

Skrining dengan larutan Basta juga telah dilakukan oleh Sisharmini et al. (2009) menggunakan teknik pengolesan daun padi dengan larutan Basta. Teknik ini dilakuakan dengan mengoleskan larutan basta ke ujung daun padi. Ketahanan padi transgenik terhadap basta ditandai dengan tidak terbakarnya daun setelah pengolesan, sementara padi yang tidak tahan akan terbakar. Skrining ketahanan terhadap basta dengan cara merendam benih saat perkecambahan lebih baik dibandingkan dengan pengolesan, karena tanaman padi yang tahan (membawa gen bar) akan diketahui lebih awal. Di samping itu, skrining lebih akurat karena benih dapat kontak langsung dengan larutan basta, sementara teknik pengolesan hanya dilakukan pada ujung daun dan diduga respon ketahanannya akan dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti pencahayaan dan suhu.

12

diperoleh sebanyak 72 tanaman padi transgenik dan 6 padi nontarnsgenik yang tumbuh sampai masa perlakuan (Lampiran 3). Tanaman yang tumbuh tersebut belum diketahui ketahanan terhadap herbisida basta, sehingga perlu dilakukan analisis PCR untuk mengetahui keberadan gen bar di dalam genom tanaman.

Galur Padi IR64 Transgenik yang Toleran terhadap Kekeringan Tanaman yang mampu pulih dan bertahan hidup ketika mendapat cekaman kekeringan dikatakan sebagai tanaman toleran terhadap kekeringan (Santoso et al. 2013). Perlakuan kekeringan dalam penelitian ini dilakukan selama 8 hari. Menurut Widyasari et al. (2004), ciri tanaman yang mengalami cekaman kekeringan dapat dilihat dari perubahan pada organ daun yang mengering ataupun layu. Selama proses perlakuan, dilakukan penilaian terhadap perubahan pada organ daun tanaman padi. Hal ini dilakukan untuk melihat ketahanan tanaman terhadap cekaman kekeringan. Klasifikasi penilaian tanaman yang tanggap terhadap kekeringan dapat dilihat pada Tabel 1 dan Tabel 2.

Hasil perlakuan kekeringan dari 80 sampel tanaman transgenik penanda aktivasi dan 4 tanaman kontrol, diperoleh sebanyak 34 tanaman yang toleran terhadap kekeringan (Lampiran 4). Tanaman yang peka terhadap kekeringan akan tampak berwarna coklat dan mengering serta anakannya terlihat patah, sedangkan tanaman yang toleran akan kembali menghijau setelah dilakukan penyiraman (Gambar 5). Kontrol padi yang digunakan sebagai pembanding (padi tipe liar) seperti IR20, Gajah Mungkur, dan Cabaccu tidak mengalami pemulihan, sedangkan untuk kontrol IR64 masih dapat pulih setelah dilakukan penyiraman.

Harahap et al. (1995) menjelaskan bahwa gajah mungkur dan cabaccu merupakan varietas yang termasuk padi toleran kekeringan dan sering digunakan sebagai pembanding untuk daya tembus akar padi. Tanaman padi IR64 nontransgenik yang mampu pulih setelah dilakukan perlakuan kekeringan dapat disebabkan oleh waktu yang digunakan untuk proses seleksi tidak cukup untuk menekan pertumbuhan tanaman tersebut. Selain itu, dapat disebabkan oleh perbedaan morfologi dan fisiologi sehingga tanaman tidak mudah untuk kehilangan air selama tercekaman kekeringan (Moctava et al. 2013).

Menurut Yakushiji et al. (1998), cekaman kekeringan akan berpengaruh terhadap aspek pertumbuhan tanaman yang mencakup aspek morfologis, fisiologi, dan biokimia tanaman. Adanya cekaman kekeringan dalam setiap pertumbuhan dan perkembangan tanaman dapat menurunkan hasil yang disebabkan adanya hambatan pertumbuhan dan produktivitas tanaman. Tanaman padi hasil seleksi yang menunjukkan sifat toleran terhadap kekeringan, kemudian tanaman dipindahkan ke ember berisi tanah dan dirtumbuhkan sampai memiliki daun untuk bahan analisis molekuler. Selanjutnya dilakukan perbandingan karakter agronomi antara kontrol dengan padi transgenik penanda aktivasi.

13 gen bar. Gen hpt berfungsi sebagai marka untuk mengidentifikasi keberadaan transposon Ac dan gen bar untuk mengidentifikasi transposon Ds.

Konfirmasi keberadaan transposon Ac/Ds perlu dilakukan untuk mengetahui keberhasilan transfomasi pada sampel tanaman padi generasi T3, serta untuk menentukan kestabilan mutan tersebut. Sallaud et al. (2004) menyatakan bahwa tanaman padi mutan dikatakan stabil apabila tanaman hanya mengandung elemen Ds namun tidak disertai oleh elemen Ac. Keberadaan elemen Ac akan menghasilkan enzim transposase, sehingga mampu bertransposisi yang menyebabkan elemen Ds tidak stabil berada dalam genom sehingga masih dapat berpindah-pindah.

Hasil PCR menggunakan gen bar (Gambar 7) menunjukkan bahwa 33 sampel tanaman padi transgenik penanda aktivasi mengandung gen bar. Adanya gen bar ini diindikasikan oleh keberadaan amplikon DNA yang berukuran 500 bp. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam genom padi IR64 transgenik mengandung elemen Ds. Sementara itu, untuk analisis PCR menggunakan gen hpt (Gambar 6), diperoleh 10 tanaman yang positif mengandung gen hpt yang ditunjukkan oleh amplikon DNA berukuran 500 bp. Hal ini menunjukkan bahwa 10 tanaman tersebut masih mengandung elemen Ac di dalam genom padi tersebut. Sebanyak 10 tanaman yang positif terhadap gen hpt, juga positif terhadap gen bar (Tabel 5). Jadi, dapat dinyatakan bahwa di dalam genom tanaman tersebut mengandung elemen Ac dan juga mengandung elemen Ds, sehingga elemen Ds yang terdapat di dalam genom belum stabil karena masih memungkinkan elemen ini untuk bertransposisi.

Karakter Agronomi Galur Padi IR64 Transgenik Generasi T3

Pengamatan karakter agronomi ini dilakukan dengan membandingkan padi IR64 transgenik penanda aktivasi dengan padi IR64 tipe liarnya. Tinggi tanaman IR64 tipe liar adalah 84 cm yang termasuk kategori rendah. Menurut Suprihatno et al. (2009), tinggi tanaman padi IR64 berkisar antara 80-100 cm. Hasil pengamatan tinggi tanaman menunjukkan bahwa sebanyak 24 tanaman padi IR64 transgenik penanda aktivasi memiliki tinggi tanaman yang tergolong rendah, dan sebanyak 9 tanaman yang termasuk kategori sedang (Tabel 5). Dari pengamatan tersebut diperoleh bahwa terjadi perubahan karakter tinggi tanaman padi IR64 penanda aktifasi, yaitu 9 tanaman yang tinggi tanamannya termasuk kategori sedang. Perubahan karakter tinggi tanaman tersebut dapat dikarenakan adanya insersi konstruk penanda aktivasi (Santoso et al. 2013).

14

diduga adanya pengaruh insersi konstruk penanda aktivasi pada bagian gen yang berkaitan dengan sifat kegenjahan pada padi.

Penghitungan bobot 100 butir merupakan salah satu parameter untuk mengukur produktivitas tanaman padi. Pada penelitian ini bobot 100 butir digolongkan dalam tiga kategori (Tabel 7). Bobot 100 butir tanaman padi IR64 transgenik paling banyak terdapat antara 2.00-3.00 g dengan persentase 63.64%, sedangkan bobot 100 butir padi nontransgenik adalah 1.93 g. Bobot 100 butir gabah paling tinggi dari tanaman padi IR64 transgenik adalah 2.35 g. Dari populasi tanaman yang diamati, diperoleh 2 tanaman (6.06%) yang tidak menghasilkan biji isi atau hampa, dan sebanyak 10 tanaman bobot 100 butir gabah isinya diantara 1.00-1.99 g. Berdasarkan hasil tersebut, padi IR64 transgenik masih memiliki produktivitas yang lebih baik dibandingkan dengan padi IR64 nontransgenik.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Tanaman padi IR64 transgenik generasi T3 yang diketahui toleran terhadap kekeringan sebanyak 33 dari 84 tanaman. Analisis PCR yang dilakukan terhadap tanaman padi yang toleran kekeringan, diperoleh sebanyak 10 tanaman mengandung gen hpt dan bar yang mengindikasikan adanya transposon Ac dan Ds di dalam genom tanaman tersebut. Selain itu, juga diperoleh sebanyak 23 tanaman yang hanya mengandung gen bar dan mengindikasikan adanya transposon Ds yang stabil. Secara umum, tanaman padi transgenik cv. IR64 generasi T3 mengalami perubahan karakter agronomis jika dibandingkan dengan tanaman nontransgenik. Sebanyak sembilan tanaman mengalami peningkatan tinggi tanaman, sebanyak enam tanaman memiliki umur panen lebih cepat, dan sebanyak 21 tanaman memiliki bobot 100 butir gabah isi yang lebih tinggi dari tanaman nontransgenik.

Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mempelajari fungsi gen-gen yang terkait perubahan fenotipe padi transgenik yang toleran terhadap kekeringan. Evaluasi lebih lanjut ketahanan tanaman transgenik yang stabil terhadap kekeringan perlu dilakukan.

DAFTAR PUSTAKA

[BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS.

15 Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists, Rockville. Pp1158-1249.

Departemen Pertanian. 2003. Panduan Sistem Karakterisasi dan Evaluasi Tanaman Padi. Komisi Nasional Plasma Nutfah. Bogor. 68 hlm.

Doyle J.J and Doyle J.L. 1987. A Rapid DNA Isolation Procedure for Small Quantities of Fresh Leaf Tissue. Phytochem. Bull. 19:11-15.

Harahap Z, Suwarno, E Lubis, TW Susanto. 1995. Padi Unggul Toleran Kekeringan dan Naungan. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan Bogor. 21 hlm.

International Rice Research Institute. 1996. Standard evaluation system for rice. 4th ed, IRTO, IRRI. Los Banos, Philippines. 54p.

Lestari EG dan Mariska I. 2006. Identifikasi Somaklon Padi Gajahmungkur, Towuti dan IR 64 Tahan Kekeringan Menggunakan Polyethylene Glycol. Bul. Agron. 35(2):71-78.

Marsch-Martinez N, R Greco, GV Arkel, LH Estrella, A Pereira. 2002. Activation tagging using the En-Imaize transposon system in Arabidopsis. Plant Physiol 129:1544-1556.

Moctava MA, Koesriharti, M. Dawam. 2013. Respon Tiga Varietas Sawi (Brassica rapa L.) terhadap Cekaman Air. Jurnal Produksi Tanaman. 1(2):90-98.

Mulyaningsih ES, H Aswidinnoor, D Soepandi, PBF Ourwerkerk, S Nugroho, IH Slamet Loedin. 2010. Perbandingan Tiga Metode Transformasi AgrobacteriumUntuk Pencarian Gen-gen Terkait Toleransi Kekeringan Menggunakan Transposon Ac/Ds pada padi cv. Batutegi. Jurnal Biologi Indonesia 6(3):367-381.

Santoso TJ, A Apriana, A Sisharmini, KR Trijatmiko. 2013. Identifikasi Galur dan Gen-gen Terkait Toleran Kekeringan pada Padi Transgenik cv. T309 yang Mengandung Vektor Penanda Aktivasi. Jurnal AgroBiogen 9(3): 97-106.

Samaullah Y. 2009. Indeks pertanaman padi IP 400 strategi, kebijakan, program dan uji coba [terhubung berkala]. http://www.litbang.deptan.go.id/press/ one/18/pdf/indeks%20 (20 Desember 2014).

Sambrook J, DW Russell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed-3. New York: Coldspring Harbor Laboratory Press.

Silitongga TS, Somantri IH, Daradjat AA, Kurniawan H. 2003. Panduan Sistem Karakterisasi dan Evaluasi Tanaman Padi. Departemen Pertanian. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Komisi Nasional Plasma Nutfah. 58h.

Sisharmini A. 2009. Penanda Aktivasi: Sebuah Pendekatan untuk Analisis Fungsi Gen pada Padi. Warta Biogen 5:4-6.

16

Lokal Sulawesi cv. Asemandi dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens. Jurnal AgroBiogen 5(2):49-56.

Sisharmini A, A Apriana, Diah N, TJ Santoso, KR Trijatmiko. 2013. Identifikasi Perubahan Karakter Agronomis Padi Transgenik Penanda Aktivasi cv. Asemandi Generasi T1. Jurnal AgroBiogen 9(3):107-116.

Suprihatno B, Daradjat A, Satoso, Baehaki, Widiarta, Setyono A, Indrasari DS, Lesmana. 2009. Deskripsi Varietas Padi. Subang: Balai Besar Penelitian Tanaman Padi, Departemen Pertanian.

Suwarto dan Farid N. 2004. Studi beberapa karakter morfologi dan fisiologi lima genotipe padi gogo toleral naungan. Agronomika 4(1): 49-58.

Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User Manual. Wilmington: Thermo Fischer Scientific.

Trijatmiko KR, Gv Arkel, A Karaba, Ev Enckevort, and A Pereira. 2005. Activation tagging using En-I and Ac-Ds maize transposon systems in rice. In Comparative Analysis of Drought Resist-ance Genes in Arabidopsis and Rice. Ph.D. Thesis Wageningen University, Wageningen, The Netherland with Summaries in English, Dutch and Indonesian. p. 111-128.

Widyasari WB, Bambang S, Cahya I, Kabul W, Untung M. 2004. Isolasi dan Analisis Gen Yang Responsif terhadap Cekaman Kekeringan pada Tebu. Berk. Penel. Hayati 9:69-73.

17

LAMPIRAN

Lampiran 1 Bagan alir penelitian

Penumbuhan benih padi

Perlakuan kekeringan

Analisis molekuler Analisis karakter agronomi (fenotipe)

Isolasi DNA

Tinggi tanaman PCR dengan

marka hpt dan bar

Umur panen Elektroforesis gel

agarosa

18

19 Lampiran 3 Benih tanaman padi transgenik IR64 yang tumbuh tanpa perlakuan

20

Lampiran 4 Hasil seleksi tanaman padi yang toleran cekaman kekeringan dengan perlakuan kekeringan selama 8 hari

21

* tanaman yang tahan terhadap herbisida basta ** tanaman kontrol

22

Lampiran 5 Keberadaan gen hpt dan bar dalam tanaman transgenik IR64 generasi T3

* tanamanyang tahan terhadap herbisida basta

23 Lampiran 6 Hasil pengamatan karakter agronomi padi transgenik penanda

aktivasi hasil seleksi kekeringan

Galur Tinggi

24

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Dharmasraya, Sumatera Barat pada tanggal 01 Desember 1992 dari ayah bernama Suratno dan ibu bernama Epi Kustianti. Penulis merupakan anak kedua dari 4 bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 1 Sitiung, Sumatera Barat, pada tahun 2010. Pada tahun yang sama, penulis meneruskan pendidikan di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Selama masa perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Biokimia Umum Tahun ajaran 2012/2013. Pada tahun 2013, penulis melaksanakan praktik lapangan di Laboratorium Biologi Molekuler, BB Biogen,