ANALISIS KERAGAMAN PATI PADA TANAMAN SAGU
(
Metroxylon sagu
) DENGAN TEKNIK RAPD
IFROH JATIDIRI MEDIA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu (Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015
ABSTRAK
IFROH JATIDIRI MEDIA. Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu (Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD. Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan ASMINI BUDIANI.
Riset terkait pengembangan sagu secara molekuler masih tertinggal padahal Indonesia memiliki sumber genetik sagu yang beragam. Sumber genetik tersebut merupakan aset bagi pemuliaan tanaman yang menghasilkan karakter tanaman yang unggul. Tujuan dari penelitian ini adalah menganalisis pola RAPD pada tanaman sagu yang memiliki kadar pati tinggi dan kadar pati rendah. Tahapan penelitian terdiri atas ekstraksi pati empulur sagu, isolasi DNA daun sagu dan amplifikasi DNA daun sagu secara RAPD. Sebanyak 45 primer digunakan untuk melihat pola RAPD sagu berkadar pati tinggi dan rendah. Primer yang mampu membedakan pola RAPD sagu berkadar pati tinggi dan rendah antara lain primer OPA1, OPA 17, OPA18, OPA19, OPA20, OPB2, OPB4, OPB10, OPJ1, OPJ 5, dan OPJ8.
Kata kunci: Sagu, pati, RAPD, primer
ABSTRACT
IFROH JATIDIRI MEDIA. Analysis Starch Diversity in Sago Plant (Metroxylon sagu) by RAPD Technique. Supervised by MEGA SAFITHRI and ASMINI BUDIANI.
Reseach about sago’s development in molecular still left behind whereas Indonesia has genetic diversity source of Sago. Source genetik is an aset for plant glorification that can produce good character. The objective of this reseach is to analysis RAPD Pattern in sago that has high starch content and low starch content. There were some treatments in this research, they were extraction sago stach from pith, isolation DNA of leaf sago DNA and amplification leaf sago DNA by RAPD. It’s about 45 primers used for looking differences RAPD Pattern of high starch and low starch sago. Primers that can different RAPD Pattern of high starch and low starch sago are primer OPA1, OPA 17, OPA18, OPA19, OPA20, OPB2, OPB4, OPB10, OPJ1, OPJ 5, and OPJ8.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
ANALISIS KERAGAMAN PATI PADA TANAMAN SAGU
(
Metroxylon sagu
) DENGAN TEKNIK RAPD
IFROH JATIDIRI MEDIA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu (Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD
Nama : Ifroh Jatidiri Media NIM : G84100077
Disetujui oleh
Dr Mega Safithri, SSi MSi Pembimbing I
Dr Asmini Budiani, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr I Made Artika, MAppSc Ketua Departemen
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan degan baik. Karya ilmiah diberi judul “Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu (Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD”.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama pelaksanaan penelitian maupun penulisan karya ilmiah, antara lain: Dr. Mega Safithri, SSi MSi selaku pembimbing I yang selalu memberi bimbingan dan dukungan agar penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah tepat waktu, Dr. Asmini Budiani, MSi selaku pembimbing II yang memberi bimbingan dan kesempatan penulis untuk melakukan penelitian di Balai Penelitian dan Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Ungkapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada orang tua penulis yaitu Bapak M Buang Jamil dan Ibu Mutayanah serta Teh Umi, Ka Fauji dan Taruna yang selalu mendoakan dan memberi motivasi agar penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan baik. Yayasan beasiswa Karya Salemba Empat yang telah membantu penulis dalam hal finansial selama kuliah di IPB. Teh Rini, Teh Niyyah, Mba Emi dan Ica yang mengajari penulis selama di Laboratorium Biomolekuler. Layyinah, Irna, Regina, Resti dan Dimas yang membuat lab semakin ramai sehingga penulis merasa nyaman selama penelitian. Tidak lupa untuk teman-teman satu angkatan biokimia 47 selaku teman seperjuangan yang selalu mendukung satu sama lain.
Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun atas karya ilmiah ini sehingga dapat berguna bagi penulis sendiri khususnya maupun pembaca umumnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat demi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Januari 2015
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL iv
DAFTAR GAMBAR iv
DAFTAR LAMPIRAN iv
PENDAHULUAN 1
METODE 2
Alat 2
Bahan 2
Metode 2
HASIL 5
Kadar air empulur sagu 5
Kadar pati empulur sagu 6
Kuantitas dan kualitas DNA daun sagu 6
Elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu 7
PEMBAHASAN 9
Kadar air empulur sagu 9
Kadar pati empulur sagu 10
Kuantitas dan kualitas DNA daun sagu 11
Elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu 11
SIMPULAN DAN SARAN 12
Simpulan 12
Saran 13
DAFTAR PUSTAKA 12
LAMPIRAN 15
DAFTAR GAMBAR
1 Kadar air empulur sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014 5 2 Kadar pati empulur sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014 6 3 Kualitas DNA daun sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014 7 4 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan
primer OPA1, 3, 6, 7, 8, dan 10
8 5 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPA11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19 dan 20
8 6 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPB 1 ,2 ,3 ,4 ,7 , 8 , 10,11, 12, dan 20
8 7 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPJ 1,3-6, 7,810
9 8 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPD 4, 5, 7, 8, OPN 6- 9
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Alur penelitian
15
2 Kadar air empulur sagu bulan Maret 2014
16
3 Kadar air empulur sagu bulan Juli 2014
17
4 Contoh perhitungan kadar air
18
5 Kurva standar D-glukosa bulan Maret 2014
18
6 Kurva standar D-glukosa bulan Juli 2014
19
7 Absorbansi empulur sagu bulan Maret 2014
19
8 Absorbansi empulur sagu bulan Juli 2014
20
9 Kadar pati empulur sagu bulan Maret 2014
20
10 Kadar pati empulur sagu bulan Juli 2014
21
11 Contoh Perhitungan kadar pati
21
20
PENDAHULUAN
Sagu (Metroxylon sp) adalah tumbuhan suku palma yang batangnya dapat menghasilkan pati. Produktivitas pati sagu lebih tinggi dibandingkan tanaman penghasil karbohidrat lain. Sagu mampu menghasilkan pati kering 10-25 ton/ha/tahun sedangkan pati kering jagung hanya 5,5 ton/ha/tahun, produktivitas pati kering padi 6 ton/ha/tahun, dan produktivitas pati kering ubi kayu dan kentang adalah 10-15 ton/ha/tahun (Sumaryono 2007). Sagu mampu memberikan pati yang lebih murah karena daya hasil yang lebih tinggi dibanding tanaman lain sehingga harganya amat bersaing (Bujang dan Adeni 2000).
Kebutuhan pati bagi industri dunia saat ini sekitar 50 juta ton per tahun dengan laju pertumbuhan 7,7% per tahun (Jong et al. 2007). Pati digunakan sebagai bahan dasar berbagai macam industri diantaranya sebagai bahan untuk pembuatan roti, biskuit, mi, sohun, kerupuk dan lain sebagainya (Polnaya 2006) sehingga produksinya di dunia terus meningkat dalam beberapa dasawarsa terakhir. Sekitar 50% tanaman sagu dunia atau 1.128 juta ha sagu tumbuh di Indonesia dan 90% dari 1.128 juta ha atau 1.015 juta ha berkembang di Provinsi Papua dan Maluku (Lakuy dan Limbongan 2003).
Penelitian tentang pemuliaan tanaman sagu belum banyak dilakukan padahal Indonesia memiliki sumber genetik sagu yang beragam,yang merupakan aset penting bagi pemuliaan tanaman. Pemuliaan tanaman mampu menghasilkan karakter yang unggul pada sagu seperti mampu memproduksi pati tinggi, tidak berduri, dan memiliki rasa yang enak namun proses pemuliaan tanaman membutuhkan waktu yang lama, oleh karena itu dibutuhkan teknologi yang mampu mengatasi masalah tersebut. Berkembangnya teknologi marka molekuler menjadikan proses karakterisasi keanekaragaman genetik tanaman dapat dilakukan dengan mudah dan lebih cepat (Pandin 2009). Menurut Setyowati (2013), perbedaan karakter seperti beda kadar pati merupakan indikasi adanya keragaman genetik yang sangat bermanfaat untuk pemuliaan tanaman.
Beberapa teknik telah dikembangkan teknik yang dapat membantu para pemulia untuk mempercepat proses seleksi. Salah satu teknik penanda molekuler yang telah digunakan untuk melihat pola keragaman sebagai upaya untuk mempermudah proses pemuliaan tanaman adalah Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). RAPD digunakan untuk mengidentifikasi genotipe tanaman karena memiliki beberapa kelebihan dalam pelaksanaan dan analisisnya (Suryanto 2003). Kelebihan RAPD adalah prosedurnya lebih mudah, murah, cepat, sampel DNA yang diperlukan sedikit (0.5-50 ng) dan tidak memerlukan radioisotop (Sharma et al. 2008).
2
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret sampai September 2014. Pelaksanaan penelitian bertempat di Laboratorium Biomolekuler Balai Penelitian dan Bioteknologi Perkebunan Indonesia Bogor.
Alat
Alat yang digunakan adalah oven, desikator, sentrifus Eppendorf 5804 R, blender, vorteks, spektrofotometer NanoDrop, spektrofotometer Multiscan Go, mesin PCR Esco APB10, Geldoc Alphamager Mini, elektroforesis set, timbangan, dan peralatan pendukung lainnya.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah empulur sagu, daun sagu, polivinil pirolidon (PVP), nitrogen cair, buffer ekstraksi, β-merkaptoetanol, kloroform:isoamilalkohol, TE, isopropanol, natrium asetat, etanol absolut, etanol 70%, nuclease free water, RNAse, loading dye, gel red, agarose, marker lambda DNA, marker 1 kb plus DNA Ladder, Tris borat EDTA (TBE), buffer MgCl2,
dNTP, primer, Taq DNA polimerase, akuades, asam perklorat, asam sulfat, kertas saring, anthrone, es, dan standar D-glukosa.
Metode Penelitian
Preparasi Sampel Daun Sagu
Sampel sagu yang digunakan dalam penelitian berasal dari Parung. Sampel diambil pada bulan Maret 2014 dan Juli 2014. Sampel daun sagu diberi kode sampel 1, 2 ,3 dan 4. Pemberian kode bertujuan untuk memudahkan analisis saat diberi perlakuan.
Daun tanaman sagu yang diprediksi memiliki kadar pati berbeda dipotong-potong lalu digerus dalam mortar dengan ditambahkan nitrogen cair dan ± 0,1 gram PVP. Daun yang telah menjadi serbuk disimpan dalam freezer untuk digunakan dalam isolasi DNA.
Preparasi Sampel Empulur Sagu
3
Penetapan Kadar Air (AOAC 2000)
Pengukuran kadar air empulur sagu dilakukan pada bulan Maret 2014 dan Juli 2014 sebagai bulan (waktu) pengambilan sampel. Cawan dimasukan ke dalam oven pada suhu 105 oC selama 3 jam. Cawan didinginkan dalam desikator selama 30 menit lalu bobotnya ditimbang. Sebanyak 2 gram empulur yang telah dihaluskan dimasukkan ke dalam cawan Petri yang telah diketahui bobotnya, kemudian dikeringkan dalam oven bersuhu 105 °C sampai bobotnya konstan. Setelah itu dibiarkan dalam desikator dan ditimbang.
Pembuatan Kurva Standar (SNI 1998)
D-glukosa 1000 ppm disiapkan kemudian dibuat variasi konsentrasi dari stok D-glukosa 1000 ppm. Variasi konsentrasi D-glukosa yang digunakan adalah 50, 100, 150, 200, 250, dan 300 ppm. Variasi konsentrasi dibuat dengan cara mengambil larutan D-glukosa 1000 ppm dengan volume 50, 100, 150, 200, 250, dan 300 µl kemudian ditambah akuades hingga totalnya 1000 µl atau 1 mL. Larutan glukosa standar ditambah 10 mL pereaksi anthrone 0.1% (dilakukan dalam wadah berisi es) lalu dikocok hingga homogen. Campuran divortex lalu dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100 ºC selama 7.5 menit kemudian dibiarkan pada suhu ruang. Larutan diukur pada panjang gelombang 630 nm dengan spektrofotometer UV-visible.
Kadar Pati (Tjasadihardja 1987)
Sebanyak 100 mg empulur yang sudah dikeringkan ditimbang kemudian ditambah 2 mL akuades. Campuran divortex kemudian diinkubasi pada suhu 100 °C selama 15 menit (sesekali dikocok) kemudian campuran dibiarkan pada suhu ruang. Campuran ditambah asam perklorat 9.2 N sebanyak 2 mL kemudian didiamkan selama 15 menit (sesekali dikocok). Campuran ditambah akuades hingga menjadi 10 mL. Campuran disentrifus pada kecepatan 15.000 rpm selama 15 menit. Pelet dipisahkan dengan supernatannya. Pelet ditambah asam perklorat 4.6 N sebanyak 2 mL kemudian didiamkan selama 15 menit (sesekali dikocok). Campuran ditambah akuades hingga menjadi 10 mL. Campuran disentrifus pada kecepatan 15.000 rpm selama 15 menit. Supernatan pada sentrifus kedua diambil lalu digabung dengan supernatan pada sentrifus pertama. Campuran supernatan ditera 50 mL kemudian disaring. Sebanyak 0.2 mL sampel diambil dan ditambah 0.8 mL akuades kemudian ditambahkan 10 mL pereaksi anthrone 0.1% (dilakukan dalam wadah berisi es). Campuran ini dikocok lalu dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100 ºC selama 7.5 menit kemudian dibiarkan pada suhu ruang. Larutan diukur pada panjang gelombang 630 nm dengan spektrofotometer Multiscan Go.
Isolasi DNA (Orozco-Castillo 1994)
-4
merkaptoetanol yang telah dipanaskan 65 ºC. Larutan divortex kemudian dipanaskan 65 °C selama 30 menit (dikocok setiap 10 menit sekali). Sampel kemudian dibiarkan pada suhu ruang. Sampel ditambah 5 mL kloroform:isoamilalkohol 24:1 lalu divortex hingga homogen. Larutan disentrifus dengan kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus yang baru. Supernatan ditambahkan kloroform:isoamilalkohol 24:1 sebanyak satu volume, kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan ditambah isopropanol dingin sebanyak satu volume kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Pelet diambil lalu dikeringkan. Pelet ditambah 1 mL senyawa Tris-EDTA kemudian ditambah CH3COONa 3 M 1/10 V dan etanol
absolut 2.5 mL. Campuran dikocok dan disimpan pada suhu -20 °C selama 30 menit atau semalam. Sampel kemudian disentrifus dengan kecepatan 11.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 °C. Pelet diambil lalu ditambahkan etanol 70%. Pelet didinginkan dengan speed vacum DNA. Pelet ditambahkan 100 µl nuclease free water kemudian ditambahkan RNAse 25 µg/ mL. DNA diuji kuantitas dengan spektrofotometer NanoDrop dan diuji kualitasnya dengan elektroforesis.
Uji Kuantitas dan Kualitas DNA
Kuantitas DNA daun sagu dilakukan dengan mengukur konsentrasi sampel dengan spektrofotometer NanoDrop pada panjang gelombang 260 nm, 280 nm dan 230 nm dengan batas kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280 dan A260/A230.
Kualitas DNA daun sagu divisualisasikan melalui elektroforesis gel agarosa. Sebanyak 0.24 gram agarose ditimbang lalu dilarutkan dengan buffer TBE 0.5x sebanyak 30 mL. Campuran ini kemudian dipanaskan di dalam microwave pada suhu 70 °C selama 1.5 menit. Selanjutnya, ditambahkan gel red 1.5 µl ke dalam campuran lalu digoyang-goyang hingga campuran homogen. Campuran ini kemudian dituang ke dalam cetakan gel elektroforesis. Campuran dibiarkan hingga mengeras (30 menit). Setelah gel mengeras, gigi-gigi pencetak sumur diangkat pelan-pelan lalu gel dimasukkan ke dalam bak elektroforesis berisi buffer TBE 0.5 x 300 mL. Gel dimasukan dalam bak yang berisi buffer. Sampel yang dicampur loading dye dimasukan ke dalam sumur. Elektroforesis dijalankan dengan menggunakan tegangan sebesar 75 volt. Hasil elektroforesis diamati dengan Geldoc Alphamager Mini.
Amplifikasi DNA Daun Sagu dengan Primer Acak (RAPD)
5 untuk mengamplifikasi DNA total tanaman sagu sebanyak 45 primer (Lampiran 12).
Elektroforesis Hasil RAPD
Sebanyak 0.45 gram agarose ditimbang lalu dilarutkan dengan larutan buffer TBE 0.5x sebanyak 30 mL. Campuran ini kemudian dipanaskan di dalam mikrowave pada suhu 70 °C selama 1.5 menit. Selanjutnya, ditambahkan gel red ke dalam campuran lalu digoyang-goyang hingga campuran homogen. Campuran ini kemudian dituang ke dalam cetakan gel elektroforesis. Campuran dibiarkan hingga mengeras (kurang lebih 30 menit). Setelah gel mengeras, gigi-gigi pencetak sumur diangkat pelan-pelan lalu gel dimasukkan ke dalam bak elektroforesis. Bak diisi dengan buffer TBE 0.5 x 300 mL. Gel dimasukan dalam bak yang berisi buffer TBE. Sebanyak 5 µl sampel hasil RAPD dipipet lalu dicampur dengan loading dye. Sampel yang dicampur loading dye dimasukan ke dalam sumur. Elektroforesis dijalankan dengan menggunakan tegangan sebesar 60 volt. Hasil elektroforesis diamati dengan Geldoc Alphamager Mini. Konsentrasi DNA ditetapkan berdasarkan perbandingan DNA dengan pita DNA yang sudah diketahui konsentrasinya (marker).
HASIL
Kadar Air Empulur Sagu
Sampel empulur sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014 diukur kadar airnya dengan tiga kali ulangan (triplo). Pengukuran kadar air sampel bulan Maret 2014 dan Juli 2014 didasarkan pada waktu pengambilan sampel. Kadar air empulur sagu bulan Maret 2014 memiliki rata-rata antara 86.43%-90.36% sedangkan kadar air empulur sagu bulan Juli 2014 memiliki rata- rata antara 85.98% - 88.61%.
6
Kadar Pati Empulur Sagu
Sampel 2 bulan Maret 2014 memiliki kadar pati tertinggi yaitu sebesar 37.9%, sampel 4 memiliki kadar pati kedua tertinggi yaitu sebesar 36.82% dan sampel 3 memiliki kadar pati terendah yaitu sebesar 24.46%. Sampel 4 bulan Juli 2014 memiliki kadar pati tertinggi yaitu sebesar 41.36% dan sampel 3 tetap memiliki kadar pati terendah yaitu sebesar 25.02%.
Gambar 2 Kadar pati empulur sagu bulan Maret 2014 dan bulan Juli 2014
Kuantitas dan Kualitas DNA Daun Sagu
7 Tabel 1 Kuantitas DNA daun sagu
Sampel Konsentrasi (ng/µ L)
A260/A280 A260/A230 Kuantitas DNA daun sagu bulan Maret 2014
1 801.9 1.97 2.11
2 413.6 1.90 2.04
3 1090.7 1.92 2.17
4 1632.7 1.91 2.28
Kuantitas DNA daun sagu bulan Juli 2014
1 403.3 1.96 2.13
2 261.0 1.95 2.41
3 345.7 1.99 2.37
4 339.8 1.93 2.17
Uji kualitas DNA diperoleh melalui elektroforesis. Sampel dielektroforesis pada gel agarosa konsentrasi 0.8%. Berdasarkan Gambar 4, profil elektrogram DNA daun sagu memiliki kualitas yang baik karena DNA hasil elektroforesis tidak terdegradasi.
Gambar 3 Profil elektroforegram DNA daun sagu. M=marker lambda DNA ,lajur 1, 2, 3, 4 adalah isolasi DNA bulan Maret, lajur 5, 6, 7, 8 adalah isolasi DNA bulan Juli.
Elektroforegram Hasil RAPD DNA Daun Sagu
Sampel 3 dan 4 dielektroforesis secara berpasangan dengan primer yang sama dengan kode r untuk sampel 3 yang memiliki kadar pati rendah dan kode t untuk sampel 4 yang memiliki kadar pati tinggi. Hal itu bertujuan untuk mempermudah melihat pola RAPD yang dihasilkan. Sampel 3 dan 4 hasil RAPD dielektroforesis pada gel agarose 1.4%. Berdasarkan Gambar 4-8, dapat diketahui kemampuan setiap primer dalam mengampifikasi sampel. Beberapa sampel yang tidak menghasilkan pita pada sampel 3 dan 4 seperti primer OPA9, OPA16, OPB9, dan OPJ 2, terdapat pula primer yang hanya mampu mengamplifikasi sampel 3 saja seperti primer OPA17, OPA18, OPB2, OPJ5.
8
Gambar 4 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer OPA1, OPA3, OPA6, OPA7, OPA8, dan OPA10
Gambar 5 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer OPA11 OPA12 , OPA13, OPA 14, OPA15, OPA17, OPA18, OPA19, dan OPA20
Gambar 6 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer OPB1, OPB2, OPB3, OPB4, OPB7, OPB8, OPB10, OPB11, OPB12, OPB20
Keterangan :
M=1 kb plus DNA Ladder
r= sampel 3 (sagu berkadar pati rendah) t= sampel 4 (sagu berkadar pati tinggi)
9
Gambar 7 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer OPJ1, OPJ3, OPJ4, OPJ5, OPJ6, OPJ7, OPJ8, dan OPJ10
Gambar 8 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer OPD4, OPD5, OPD7, OPD8, OPN6, OPN7, OPN8, dan OPN9
Keterangan :
M=1 kb plus DNA Ladder
r= sampel 3 (sagu berkadar pati rendah) t= sampel 4 (sagu berkadar pati tinggi)
PEMBAHASAN
Kadar Air Empulur Sagu
Pengeringan merupakan proses pengurangan kadar air bahan hingga mencapai kadar air tertentu sehingga menghambat laju kerusakan bahan akibat aktifitas biologis dan kimia (Brooker et al. 2004). Variasi jumlah kadar air sering dijumpai pada bahan. Variasi kadar air ini akan mempengaruhi lamanya proses pengeringan sehingga perlu diketahui berapa persen kadar air pada bahan saat basah dan pada saat kering (Brooker et al. 2004).
10
tersebut lebih besar jika dibandingkan dengan penelitian Haryanto (1987) yaitu sebear 64.80%. Menurut Jong (1995), kadar air tinggi dan konstan selama batang nya masih muda sagu yang telah dewasa mengalami penurunan terutama pada batangnya. Penurunan kadar air empulur sagu mungkin saja disebabkan oleh usia tanaman yang bertambah tua.
Kadar Pati Empulur Sagu
Pengukuran kadar pati bertujuan untuk menentukan sampel yang digunakan saat RAPD. Kadar pati diukur pada bulan Maret 2014 dan Juli 2014. Kadar pati empulur sagu disajikan pada Gambar 2. Sampel 2 bulan Maret 2014 memiliki kadar pati tertinggi, sampel 4 memiliki kadar pati kedua tertinggi dan sampel 3 memiliki kadar pati terendah. Sampel 4 bulan Juli memiliki kadar pati tertinggi sedangkan sampel 3 tetap memiliki kadar pati terendah. Berdasarkan Gambar 2 dan 3, sampel 4 konsisten memiliki kadar pati tinggi dan sampel 3 konsisten memiliki kadar pati rendah. Menurut Yamamoto (2004), kandungan pati tertinggi di dalam empulur berada saat tahap berbunga setelah itu kandungannya berkurang karena translokasi menjadi bunga dan buah.
Sampel bulan Maret 2014 dan Juli 2014 memiliki kadar pati yang berbeda meskipun sampel tersebut berasal dari satu tanaman yang sama. Sampel 1, 3 dan 4 mengalami peningkatan kadar pati. Hal tersebut mungkin saja terjadi jika tanaman tersebut semakin bertambah tua saat bulan Juli 2014. Menurut Haryanto et al. (1992) semakin tua umur tanaman sagu, maka kandungan pati dalam empulur sagu akan semakin banyak. Sampel 2 mengalami penurunan kadar pati hal tersebut juga mungkin saja terjadi jika tanaman sagu berada tahap berbunga (Yamamoto 2004) dan proses produksi pati sedikit.
Li et al. (2002) dan Smidansky et al (2002) melaporkan bahwa produksi pati diregulasi oleh enzim ADP-glukose phosporilase (AGPase). AGPase telah diidentifikasi sebagai enzim inti untuk biosintesis pati dan polimerasi karbohidrat. Biosintesis pati dalam umbi diidentifikasi tergantung pada enzim AGPase yang distimulasi saat sintesis pati (Tiessen et al. 2002). Enzim α-glucan water kinase merupakan enzim inti untuk regulasi posporilasi pati sehingga pati yang dibentuk oleh tumbuhan dapat dimobilisasi dan ditransportasikan (Blennow et al. 2002).
Kuantitas dan Kualitas DNA Daun Sagu
Isolasi DNA daun sagu dilakukan pada sampel 1, 2, 3, dan 4 pada bulan Maret 2014 dan Juli 2014. Hasil isolasi diuji kuantitas dan kualitasnya agar diperoleh DNA yang memadai untuk amplifikasi DNA secara RAPD. Kuantitas DNA daun sagu diukur dengan spektrofotometer NanoDrop.
11 Rasio A260/A230 menunjukkan kemurnian DNA terhadap polisakarida. Hasil isolasi DNA daun sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014 menunjukkan bahwa sampel 1, 2, 3 dan 4 bebas dari kontaminasi polisakarida karena A260/A230 lebih dari 1.8. Menurut Cruz et al. (1997), proses isolasi DNA tanaman umumnya sulit dilakukan karena tanaman mengandung senyawa polisakarida yang cukup besar. Polisakarida dapat dihilangkan dengan penambahan pengendap yang selektif untuk asam nukleat seperti CTAB (Das et al. 2009).
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis gel agarose 0.8%. Gel agarose 0.8% memiliki pori-pori yang cukup besar sehingga memudahkan DNA melewati pori gel tersebut. Sampel DNA dan marker dielektroforesis secara bersamaan. Marker yang digunakan adalah marker DNA lambda yang menghasilkan pita tunggal dan cocok digunakan dalam agarose. Ukuran marker lambda adalah 48.502 bp. Konsentrasi DNA daun sagu bulan Maret memiliki konsentrasi antara 413.6-1632.7 (ng/µ g) sedangkan konsentrasi DNA daun sagu bulan Juli yang didapat berada pada rentang 261-403.3(ng/µ g) (Tabel 1). Berdasarkan Gambar 4, hasil isolasi DNA memiliki kualitas yang cukup baik karena DNA hasil elektroforesis tidak terdegradasi.
Elektroforegram hasil RAPD DNA Daun Sagu
Kemampuan suatu primer untuk mengamplifikasi DNA dari suatu genom tanaman selain ditentukan oleh jumlah dan kualitas DNA juga ditentukan oleh adanya situs (sekuen) pada DNA cetakan yang homolog dengan urutan basa-basa dari primer yang digunakan. Jika di dalam DNA cetakan yang digunakan tidak mempunyai situs homolog, maka DNA cetakan tidak akan diamplifikasi. Hal itu ditandai dengan tidak adanya pita DNA di dalam gel agarose hasil elektroforesis. Oleh karena itu langkah awal yang perlu dilakukan adalah seleksi primer yang dapat mengamplifikasi DNA genom tanaman sagu yang dihasilkan dalam bentuk pita-pita DNA (Manoj et al. 2005). Seleksi primer yang dilakukan pada penelitian adalah melihat kemampuan primer dalam membedakan pola RAPD sampel 3 dan 4 yang memiliki kadar pati berbeda berdasarkan polimorfis yang dihasilkan saat elektroforesis.
Pita RAPD terbentuk dari pemanjangan primer yang menempel pada DNA cetakan yang terjadi secara berulang. Setiap primer dapat menempel secara bersamaan pada beberapa situs homolog yang tersebar di dalam DNA cetakan dan hasil pemanjangan primer tersebut memiliki ukuran yang sangat bervariasi. Oleh karena itu di dalam hasil elektroforesis menggunakan gel agarose terlihat beberapa pita dengan ukuran berbeda (Upadhyay et al. 2004).
12
yang cukup jauh sehingga tidak mampu diamplifikasi oleh enzim DNA Taq polimerase (Pandin 2010).
Primer yang menghasilkan pita paling sedikit adalah OPA15 (Gambar 5), OPB2 (Gambar 6), OPB8 (Gambar 6), OPD4 (Gambar 8). Primer tersebut hanya menghasilkan satu pita pada sampel 3 dan 4. Primer yang menghasilkan pita DNA paling banyak antara 6-8 pita adalah OPA3 (Gambar 4), OPA8 (Gambar 4), dan OPA10 (Gambar 4). Upadhyay et al. (2004) melaporkan bahwa jumlah pita DNA yang terdeteksi dalam setiap primer bergantung pada urutan basa dari primer dan ada atau tidaknya variasi dalam genotipe tertentu.
Primer OPA1(Gambar 4), OPA17 (Gambar 5), OPA18 (Gambar 5), OPA19 (Gambar 5), OPA20 (Gambar 5), OPB2 (Gambar 6), OPB4 (Gambar 6), OPB10 (Gambar 6), OPJ1 (Gambar 7), OPJ 5 (Gambar 7), OPJ8 (Gambar 7) mampu membedakan sagu berkadar pati tinggi dan rendah. OPA 1 hanya mampu mengamplifikasi sampel 4, OPA17, OPA18 dan OPJ5 hanya mampu mengamplifikasi sampel 3. OPA19 dan OPA20 mampu membedakan sampel dengan menghasilkan satu polimorfis namun pita yang dihasilkan sangat tipis sehingga sulit untuk dilihat ukuran DNA nya. OPB2 dan OPB 8 (Gambar 6 ) sama-sama menghasilkan satu pita dengan ukuran yang sama namun intensitas pita DNA sampel 4 lebih tipis dibandingkan sampel 3. OPB4 menghasilkan satu polimorfis pada sampel 4 berukuran 4 kb. OPB10 menghasilkan satu polimorfis pada sampel 4 berukuran 2 kb. OPJ1 menghasilkan polimorfis pada sampel 4 berukuran 2 kb. OPJ8 membedakan sampel dengan menghasilkan satu polimorfis pada sampel 3 berukuran 0.4 kb.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Sampel yang memiliki kadar pati terendah adalah sampel 3 yaitu sebesar 24.46 % pada bulan Maret 2014 dan 25.02% pada bulan Juli 2014 sedangkan sampel yang memiliki kadar pati tertinggi adalah sampel 4 yaitu sebesar 36.82 % pada bulan Maret 2014 dan 41.36% pada bulan Juli 2014. Primer yang mampu membedakan pola RAPD sampel sagu berkadar pati tinggi dan rendah adalah primer OPA1, OPA 17, OPA18, OPA19, OPA20, OPB2, OPB4, OPB10, OPJ1, OPJ 5, dan OPJ8.
Saran
Primer yang mampu membedakan sagu berkadar pati tinggi dan rendah perlu diuji stabilitasnya dengan menggunakan sampel sagu dengan asal yang berbeda.
DAFTAR PUSTAKA
13 Blennow A, Nielsen TH, Baunsgaard L, Mikkelsen R, Engelsen SB. 2002. Starch phosphorylation: a new front line in starch research. Trends Plant Sci 7(10):445-450.
Das BK, Jena RC, Samal KC. 2009. Optimization of DNA isolation and PCR protocol for RAPD analysis of banana/plantain (Musa spp). In ternational J Agri Sci1(2):21-25.
Brooker. 2004. Mengukur faktor kekeringan dalam proses pengeringan. Teknologi 2(1):70-79.
Bujang KB, Adeni DSA. 2000. Effects of dilution rate and pH control in ethanol fermentation of hydrolyzed sago starch. In: H.M.H. Bintoro et al. (eds.). SAGO 2000. Proc. Int. Sago Seminar, Bogor. March 22-23, 2000. p.117-23. Cruz M, Ramirez F, Hernandez H. 1997. DNA isolation and amplification from
cacti. Plant Molecular Biology Report (15): 319-325.
Haryanto, Bambang, P Pangloli. 1992. Potensi dan Pemanfaatan Sagu.Yogyakarta :Kanisius.
Jong FS. 1995. Reseach for development of sago palm (Metroxylon sagu Rottb.) cultivation in Sarawak, Malaysia. [thesis]. Wageningen(ID): Lanbouwuniversiteit.
Jong FS, Adi W. 2007. Sagu potensi besar pertanian Indonesia. Iptek Tanaman Pangan 1(2):54-6.
Lakuy H dan J Limbongan. 2003. Beberapa hasil kajian dan teknologi yang diperlukan untuk pengembangan sagu di Provinsi Papua. Prosiding Seminar Nasional Sagu; 2003 Oktober 6; Manado. Indonesia: Balai Penelitian Tanaman Kelapa dan Palma Lain.
Li X, Xing J, Gianfagna TJ, Janes HW. 2002. Sucrose regulation of ADP-glucose pyrophosphorylase subunit genes transcript levels in leaves and fruits. Plant Sci 162(2):239-244.
Manoj T, NK Singh, M Rathore, And N Kumar. 2005. RAPD markers in the analysis of genetic diversity among common bean germplasm from Central Himalaya. Genetic Res Crop Evol 52(3):315- 324.
Orozco-Castillo, KJ Chalmera, R Waugh and W Powell. 1994. Detection of genetic diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD marker. TheorAppl Genet 87: 934-938.
Pandin DS. 2009. Keragaman genetik kultivar kelapa dalam mapanget (dmt) dan dalam tenga (dta) berdasarkan penanda random amplified polymorphic DNA (RAPD). Buletin Palma 36: 17-27.
Pandin DS. 2010. Keragaman genetik kelapa dalam Bali (dbi) dan dalam sawarna (dsa) berdasarkan penanda random amplified polymorphic DNA (RAPD). Littri 16(2):83-89.
14
Sharma A, AG Namdeo, KR Mahadik. 2008. Molecular markers: new prospects in plant genome analysis. Pharmacognosy Reviews 2(3): 23- 31.
Setyowati N. 2013. Optimasi isolasi DNA dan PCR-RAPD pada tanaman Garut (Maranta arundinacea L) lokal DIY [skripsi]. Yogyakarta (ID): Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga.
Smidansky ED, Clancy M, Meyer FD, Lanning SP, Blake NK, Talbert LE, Giroux MJ. 2002. Enhanced ADP-glucose pyrophosphorylase activity in wheat endosperm increases seed yield. Proc Nat Acad Sci 99(3):1724-1729.
Sumaryono. 2007. Tanaman sagu sebagai sumber energi alternatif. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian 29(4):3-4.
Suryanto D. 2003. Melihat keanekaragaman organisme melalui beberapa teknik genetika molekuler. USU digital library; [2014 April 2]: Sumatra Utara. Tiessen A, Hendriks JH, Stitt M, Branscheid A, Gibon Y, Farre EM,
Geigenberger P. 2002. Starch synthesis in potato tubers is regulated by post-translational redox modification of ADP-glucose pyrophosphorylase: a novel regulatory mechanism linking starch synthesis to the sucrose supply. Plant Cell 14(9):2191-2213.
Tjasadihardja A. 1987. Hubungan antara pertambahan pucuk, perkembangan buah serta tingkat kandungan asam indol asetat di dalam biji dan layu pentil kakao [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Upadhyay A, Jayadev K, Manimekalai R, Parthasarathy V. 2004. Genetic relationship and diversity in Indian coconut accession based on RAPD markers. Scientia Horticulturae 99:353-362.
William W, Wilfinger, Karol Mackey, and Piotr Chomczynski. 1997. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques 22:474-481.
15 Lampiran 1 Bagan alir penelitian
Penetapan kadar air
Preparasi sampel
Daun sagu Empulur sagu
Uji kuantitas dan kualitas DNA
Isolasi DNA
20
Lampiran 2 Kadar air empulur sagu bulan Maret 2014 Bobot cawan
kosong (gram)
Bobot sampel (gram )
Cawan kosong+ sampel sebelum dikeringkan
Cawan kosong+ sampel setelah dikeringkan
Sampel Ulangan %Kadar air
1 1 27.65 2.00 29.66 27.93 86.05
1 2 28.60 2.00 30.60 28.85 87.16
1 3 27.28 2.00 29.29 27.56 86.08
Rata- rata 86.43 0.24
2 1 2.00 29.24 27.45 27.23 89.20
2 2 2.00 30.36 28.57 28.35 88.87
2 3 2.00 29.75 27.97 27.75 88.80
Rata- rata 88.96 0.41
3 1 28.06 2.00 30.06 28.26 90.33
3 2 28.44 2.00 30.45 28.64 90.31
3 3 28.25 2.01 30.26 28.44 90.45
Rata- rata 90.36 0.39
4 1 28.75 2.01 30.76 28.97 88.71
4 2 29.44 2.03 31.48 29.67 88.88
4 3 28.66 2.00 30.66 28.88 89.07
Rata- rata 88.89 0.05
17 Lampiran 3 Kadar air empulur sagu bulan Juli 2014
Bobot cawan kosong (gram)
Bobot sampel (gram )
Cawan kosong+ sampel sebelum dikeringkan (gram )
Cawan kosong+ sampel setelah dikeringkan (gram)
Sampel Ulangan %Kadar air
1 1 27.77 1.00 28.77 27.90 86.26
1 2 27.75 1.00 28.76 27.89 85.82
1 3 28.50 1.00 29.51 28.64 85.87
Rata- rata 85.98 0.63
2 1 27.67 1.00 28.67 27.79 87.65
2 2 28.49 1.00 29.50 28.62 86.85
2 3 27.65 1.00 28.65 27.78 87.04
Rata- rata 87.18 0.21
3 1 28.18 1.00 29.18 28.29 88.25
3 2 30.64 1.00 31.65 30.75 89.03
3 3 28.34 1.00 29.34 28.45 88.57
Rata- rata 88.62 0.07
4 1 28.22 1.00 29.22 28.34 87.91
4 2 27.96 1.00 28.96 28.08 87.84
4 3 27.03 1.00 28.04 27.15 87.95
Rata- rata 87.90 0.18
20
Lampiran 4 Contoh perhitungan kadar air Sampel 4R ulangan 1
Rumus untuk menghitung kadar air adalah sebagai berikut: Kadar air (%)=
Keterangan : w1= bobot cawan dan sampel sebelum dikeringkan w2= bobot cawan dan sampel sebelum dikeringkan w3= bobot sampel
=
=87.9147%
20
Lampiran 6 Kurva standar D- Glukosa bulan Juli 2014
Lampiran 7 Absorbansi empulur sagu bulan Maret 2014 Sampel Ulangan Absorbansi
empulur
Konsentrasi (ppm) Absorbansi
20
Lampiran 8 Absorbansi empulur sagu bulan Juli 2014
Sampel Ulangan Absorbansi
empulur
Keterangan : konsentrasi empulur sebanding dengan konsentrasi D-glukosa Lampiran 9 Kadar pati empulur sagu bulan Maret 2014
21
Lampiran 10 Kadar pati empulur sagu bulan Juli 2014 Sampel Ulangan Rata-rata
%kadar air
Lampiran 11 Contoh perhitungan kadar pati
Rumus untuk menghitng kadar pati adalah sebagai berikut : y=ax+b
x dicari untuk mendapat konsentrasi sampel empulur
% kadar pati = Konsentrasi yang didapat x pengenceran x 0.05 Lx100% Bobot sampel kering
Keterangan : 0.05 L = 50 ml (pengenceran saat di labu ukur)
20
Lampiran 12 Primer yang digunakan dan pita yang dihasilkan
No Primer Jumlah pita DNA No Primer Jumlah pita DNA
Total Polimorfik Monomorfik Total Polimorfik Monomorfik
1 OPA 1 4 1 3 24 OPB 9 0 0 0
2 OPA 3 8 0 8 25 OPB 10 2 1 1
3 OPA 6 6 1 5 26 OPB 11 1 0 1
4 OPA 7 4 0 4 27 OPB 12 4 0 4
5 OPA 8 7 0 7 28 OPB 20 3 0 3
6 OPA 9 0 0 0 29 OPJ 1 3 2 1
7 OPA 10 6 0 6 30 OPJ 2 0 0 0
8 OPA 11 3 0 3 31 OPJ 3 1 0 1
9 OPA 12 2 0 2 32 OPJ 4 3 0 3
10 OPA 13 6 0 6 33 OPJ 5 4 4 0
11 OPA 14 3 0 3 34 OPJ 6 4 0 4
12 OPA 15 1 0 1 35 OPJ 7 1 0 1
13 OPA 16 0 0 0 36 OPJ 8 2 1 1
14 OPA 17 1 1 0 37 OPJ 10 5 0 5
15 OPA 18 3 3 0 38 OPD 4 1 0 1
16 OPA 19 4 1 3 39 OPD 5 2 1 1
17 OPA 20 5 1 4 40 OPD 7 2 0 2
18 OPB 1 6 0 6 41 OPD 8 5 0 5
19 OPB 2 1 0 1 42 OPN 6 5 0 5
20 OPB 3 0 0 0 43 OPN 7 2 0 2
21 OPB 4 7 1 6 44 OPN 8 5 0 5
22 OPB 7 2 0 2 45 OPN 9 3 0 3
23 OPB8 1 0 1
22
20
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama Ifroh Jatidiri Media. Penulis adalah anak ke-empat dari lima bersaudara. Penulis berasal dari Cilegon-Banten. Jenjang pendidikan yang dilalui penulis sampai saat ini adalah SMA Negeri Cahaya Madani Banten (Boarding School) tahun 2007-2010 dan kuliah di Institut Pertanian Bogor tahun 2010-2014. Organisasi yang diikuti penulis selama masa pendidikan antara lain: staff kajian strategi Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor tahun 2011, staff Human Research Development Paguyuban Karya Salemba Empat Institut Pertanian Bogor tahun 2011, ketua divisi Master Program Paguyuban Karya Salemba Empat Institut Pertanian Bogor tahun 2012, dan ketua divisi Edukasi Paguyuban Karya Salemba Empat Institut Pertanian Bogor tahun 2013. Penulis pernah melaksanakan praktik lapang di Laboratorium Mikrobiologi, PT Jawa Manis Ciwandan-Cilegon dengan judul Analisis Total Plate Count, Yeat Mold, dan Patogen Salmonella pada Gula Rafinasi.
