Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase Secara In Vitro oleh Ekstrak Daun Aquilaria filaria sebagai Antihiperglikemik

KINETIKA INHIBISI ENZIM

α

-GLUKOSIDASE SECARA

IN

VITRO

OLEH EKSTRAK DAUN

Aquilaria filaria

SEBAGAI

ANTIHIPERGLIKEMIK

IBNA ANGGI MEINAR

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER

INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Kinetika Inhibisi Enzim

α-Glukosidase secara In Vitro oleh Ekstrak Daun Aquilaria filaria sebagai Antihiperglikemik adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

ABSTRAK

IBNA ANGGI MEINAR. Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro oleh Ekstrak Daun Aquilaria filaria sebagai Antihiperglikemik. Dibimbing oleh HENNY PURWANINGSIH dan HILMAN AFFANDI.

Diabetes melitus atau hiperglikemik merupakan suatu gangguan metabolisme kronis akibat disfungsi insulin sehingga kadar gula dalam darah menjadi tinggi. Salah satu pengobatan antihiperglikemik ialah menggunakan inhibitor enzim α -glukosidase yang mampu menghambat absorpsi glukosa. Studi pendahuluan menunjukkan bahwa beberapa spesies Aquilaria berpotensi sebagai antihiperglikemik. Dalam penelitian ini, ekstrak etanol daun Aquilaria filaria (gaharu) diuji sebagai antihiperglikemik dan kinetika mekanisme antihiperglikemik melalui inhibisi enzim α-glukosidaseberdasarkan pengujian secara in vitrodiamati. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun gaharu memiliki potensi sebagai antihiperglikemik dengan nilai IC50 sebesar 26 ppm. Nilai inhibisi maksimum sebesar 49% dihasilkan pada pengujian dengan konsentrasi 25 ppm. Kajian atas kinetika inhibisi menunjukkan bahwa daun gaharu menginhibisi enzim

α-glukosidase melalui mekanisme inhibisi campuran yang ditunjukkan oleh penurunan nilai Vmaks dari 2.18 menjadi 1.37 dan peningkatan nilai Km dari 0.30 menjadi 3.64.

Kata Kunci: α-glukosidase, antihiperglikemik, Aquilaria filaria, inhibisi

ABSTRACT

IBNA ANGGI MEINAR. Kinetics of α-Glucosidase Inhibition In Vitro by Extract of Aquilaria filaria Leaves as Antihyperglycemic. Supervised by HENNY PURWANINGSIH and HILMAN AFFANDI.

Diabetes mellitus or hyperglycemic is a chronic metabolic disorder due to insulin dysfunction that resulting in high blood sugar levels. One antihyperglycemic therapyis by usingα-glucosidase enzyme inhibitors which inhibit the absorption of glucose. Preliminary study showed that several species of Aquilaria are potential as an antihyperglicemic. In this study, ethanol extract of Aquilaria filaria (gaharu) leaves was examined as antihyperglicemic and the kinetics of antihyperglicemic mechanism through α-glucosidase enzyme inhibition based on in vitro tests was observed. The results showed that the ethanol extract of gaharu leaves was potential as an antihyperglycemic with the IC50 value of 26 ppm. The maximum inhibition value of 49% was observed in gaharu leaves ethanol extract in concentration of 25 ppm. Study of inhibition kinetics showed that gaharu leaves inhibit α-glucosidase enzyme through mixed inhibition mechanism indicated by a decrease in the Vmax value of 2.18 to 1.37 and an increase in Km value of 0.30 to 3.64.

KINETIKA INHIBISI ENZIM

α

-GLUKOSIDASE SECARA

IN

VITRO

OLEH EKSTRAK DAUN

Aquilaria filaria

SEBAGAI

ANTIHIPERGLIKEMIK

IBNA ANGGI MEINAR

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

pada

Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul Skripsi : Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase Secara In Vitro oleh Ekstrak Daun Aquilaria filaria sebagai Antihiperglikemik

Nama : Ibna Anggi Meinar NIM : G44100071

Disetujui oleh

Dr Henny Purwaningsih, M Si

Pembimbing I

Dr Hilman Affandi Pembimbing II

Diketahui

Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS Ketua Departemen

v

PRAKATA

Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya yang berlimpah penulis dapat menyelesaikan laporan hasil penelitian yang berjudul Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro oleh Ekstrak Daun Aquilaria filaria sebagai Antihiperglikemiksebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Ibu Dr Henny Purwaningsih, M Si dan Bapak Dr Hilman Affandi selaku pembimbing yang telah memberi bimbingan dan dukungan kepada penulis. Terima kasih kepada pihak SEAMEO Biotrop, khususnya Bapak Arif, Mbak Ica, Mas Dodo, dan Ibu Anida yang telah membantu dan berkontribusi dalam penelitian yang telah dilakukan

Ucapan terima kasih tak terhingga penulis sampaikan kepada orang tua, Bapak Dedi Andi Soewandi Dinata dan Ibu Ismulyati, Kakak Dita Adi Septianita, dan Bibi Hotamimah yang telah memberi dukungan moril, semangat, doa, dan materi. Terima kasih juga kepada teman-teman kimia angkatan 47, khususnya Amima Aqmarina, Cempaka Mayang Nastiti, Lestari Pudjiastuti, Nur Fadilawati, dan M Sholehuddin Malik Ibrohim; dan teman-teman TPB B06, khususnya Muhammad Irfan Fadillah, Dani Yoga Nugraha, dan Raga Kustiawan atas motivasi, semangat, dan kebersamaan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

Semoga laporan hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi penulis maupun pembaca.

vi

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI vi

DAFTAR GAMBAR v

DAFTAR LAMPIRAN v

PENDAHULUAN 1

BAHAN DAN METODE 2

Bahan dan Alat 2

Metode Penelitian 2

Preparasi Larutan Bahan Uji 2

Preparasi Larutan Sampel 3

Pengujian Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro (Modifikasi Metode Sancheti et al. 2009) 3

Evaluasi Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase (Mayur et al. 2010) 4

HASIL DAN PEMBAHASAN 4

Aquilaria filaria 4

Inhibisi Enzim α-Glukosidase oleh Ekstrak Daun A. filaria secara In Vitro 5

Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase 7

SIMPULAN DAN SARAN 11

Simpulan 11

Saran 11

DAFTAR PUSTAKA 11

LAMPIRAN 14

RIWAYAT HIDUP 16

v

DAFTAR GAMBAR

1 Daun Aquilaria filaria (Bangun 2013) 5

2 Reaksi antara enzim α-glukosidase dan p-NPG (Sugiwati 2005) 5

3 Daya inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak daun A. filaria 6

4 Plot Michaelis-Menten larutan kontrol berdasarkan teoritis ( )

dan hasil percobaan ( ) 8

5 Plot Lineweaver-Burk analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase tanpa adanya ekstrak () dan dengan adanya ekstrak daun A. Filaria

25 ppm () 9

6 Mekanisme inhibisi campuran (Sharma 2012) 9

7 Plot Hanes-Woolf analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase tanpa adanya ekstrak () dan dengan adanya ekstrak daun A. Filaria

25 ppm () 10

8 Plot Eadie-Hofstee analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase tanpa adanya ekstrak () dan dengan adanya ekstrak daun A. Filaria

ppm () 10

DAFTAR LAMPIRAN

1 Diagram alir penelitian 14

2 Daya inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak daun A. Filaria 14

3 Kinetika inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak daun A. Filaria 14

1

PENDAHULUAN

Indonesia saat ini masuk 10 negara terbesar penderita diabetes di dunia, tepatnya pada posisi kelima dengan jumlah penderita sebanyak 9.1 juta orang. Meningkatnya jumlah penderita diabetes di Indonesia yang merupakan negara berkembang, khusunya diabetes melitus (DM) tipe II, dapat dipengaruhi oleh pola hidup yang kurang sehat. Sebanyak 90 persen penderita diabetes di dunia mengidap diabetes tipe II (Nova 2015). Penyakit DM termasuk penyakit yang mengancam masyarakat karena hanya dalam satu tahun, jumlah penderita diabetes di Indonesia melonjak 500 ribu orang. Diperkirakan pada 2035 nanti, ada sekitar 14,1 juta penduduk Indonesia yang menderita diabetes (Sari 2014).

Penyakit DM atau hiperglikemik merupakan suatu gangguan metabolisme kronis akibat disfungsi insulin sehingga kadar gula darah menjadi tinggi dan disertai dengan gangguan metabolisme karbohidrat, lipid, dan protein (WHO 2006). Penyakit ini sering muncul tanpa gejala, namun ada beberapa gejala yang dapat diwaspadai sebagai indikasi diabetes melitus, seperti poliuria atau sering buang air kecil, polidipsia atau sering haus, dan polifagia atau mudah lapar (Muchid et al. 2005).

Salah satu obat yang dapat digunakan untuk mengatasi hiperglikemik adalah

golongan obat inhibitor katabolisme karbohidrat, seperti inhibitor α-glukosidase yang akan menghambat absorpsi glukosa. Inhibitor α-glukosidase bekerja dengan menghambat kerja enzim-enzim pencernaan yang mencerna karbohidrat sehingga absorpsi glukosa ke dalam darah menjadi lebih lambat (Muchid et al. 2005).

Berdasarkan beberapa penelitian yang pernah dilakukan, terdapat beberapa jenis tanaman yang dapat mengatasi penyakit diabetes karena mampu menginhibisi kerja enzim α-glukosidase. Penelitian yang dilakukan oleh Gupta et al. (2013) menunjukkan adanya potensi antihiperglikemik pada tanaman gaharu dengan spesi Aquilaria agalocha Roxb.. Tanaman tersebut dilaporkan memiliki aktivitas farmakologi. Dalam penelitiannya, ekstrak kasar metanol dan air dari daun tersebut ditemukan berpengaruh terhadap hiperglikemik pada tikus diabetes streptozotocin-induced pada dosis 1 g/kg bobot tubuh dan hasilnya menunjukkan penurunan tingkat glukosa darah puasa sebesar 54% dan 40% secara berturut-turut. Hasil tersebut dibandingkan dengan insulin sebesar 4 U/kg berat tubuh yang mampu menurunkan tingkat glukosa darah puasa sebesar 73%.

Tanaman gaharu dapat berpotensi sebagai antihiperglikemik karena mengandung beberapa senyawa bahan alam aktif atau metabolit sekunder. Hal ini dibuktikan oleh Mega dan Swastini (2010) yang berhasil menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun gaharu dengan spesies Gyrinops versteegii [nama lain dari Aquilaria versteegii (The Plant List, 2013)] mengandung metabolit sekunder berupa fenol, flavonoid, dan terpenoid. Senyawa flavonoid yang terdapat dalam tanaman dapat dimanfaatkan sebagai antioksidan, antibakteri, dan inhibitor enzim

α-glukosidase. Peranan flavonoid sebagai inhibitor enzim α-glukosidase telah diuji oleh Hartika (2009) dengan menggunakan ekstrak flavonoid dari buah mahkota dewa pada konsentrasi 1% (b/v) yang menunjukkan daya inhibisi sebesar 23.06– 40.26%.

2

yang akan menurunkan laju reaksi pada saat dimasukkan ke dalam sistem reaksi enzimatis. Inhibisi yang terjadi dapat bersifat kompetitif, unkompetitif, nonkompetitif, atau campuran. Menurut He (1998), proses inhibisi yang terjadi pada enzim α-glukosidase tergolong ke dalam mekanisme inhibisi enzim yang sifatnya kompetitif. Pada mekanisme inhibisi enzim kompetitif, enzim dapat mengikat substrat atau inhibitor, tetapi tidak dapat mengikat keduanya. Inhibitor kompetitif menyerupai substrat dan mengikat sisi aktif dari enzim. Dengan demikian substrat menjadi terhalang untuk berikatan pada sisi aktif yang sama (Berg et al. 2004).

Reaksi enzimatis memiliki beberapa parameter kinetika yang dapat diamati, yaitu nilai Km dan Vmaks. Kinetika dari penghambatan suatu aktivitas enzim dapat diukur dengan meningkatkan konsentrasi substrat, baik ada maupun tanpa adanya inhibitor pada berbagai konsentrasi. Analisis data umumnya dilakukan dengan menggunakan metode Lineweaver-Burk sehingga diperoleh konstanta Michaelis-Menten (Km) (Murray et al. 2009).

Potensi yang terdapat pada ekstrak hasil isolasi daun gaharu dengan spesi Aquilaria filaria (A. Filaria) sebagai antihiperglikemik melalui mekanisme inhibisi

α-glukosidase dan kinetikanya akan diteliti secara in vitro dan menjadi fokus pada penelitian ini. Penelitian ini bertujuan mengetahui kinetika inhibisi enzim α -glukosidase oleh ekstrak daun A. filaria yang memiliki potensi sebagai antihiperglikemik berdasarkan pengujian yang dilakukan secara in vitro.

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak kasar daun A. filaria, bufer fosfat pH 7.0, etanol PA 96%, bovine serum albumin (BSA), α-glukosidase, p -nitrofenil-α-D-glukopiranosida (p-NPG), dan natrium karbonat (Na2CO3). Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer ultraviolet-tampak (UV-Vis) Beckman Coulter DU 530 dan neraca analitik Mettler Toledo.

Metode Penelitian

Metode yang digunakan pada penelitian ini meliputi preparasi larutan bahan uji, preparasi larutan ekstrak, pengujian aktivitas inhibisi terhadap enzim α -glukosidase, dan evaluasi kinetika inhibisi enzim α-glukosidase (Lampiran 1).

Preparasi Larutan Bahan Uji

Larutan stok enzim α-glukosidase 0.6 U/mL dibuat dengan melarutkan enzim

3

dilarutkan dalam 10 mL bufer fosfat pH 7.0 yang mengandung 20 mg BSA sehingga diperoleh larutan enzim α-glukosidase 0.2 U/mL.

Larutan p-NPG 0.5 mM dibuat dengan cara sebanyak 1.6 mg serbuk p-NPG ditimbang dan dilarutkan dalam 10 mL bufer fosfat (pH 7.0). Larutan p-NPG 0.25 mM dibuat dengan cara sebanyak 0.8 mg serbuk p-NPG ditimbang dan dilarutkan dalam 10 mL bufer fosfat (pH 7.0). Larutan p-NPG 0.75 mM dibuat dengan cara sebanyak 2.4 mg serbuk p-NPG ditimbang dan dilarutkan dalam 10 mL bufer fosfat (pH 7.0). Larutan p-NPG 1 mM dibuat dengan cara sebanyak 3.2 mg serbuk p-NPG ditimbang dan dilarutkan dalam 10 mL bufer fosfat (pH 7.0).

Larutan Na2CO3 0.2 M dibuat dengan cara sebanyak 5.3 g serbuk Na2CO3 ditimbang dan dilarutkan dalam 250 mL akuades.

Preparasi Larutan Sampel

Ekstrak kasar daun A. Filaria ditimbang sebanyak 250 mg dan dilarutkan dalam 50 mL etanol sehingga diperoleh larutan stok ekstrak 5000 ppm. Larutan stok ekstrak dipipet sebanyak 1 mL dan diencerkan dalam 10 mL bufer fosfat pH 7.0 sehingga diperoleh larutan ekstrak dengan konsentrasi 500 ppm. Larutan tersebut kemudian diencerkan kembali untuk memperoleh larutan sampel uji dengan konsentrasi 5, 10, 20, dan 25 ppm.

Pengujian Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro

(Modifikasi Metode Sancheti et al. 2009)

Aktivitas inhibisi α-glukosidase diuji dengan menggunakan metode Sancheti et al. (2009) dengan sedikit modifikasi pada komposisi campuran, berbagai macam konsentrasi sampel, dan waktu inkubasi. Sampel dipipet sebanyak 0.1 mL dan dicampurkan dengan 0.5 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0), 0.25 mL p-NPG 0.5 mM, kemudian campuran diaduk hingga homogen. Setelah campuran homogen, sebanyak 0.5 mL larutan enzim α-glukosidase ditambahkan dan diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37°C. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na2CO3 0.2 M. Selanjutnya absorbansi larutan diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 410 nm sebagai absorbansi sampel (As).

Kontrol dibuat dengan cara menyampurkan 0.1 mL etanol PA 96%, 0.25 mL p-NPG 0.5 mM, dan 0.5 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0) hingga homogen. Setelah itu, campuran ditambahkan 0.5 mL enzim dan diinkubasi selama 2 hari dengan suhu 37°C. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na2CO3 0.2 M. Selanjutnya absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 410 nm sebagai absorbansi kontrol (Ac).

4

pada panjang gelombang 410 nm sebagai absorbansi blanko (Ab). Penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase ditentukan dengan rumus:

Inhibisi (%) = 







100% Ac

Ab As Ac

Evaluasi Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase (Mayur et al. 2010) Pengujian kinetika inhibisi enzim α-glukosidase dilakukan dengan menggunakan metode Mayur et al. (2010). Sampel dengan aktivitas inhibisi tertinggi dipipet sebanyak 0.1 mL dan dicampurkan dengan 0.5 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0), 0.25 mL p-NPG 0.5 mM, kemudian campuran diaduk hingga homogen.

Setelah campuran homogen, sebanyak 0.5 mL larutan enzim α-glukosidase ditambahkan. Campuran diinkubasi dengan suhu 37°C. Reaksi kemudian dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na2CO3 0.2 M. Selanjutnya absorbans (Vs) larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis. Pengujian dilakukan kembali dengan menggunakan konsentrasi p-NPG [S] yang berbeda, yaitu 0.25 mM, 0.75 mM, dan 1 mM.

Larutan blanko dibuat dengan cara menyampurkan 0.1 mL larutan sampel dengan aktivitas inhibisi tertinggi, 0.25 mL p-NPG 0.5 mM, dan 1 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0) hingga homogen. Setelah itu, campuran diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37°C. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na2CO3 0.2 M. Selanjutnya absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 410 nm sebagai absorbansi blanko (Vb). Absorbansi terkoreksi ditentukan dengan rumus:

Absorbansi terkoreksi (V) = Vs – Vb

Data perolehan yang dikalkulasikan berdasarkan hasil terhadap kinetika Michaelis-Menten dibuat menjadi tiga plot berbeda, yaitu plot Lineweaver-Burk dengan 1/[S] sebagai sumbu x dan 1/V sebagai sumbu y, plot Hanes-Woolfdengan [S] sebagai sumbu x dan [S]/V sebagai sumbu y, dan plot Eadie-Hofstee dengan V/[S] sebagai sumbu x dan V sebagai sumbu y. Setelah itu, plot dengan nilai R2 tertinggi digunakan untuk menentukan tipe inhibisi enzim.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Aquilaria filaria

5

larut dalam pelarut yang digunakan. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi dengan menggunakan pelarut berupa etanol PA 96% selama 8 jam.

Metode ekstraksi senyawa komponen yang dilakukan dengan cara merendam sampel dalam pelarut yang sesuai dalam jangka waktu tertentu dinamakan metode maserasi. Umumnya metode ini dilakukan terhadap sampel yang belum diketahui sifat-sifatnya karena tidak merusak kandungan senyawa dalam sampel yang tidak tahan panas dan dapat diperoleh ekstrak dalam jumlah besar.

Gambar 1 Daun Aquilaria filaria (Bangun 2013)

Penggunaan etanol sebagai pelarut bertujuan memperoleh senyawa nonpolar hingga senyawa polar secara maksimum. Etanol mampu mengekstraksi senyawa alkaloid, sterol, saponin, flavonoid antrakuinon, dan glikosida dari tanaman. Senyawa kuersetin yang merupakan salah satu senyawa flavonoid memiliki aktivitas antidiabetes yang ditunjukkan oleh penelitian Vessel et al. (2003) (Dewiyanti et al. 2012). Penelitian yang dilakukan oleh Affandi et al. (2013) menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun A. filaria memiliki aktivitas antioksidan yang terus meningkat seiring peningkatan konsentrasi ekstrak dan memiliki nilai IC50 12.9664%.

Inhibisi Enzim α-Glukosidase oleh Ekstrak Daun A. filaria secara In Vitro

Enzim yang digunakan pada pengujian inhibisi enzim yaitu α-glukosidase yang merupakan enzim yang tersebar luas di mikroorganisme, tanaman, dan hewan. Enzim ini mengatalisis pembebasan α-glukosa dari ujung non-pereduksi α-glukosa seperti maltooligosakarida dan sukrosa. Senyawa p-NPG digunakan sebagai substrat dalam percobaan karena senyawa terseut merupakan salah satu jenis subtrat yang dapat bereaksi dengan enzim α-glukosidase (Ojima 2013) dan paling umum digunakan. Selain senyawa p-NPG, maltosa dan sukrosa dapat pula digunakan sebagai substrat enzim α-glukosidase (Everette et al. 2013).

Gambar 2Reaksi antara enzim α-glukosidase dan p-NPG (Sugiwati 2005)

+ α-glukosidase

+

6

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, potensi daun A. filaria sebagai antihiperglikemik dievaluasi melalui pengujian inhibisi enzim α-glukosidase. Inhibisi terhadap aktivitas enzim α-glukosidase oleh ekstrak daun A. filaria diuji dengan menggunakan metode Sancheti et al. (2009) yang telah dimodifikasi. Pengaruh antara penambahan konsentrasi ekstrak dan peningkatan daya inhibisi terhadap enzim dilihat berdasarkan pengujian yang dilakukan menggunakan berbagai macam konsentrasi ekstrak. Larutan blanko (tanpa penambahan ekstrak dan enzim), kontrol (tanpa penambahan ekstrak), dan sampel digunakan dalam pengujian inhibisi enzim.

Gambar 3 Daya inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak daun A.filaria

Hasil pengujian berupa nilai absorbans diperoleh dari sisa hasil reaksi antara p-NPG dan α-glukosidase, yaitu p-nitrofenol (Gambar 2) yang tidak dihambat oleh ektrak A. Filaria. Nilai tersebut menunjukkan hubungan yang berbanding terbalik dengan daya inhibisi terhadap aktivitas enzim α-glukosidase. Semakin rendah nilai absorbans yang dihasilkan, semakin tinggi daya inhibisi terhadap aktivitas enzim

α-glukosidase.Daya inhibisi maksimum oleh ekstrak diperoleh pada konsentrasi 25 ppm, yaitu sebesar 49% (Gambar 3). Seiring dengan peningkatan konsentrasi ekstrak, daya inhibisi terhadap kerja enzim α-glukosidase pun semakin meningkat. Berdasarkan hasil interpolasi persamaan regresi dari data yang diperoleh (Lampiran 2), ekstrak A. Filaria mampu menginhibisi 50% kerja enzim (IC50) pada konsentrasi 26 ppm. Ekstrak sampel dapat dinyatakan memiliki aktivitas antihiperglikemik karena memiliki nilai IC50 di bawah 100 ppm (Dewiyanti et al. 2012).

Berdasarkan penelitian Wil et al. (2014), ekstrak kasar daun Aquilaria malacenssis positif mengandung steroid, terpenoid, flavonoid, saponin, tanin, dan alkaloid. Oleh karena itu, daun sampel yang digunakan sebagai sampel diduga memiliki kandungan senyawa yang serupa dengan A. malacenssis karena kedua tanaman tersebut berasal dari genus yang sama. Namun demikian, ekstrak daun A. filaria telah menunjukkan hasil negatif terhadap uji alkaloid (Hadi dan Bremner 2001).

7

Tabel 1 Inhibisi enzim α-glukosidase oleh beberapa ekstrak tanaman Sampel IC50 (ppm)

Aquilaria filaria (daun)a _26.133

Gracilaria edulisb 46

Sargassum polycystumb 50

Ulva lactucab ₅₃

Gracilaria corticatab ₈₇

Barleria prionitis L. (daun)c 501.37

Ruellia tuberosa (daun)c 98.5

Annona squamosa L. (daun)c _90.47

Jatropha curcas L. (daun)c 29.67

Kuersetind 10.20

a_{Sampel yang digunakan;} b_{Sumber: Kumar dan Sudha (2012);} c_{Sumber: Mun}’i_{m et al. (2013);}

d_{Sumber: Dewiyanti et al. (2012)}

Berdasarkan Tabel 1, dapat terlihat bahwa ekstrak sampel memiliki nilai IC50 lebih rendah bila dibandingkan dengan beberapa ekstrak tanaman yang telah diuji oleh Kumar dan Sudha (2012) dan Mun’im et al. (2013). Hal ini dimungkinkan kadar senyawa aktif antihiperglikemik dalam ekstrak kasar sampel cukup tinggi. Selain itu, kandungan senyawa antioksidan sampel diduga mampu menginhibisi kerja enzim α-glukosidase. Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan oleh Widowati (2008), senyawa antioksidan yang berasal dari berbagai tanaman mampu mengendalikan kadar glukosa dalam darah dan mencegah komplikasi diabetes. Namun aktivitas antihiperglikemik ekstrak kasar sampel masih lebih rendah dibandingkan dengan kuersetin, senyawa golongan flavonoid, yang telah diuji oleh Dewiyanti et al. (2012).

Berbagai macam senyawa antioksidan seperti yang terdapat dalam vitamin dan suplemen, juga tanaman dan buah-buahan segar telah dikembangkan saat ini dalam penanganan stres oksidatif pada DM. Hal ini dikarenakan antioksidan telah menunjukkan efektivitasnya dalam menurunkan risiko perkembangan DM dan komplikasinya (Zatalia dan Sanusi 2013).

Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase

8

Gambar 4 Plot Michaelis-Menten larutan kontrol berdasarkan teoritis ( ) dan hasil percobaan ( )

Analisis dilanjutkan dengan membuat beberapa plot persamaan, yaitu Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf, dan Eadie-Hofstee dengan menggunakan data kinetik yang diperoleh (Lampiran 3). Plot Lineweaver-Burk dengan sumbu x berupa 1/[S] dan sumbu y berupa 1/V memiliki nilai R2 sebesar 0.6861 untuk percobaan tanpa ekstrak dan 0.9881 untuk percobaan dengan menggunakan larutan ekstrak A. filaria 25 ppm (Gambar 5). Plot Hanes-Woolf dengan sumbu x berupa S dan sumbu y berupa S/V memiliki nilai R2 sebesar 0.7101 untuk percobaan tanpa ekstrak dan 0.0555 untuk percobaan dengan menggunakan ekstrak sampel 25 ppm (Gambar 7), sedangkan plot Eadie-Hofstee dengan sumbu x berupa V/S dan sumbu y berupa V memiliki nilai R2 sebesar 0.37 untuk percobaan tanpa ekstrak dan 0.0065 untuk percobaan dengan menggunakan ekstrak sampel 25 ppm (Gambar 8). Hasil plot menunjukkan bahwa persamaan Lineweaver-Burk memiliki nilai R2 paling tinggi yaitu 0.9881 untuk percobaan dengan menggunakan ekstrak 25 ppm. Nilai R2 yang mendekati 1 menunjukkan hubungan yang positif antara 1/[S] dan 1/V. Berdasarkan hal tersebut, dapat dikatakan bahwa analisis dengan menggunakan metode Lineweaver-Burk memiliki linearitas yang baik sehingga analisis dapat memberikan respon yang baik. Dengan demikian, penentuan nilai Km dan Vmax untuk inhibisi enzim α-glukosidase pada percobaan dilakukan dengan menggunakan persamaan Lineweaver-Burk.

Nilai Km menunjukkan konsentrasi substrat yang diperlukan untuk mencapai mencapai setengah dari kecepatan reaksi enzimatis maksimum. Nilai Km yang rendah menandakan afinitas enzim terhadap substrat tinggi, sedangkan nilai Km yang tinggi menandakan afinitas enzim terhadap substrat rendah (Campbell dan Farrell 2009). Beberapa faktor yang mempengaruhi nilai Km, yaitu jenis substrat, kondisi lingkungan, dan kekuatan ion (Risma 2012). Keberadaan ekstrak daun A. filaria 25 ppm pada percobaan meningkatkan nilai Km dari 0.30 menjadi 3.64, sedangkan untuk nilai Vmaks menurun dari yaitu 2.18 menjadi 1.37 (Lampiran 4). Mekanisme inhibisi yang mengakibatkan terjadinya penurunan nilai Vmaks dan

9

peningkatan nilai Km merupakan mekanisme inhibisi campuran (Campbell dan Farrell 2009). Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, ekstrak daun A. filaria memiliki potensi sebagai inhibitor enzim α-glukosidase dan berdasarkan hasil analisis terhadap nilai Km dan Vmaks dengan menggunakan plot Lineweaver-Burk menunjukkan bahwa mekanisme inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak daun A. filaria tergolong tergolong inhibisi campuran. Mekanisme tersebut serupa dengan ekstrak Aegle marmeros 8 ppm yang telah diuji oleh Gurudeeban et al. (2012), senyawa kuersetin, dan asam trans-sinamat yang telah diuji oleh Everette et al. (2013).

Gambar 5 Plot Lineweaver-Burk analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase tanpa adanya ekstrak () dan dengan adanya ekstrak daun A. filaria 25 ppm ()

Gambar 6 Mekanisme inhibisi campuran (Sharma 2012)

Inhibitor campuran tergolong inhibitor reversibel. Tipe inhibitor campuran tidak memiliki struktur yang serupa dengan substrat, tetapi inhibitor akan berikatan dengan enzim bebas dan kompleks enzim-substrat sehingga kehadiran substrat tidak berpengaruh terhadap kemampuan inhibitor untuk mengikat enzim dan

10

sebaliknya (Gambar 6). Namun ikatan yang terbentuk, meskipun jauh dari tapak aktif, akan mengubah konformasi enzim dan mengurangi aktivitas katalitik karena adanya perubahan sifat kelompok katalitik pada tapak aktif (Sharma 2012). Nilai Km yang lebih besar dengan adanya penambahan ekstrak sampel dibandingkan tanpa adanya ekstrak menunjukkan bahwa afinitas atau daya tarik enzim terhadap ekstrak sampel lebih tinggi dibandingkan terhadap substrat p-NPG. Senyawa dalam ekstrak sampelyang bertindak sebagai inhibitor campuran mengikat enzim bebas dan enzim terikat substrat sehingga mengganggu katalisis dan pengikatan substrat. Hal inilah yang menyebabkan terjadinya penurunan nilai Vmaks dan peningkatan

pada nilai Km.

Gambar 7 Plot Hanes-Woolf analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase tanpa adanya ekstrak () dan dengan adanya ekstrak daun A. filaria 25 ppm ()

11

Namun demikian, pendekatan kinetika inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak sampel dengan menggunakan plot Lineweaver-Burk masih memiliki kelemahan. Mekanisme inhibisi yang diperoleh dari hasil perpotongan plot tersebut belum bisa menunjukkan jenis senyawa kandungan ekstrak yang berperan sebagai inhibitor dalam reaksi enzimatis yang terjadi. Kemampuan ekstrak etanol sampel dalam menginhibisi enzim α-glukosidase menunjukkan adanya senyawa dalam ekstrak tersebut yang mampu mengganggu jalannya reaksi antara substrat dan enzim. Namun demikian, belum dapat dipastikan jenis senyawa yang berperan sebagai inhibitor dalam reaksi enzimatis tersebut.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Hasil dari penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun A. filaria memiliki potensi sebagai antihiperglikemik dengan IC50 di bawah 100 ppm. Ekstrak etanol A. filaria dapat bertindak sebagai inhibitor yang mampu menginhibisi kerja dari enzim α-glukosidase melalui mekanisme inhibisi campuran sehingga terjadi penurunan nilai Vmaks kurang dari 50% dan peningkatan nilai Km lebih dari 100%.

Saran

Perlu ditelusur lebih lanjut senyawa spesifik yang memengaruhi daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas enzim α-glukosidase dan tingkat keamanan penggunaan ekstrak. Dapat pula dilakukan uji lanjutan (in vivo) untuk melihat pengaruh ekstrak terhadap mekanisme absorpsi, metabolisme, dan ekskresi dalam tubuh. Selain itu, perlu dicari pendekatan kinetika yang sesuai untuk menjelaskan mekanisme inhibisi enzim α-glukosidase.

DAFTAR PUSTAKA

Affandi H, Arif N, Maya M, Rojak. 2013. Antioxidant and antihyperglycemic potentials of gaharu leaves (Aquilaria malaccensis) from various extraction process. [laporan penelitian]. Bogor (ID): SEAMEO Biotrop.

Bangun TJF. 2013. Aquilaria filaria (Oken) Merr. [Internet]. [diunduh 2014 Mar 13]. Tersedia pada: http://www.tropicos.org/Image/100247622

Berg JM, John LT, Lubert S. 2004. Biochemistry. Ed ke-5. New York (US): WH Freeman.

Campbell MK, SO Farrell. 2009. Biochemistry. Ed ke-6. Pacific Grove (CA): Thomson Brooks/ Cole.

Dewiyanti ID, Euis F, Megawati, Tri Y. 2012. The antidiabetic activity of cocor

12

Everette JD, Richard BW, Shahidul I. 2013. Inhibitory activity of naturally occurring compounds towards rat intestinal α-glucosidase using p -nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-G) as a substrate. Am J Food Technol. 8(1):65-73.doi: 10.3923/ajft.2013.65.73.

Gupta V, Bipin BK, SK Tiwari, KHHVSS Narasimha M. 2013. A review on antidiabetic action of Asanadi gana. Int J Res Ayuverda Pharm. 4(5):638646. Gurudeeban S, Kaliyamurthi S, Thirugnanasambandam R. 2012. Alpha glucosidase inhibitory effect and enzyme kinetics of coastal medicinal plants. Bangladesh J Pharmacol. 7:186-191.doi: 10.3329/bjp.v7i3.11499.

Hadi S, JB Bremner. 2001. Initial studies on alkaloids from Lombok medicinal plants. Molecules. 6:117-129.

Hartika R. 2009. Aktivitas inhibisi α-glukosidase ekstrak senyawa flavonoid buah mahkota dewa [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

He L. 1998. Alpha-glucosidase inhibitors as agent in the treatment of diabetes. Diabetes Reviews. 6(2):132-145.

Kumar PS, S Sudha. 2012. Evaluation of alpha-amylase and alpha-glucosidase inhibitory properties of selected seaweeds from gulf of mannar. Int Res J Pharm. 3(8):129-130.

Mayur B, Sancheti S, S Shruti, Seo SY. 2010. Antioxidant and α-glucosidase inhibitory properties of Carpesium abrotanoides L.. J Med Plant Res. 4(15):1547-1553.doi: 10.5897/JMPR10.210.

Mega IM, Swastini DA. 2010. Screening fitokimia dan aktivitas antiradikal bebas ekstrak metanol daun gaharu (Gyrinops versteegii). J Kim. 4(2):187-192. Muchid et al.. 2005. Pharmaceutical Care untuk Penyakit Diabetes Mellitus.

Jakarta (ID): Direktorat Bina farmasi Komunitas dan Klinik Direktorat Jenderal Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan Departemen Kesehatan RI.

Mun’im A, Katrin, Azizahwati, A Andriani, KF Mahmudah, M Mashita. 2013.

Screening of α-glucosidase inhibitory activity of some Indonesian medicinal plants. J Med Arom Plants. 2(2):144-150.

Murray, Robert K, Daryl KG, Victor WR. 2009. Biokimia Harper. Edisi ke-27. Brahm U, penerjemah. Jakarta (ID): Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry. Edisi ke-27.

[NCBI] National Center for Biotechnology Information. 2014. Aquilaria filaria tRNA-Leu (trnL) gene and trnL-trnF intergenic spacer, partial sequence; chloroplast gene for chloroplast product [Internet]. [diunduh 2014 Mar 13]. Tersedia pada: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/28932845

Nova. 2015. Ha, 90 persen penyakit diabetes karena gaya hidup!. [Internet]. [diunduh 2015 Feb 11]. Tersedia pada: http://palembang.tribunnews.com/ 2015/01/22/ha-90-persen-penyakit-diabetes-karena-gaya-hidup

Ojima T. 2013. Studies on enzymatic synthesis of functional sugars [disertasi]. Nagoya (JP): Nagoya University.

Risma D. 2012. Isolasi dan karakterisasi enzim α-glukosidase dari beras lapuk (Oryza sativa) [skripsi]. Depok (ID): Universitas Indonesia.

Sancheti S, Sandesh S, Sung YS. 2009. Chaenomeles sinensis: A potent α-and β -glucosidase inhibitor. AmJ Pharm and Toxicol. 4(1):8-11.

13

Sharma R. 2012. Enzyme inhibition: mechanisms and scope, enzyme inhibition and bioapplications. [Internet]. [diunduh 2015 Jan 20]. Tersedia pada: http://cdn.intechopen.com/polffs-wm/36550-pdf

Sugiwati S. 2005. Aktivitas antihiperglikemik dari ekstrak buah mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.] sebagai inhibitor alfa glukosidase in vitro dan in vivo pada tikus putih [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. [The Plant List]. 2013. Aquilaria versteegii (Gilg) Hallier f. [Internet]. [diunduh 2014 Nov 11]. Tersedia pada: http://theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2644571

[Tropicos]. 2014. Aquilaria filaria (Oken) Merr. [Internet]. [diunduh 2014 Mar 13]. Tersedia pada: http://www.tropicos.org/Name/50314819

[WHO] World Health Organization. 2006. Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycemia : report of a WHO/ IDF consultation. Geneva (CH): WHO.

Widowati W. 2008. Potensi antioksidan sebagai antidiabetes. JKM. 7(2):1-11. Wil NNAN, NAM Omar, Noorhuda AI, Saiful NT. 2014. In vitro antioxidant

activity and phytochemical screening of Aquilaria malacenssis leaf extracts. J Chem Pharm Res. 6(12):688-693.

14

LAMPIRAN

Lampiran 1 Diagram Alir Penelitian

Lampiran 2 Daya inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak daun A. Filaria

Konsentrasi ekstrak

A.filaria (ppm) Absorbans terkoreksi Inhibisi (%)

0 0.245 0.000

Lampiran 3 Data pengujian kinetika inhibisi enzim α-glukosidase

[S] 1/[S] V1 V2 1/V1 1/V2 S/V1 S/V2 V1/S V2/S

Pengujian Inhibisi terhadap Aktivitas Enzim α-Glukosidase

15

Keterangan:

S : konsentrasi p-NPG (mM) V1 : Absorbans kontrol

V2 : Absorbans A. Filaria 25 ppm

Lampiran 4 Cara penghitungan nilai Km dan Vmax

Larutan a b R2 _{Km Vmax} Tanpa ekstrak 0.1367 0.4585 0.6861 0.30 2.18 Dengan ekstrak A. filaria 25 ppm 2.6635 0.7308 0.9881 3.64 1.37 Contoh perhitungan:

= +

�

=

��

����� [�]

+

�����

0.4585 =

�����

Vmaks = . Vmaks = 2.18

0.1367 = ��

�����

16

RIWAYAT HIDUP