Validasi metode ekstraksi DNA pada analisis DNA babi dalam produk bakso

 

VALIDASI METODE EKSTRAKSI DNA

PADA ANALISIS DNA BABI DALAM PRODUK BAKSO

ANDIKA ARDI

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

 

ABSTRAK

ANDIKA ARDI. Validasi Metode Ekstraksi DNA pada Analisis DNA Babi dalam

Produk Bakso. Dibimbing oleh PURWANTININGSIH SUGITA dan HENNY

NURAINI.

Banyak kasus pemalsuan produk pangan berbahan dasar daging yang dijumpai

di masyarakat. Reaksi rantai polimerase (PCR) telah dikembangkan sebagai

metode yang tepat dan cepat untuk mengidentifikasi spesies daging baik dari

daging mentah maupun produk makanan olahan daging. Ekstraksi merupakan titik

kritis pada analisis PCR karena sangat berkaitan dengan mutu DNA yang diisolasi.

Oleh karena itu, validasi metode ekstraksi dilakukan dalam penelitian ini untuk

memastikan bahwa hasil ekstraksi memiliki mutu DNA yang baik. Metode

ekstraksi DNA yang telah divalidasi selanjutnya diuji sensitivitasnya untuk

mendeteksi kontaminasi daging babi dalam produk bakso yang diberi variasi

cemaran daging babi serta dalam produk bakso yang dijual di Kota Bogor. Hasil

validasi menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA memiliki limit deteksi

kemurnian DNA sebesar 0.117, limit kuantitasi kemurnian DNA sebesar 0.389,

persen simpangan baku relatif sebesar 2.31%, dan ketidakpastian kemurnian DNA

sebesar (1.93 ± 0.04). Cemaran babi masih dapat terdeteksi hingga tingkat

cemaran 0.5% (b/b), dan tidak ditemukan cemaran daging babi pada sampel bakso

dari 3 pasar di Kota Bogor (Pasar Anyar, Pasar Bogor, dan Pasar Warung Jambu)

ABSTRACT

ANDIKA ARDI. Validation of DNA Extraction Methods on DNA Analysis of

Pork in Meatball Products. Supervised by PURWANTININGSIH SUGITA and

HENNY NURAINI.

 

VALIDASI METODE EKSTRAKSI DNA

PADA ANALISIS DNA BABI DALAM PRODUK BAKSO

ANDIKA ARDI

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada

Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

 

Judul Skripsi : Validasi Metode Ekstraksi DNA pada Analisis DNA Babi

dalam Produk Bakso

Nama

: Andika Ardi

NIM :

G44096021

Disetujui

Pembimbing I

Prof Dr Purwantiningsih Sugita, MS

NIP 19631217 198803 2 002

Pembimbing II

Dr Ir Henny Nuraini, MSi

NIP 19640202 198903 2 001

Diketahui

Ketua Departemen Kimia

Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS

NIP 19501227 197603 2 002

 

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas berkat limpahan

rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul

Validasi Metode Ekstraksi DNA pada Analisis DNA Babi dalam Produk Bakso.

Salawat serta salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW,

keluarganya, dan semoga kita semua menjadi pengikutnya hingga akhir zaman.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Purwantiningsih Sugita,

MS dan Dr Ir Henny Nuraini, MSi selaku pembimbing yang senantiasa

memberikan arahan, dorongan semangat, dan doa kepada penulis selama

melaksanakan penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada

Kepala

Laboratorium Genetika Molekuler Prof Dr Ir Muladno, MSA, koordinator

laboratorium Eryk Andreas, SPt, MSi dan rekan-rekan di laboratorium atas

bantuan serta masukan selama penelitian berlangsung.

Terima kasih tak terhingga penulis ucapkan kepada Ayah, Ibu, serta seluruh

keluarga, atas doa dan kasih sayangnya. Kepada Eris, Mas Yana, Gina, Idis, Mbak

Ana, dan teman-teman Ekstensi Kimia angkatan 2009 yang telah banyak

membantu, memberikan saran, semangat, motivasi, dan dorongan selama

penelitian, penulis ucapkan terima kasih.

Penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan.

Bogor, Februari 2012

 

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 22 Desember 1987 sebagai putra

pertama dari Bapak H Mawardi dan Ibu Hj Syamsidar. Penulis lulus dari SMA

Negeri 2 Bogor pada tahun 2006 dan pada tahun yang sama diterima di Akademi

Kimia Analisis (AKA) Bogor melalui jalur seleksi tes tulis. Penulis lulus dari

AKA Bogor dengan predikat

sangat memuaskan

pada tahun 2009 dan

melanjutkan pendidikan S1 melalui Program Penyelenggaraan Khusus

Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut

Pertanian Bogor (IPB) pada tahun yang sama.

vi 

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... vii

DAFTAR GAMBAR ... vii

DAFTAR LAMPIRAN ... vii

PENDAHULUAN ... 1

METODE

Bahan dan Alat ... 1

Lingkup Kerja ... 2

Proses Pembuatan Bakso ... 2

Ekstraksi DNA ... 2

Pengujian DNA Total ... 2

Penentuan Konsentrasi dan Indeks Kemurnian DNA .. ... 3

Pengujian DNA dengan PCR ... 3

Validasi Metode Ekstraksi ... 3

Identifikasi Sampel Pasaran ... 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Validasi Metode Ekstraksi DNA ... 4

Identifikasi Bakso ... 6

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan ... 10

Saran ... 10

DAFTAR PUSTAKA ... 10

LAMPIRAN ... 11

vii 

DAFTAR TABEL

Halaman

1

Hasil uji limit deteksi dan limit kuantitasi metode ekstraksi DNA pada sampel

bakso dengan cemaran ... 5

2

Hasil uji presisi dan keterulangan metode ekstraksi DNA pada sampel bakso

dengan cemaran ... 5

3

Hasil uji ketidakpastian kemurnian metode ekstraksi DNA pada sampel bakso

dengan cemaran ... 6

4

Sekuens primer

reverse

spesifik fragmen DNA sapi dan babi ... 6

5

Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA bakso dengan 7 variasi cemaran ... 8

6

Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA bakso dari pasar ... 9

 

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1

Fase yang terbentuk sesudah proses ekstraksi fenol-kloroform ... 5

2

Visualisasi DNA hasil ekstraksi pada gel agarosa 1%: sampel bakso dengan

berbagai macam variasi cemaran (1–7) (a); sampel bakso pasar (1–10) (b). .... 6

3

Interaksi antara etidium bromida (EtBr) dan DNA ... 6

4

Proses reaksi PCR ... 8

5

Visualisasi hasil amplifikasi DNA sampel bakso dengan berbagai macam

variasi cemaran pada gel agarosa 2% ... 8

6

Visualisasi hasil amplifikasi DNA sampel bakso dari pasar pada gel agarosa

2% ... 9

 

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1

Bagan tahapan penelitian ... 12

2

Pengolahan data uji limit deteksi, limit kuantitasi, dan presisi ... 13

3

Pengolahan data ketidakpastian kemurnian DNA ... 14

 

PENDAHULUAN

Produk makanan olahan pada saat ini sedang berkembang di Indonesia. Banyaknya variasi bentuk produk makanan olahan, terutama berbahan dasar daging, yang beredar di masyarakat harus diperhatikan. Pemalsuan produk makanan olahan berbahan dasar daging sering ditemui di lingkungan masyarakat secara luas dan semakin mengkhawatirkan. Akhir-akhir ini sering diberitakan di media massa, adanya campuran lain pada bahan baku produk tersebut, seperti daging dari jenis (spesies) yang menjadi bahan utamanya, yaitu daging sapi (Margawati & Ridwan 2010).

Beberapa produk makanan olahan daging seperti abon, sosis, dan bakso diduga telah tercemar oleh kontaminan daging babi. Bakso merupakan salah satu produk makanan olahan daging yang sangat populer dan disukai masyarakat Indonesia. Hal ini tentu saja merugikan konsumen produk makanan olahan tersebut karena menyangkut kehalalan dari suatu produk. Kehalalan produk merupakan hal yang penting dari suatu produk yang dijual kepada masyarakat. Lebih dari 70% masyarakat muslim seluruh dunia mengacu pada produk makanan berstandar halal (Hayyan et al. 2009). Di Indonesia pada tahun 1989, Majelis Ulama Indonesia (MUI) membentuk suatu departemen, yaitu Lembaga Pengkajian Pangan, Obat-obatan, dan Kosmetika Majelis Ulama Indonesia (LP POM MUI) untuk membuat regulasi atas kehalalan produk yang ada di masyarakat. Masalah cemaran daging babi dalam suatu produk makanan halal sedang menjadi perhatian khusus LP POM MUI saat ini. Oleh sebab itu, diperlukan penelitian-penelitian tentang validasi ataupun verifikasi mengenai metode-metode analisis yang dapat diterapkan pada permasalahan ini.

Identifikasi DNA suatu spesies dapat membantu untuk mengetahui apakah suatu produk telah tercemar oleh bahan yang bukan seharusnya. Telah banyak pengembangan metode analisis DNA untuk menemukan adanya indikasi cemaran babi dalam suatu produk makanan olahan. Salah satunya adalah dengan metode reaksi rantai polimerase (PCR) (Matsunaga et al. 1999) yang berdasarkan identifikasi sidik jari (Saez et al.

2004). Salah satu faktor penting dalam analisis DNA dengan metode PCR adalah isolasi DNA yang antara lain meliputi proses ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekular dan

menjadi titik kritis yang sangat memengaruhi hasil analisis. Jumlah dan mutu DNA hasil ekstraksi akan memengaruhi analisis lebih lanjut dengan PCR.

Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut telah memenuhi persyaratan untuk digunakan. Validasi metode dilakukan untuk menentukan apakah hasil analisis suatu metode telah sahih dan dapat dipertanggungjawabkan. Validasi metode ekstraksi DNA berguna untuk memastikan bahwa hasil ekstraksi yang dihasilkan sahih terhadap parameter-parameter uji validasi yang dilakukan, sehingga didapatkan mutu DNA yang baik serta hasil analisis DNA yang baik dan sahih.

Penelitian ini bertujuan memvalidasi metode ekstraksi DNA dalam produk bakso sehingga setiap parameter yang diujikan akan memberikan hasil yang sahih. Selain itu, dapat diketahui jumlah cemaran terkecil yang masih dapat diidentifikasi secara PCR. Metode yang telah divalidasi selanjutnya digunakan untuk mengidentifikasi sampel di pasaran.

METODE

Bahan dan Alat

Alat-alat yang digunakan antara lain alat-alat kaca, tabung eppendorf, mikropipet, vorteks, inkubator, spektrofotometer GeneQuant 1300, mesin PCR GeneAmp® PCR system 9700 (Applied BiosystemsTM), satu set alat elektroforesis gel agarosa (MUPID), dan kamera Polaroid (MP 4 Polaroid camera + UV transluminator).

(spesifik babi), dNTP, agarosa, etidium bromida (EtBr), bufer 0.5× tris borat EDTA (TBE), loading dye (biru bromtimol), DNA

marker (100 bp). Enzim yang digunakan ialah proteinase-K 5 mg/mL dan Tag DNA polymerase (Fermetas).

Lingkup Kerja

Lingkup kerja penelitian ini diringkaskan dalam bagan tahapan penelitian di Lampiran 1. Tahapan yang dilakukan meliputi validasi metode ekstraksi berdasarkan parameter validasi yang diuji, penentuan tingkat cemaran terkecil, dan pengujian sampel dari pasar.

Proses Pembuatan Bakso

Daging sapi segar yang sudah dibersihkan lemaknya dipotong kecil-kecil, kemudian ditambahkan daging babi (0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, dan 20% b/b) dan dimasukkan ke dalam food processor. Setelah itu, dimasukkan bahan tambahan seperti es batu, tepung tapioka, garam, bawang putih, natrium tripolifosfat (STPP), dan merica dengan komposisi masing-masing 40, 20, 15, 10, 5, dan 0.5% dari total bobot daging. Adonan selanjutnya dicetak berbentuk bulatan-bulatan bakso dan dimasukkan ke dalam panci yang berisi air mendidih (80 oC) selama 15 menit. Bulatan-bulatan bakso dimasak kembali pada air mendidih (100 oC), lalu diangkat dan ditiriskan selama 15 menit. Bakso dikemas dalam plastik untuk selanjutnya diekstraksi.

Ekstraksi DNA

Sampel yang digunakan merupakan produk olahan daging yang tercemar daging babi. Ekstraksi DNA pada sampel dilakukan dengan menggunakan metode standar fenol-kloroform (Sambrook et al. 1989) yang telah dimodifikasi untuk produk tercemar daging babi.

Preparasi Sampel

Sebanyak 75 mg sampel bakso diambil dari 5 titik yang tersebar pada sampel. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL.

Degradasi Protein

Sampel dalam tabung ditambahkan 1× STE sampai volume 340 µL, 40 µL SDS 10%, dan 20 µL protein kinase K 5 mg/mL. Campuran diinkubasi pada suhu 55 oC selama 2 jam sambil digoyang perlahan.

Degradasi Bahan Organik

Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan 400 µL larutan fenol, 400 µL kloroform-isoamil alkohol (24:1), dan 40 µL NaCl 5 M. Campuran digoyang dalam suhu kamar selama 1 jam.

Presipitasi DNA

Sampel hasil ekstraksi selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit hingga fase air terpisah dengan fase fenol. Fase air dipindahkan ke dalam tabung baru dengan volume terukur (± 400 µL). Molekul DNA diendapkan dengan cara menambahkan 800 µL alkohol absolut dan 40 µL NaCl 5 M. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC selama semalam, dan selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 1 menit. Endapan DNA yang diperoleh dicuci dengan alkohol 70% kemudian diendapkan lagi. Endapan DNA yang telah bersih dari alkohol dipulihkan dengan menambahkan 100 µL TE. Sampel DNA disimpan pada suhu -20 oC dan siap digunakan.

Pengujian DNA Total

Pengujian DNA hasil ekstraksi secara kualitatif dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1%. Gel dibuat dari 0.3 g agarosa dan 30 mL larutan bufer (0.5 × TBE) yang dipanaskan. Larutan agarosa dibiarkan agak dingin sambil diaduk dengan pengaduk magnet, lalu ditambahkan 1.25 μL pewarna etidium bromida. Sebanyak 5 μL sampel DNA dilarutkan dalam 1 μL loading dye, lalu elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tegangan konstan 100 volt sampai pewarna mencapai bagian bawah gel.

Pengujian DNA hasil ekstraksi secara kuantitatif dilakukan dengan spektrofotometer GeneQuant 1300. Sampel DNA 3 μL dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL dan ditambahkan akuades 597 μL. Larutan TE digunakan sebagai blangko, dibuat dengan cara yang sama, yaitu sebanyak 3 μL larutan TE ditambah 597 µL akuades, lalu dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL. Sampel dan blangko di-spin down

Penentuan Konsentrasi dan Indeks Kemurnian DNA (Muladno 2010)

Konsentrasi DNA sampel yang didapat dari isolasi diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 260 dan 280 nm. Apabila kerapatan optis (optical density) pada 260 nm atau OD260 sama dengan satu, maka konsentrasi DNA setara 50 µg/mL. Kemurnian DNA ditentukan dengan indeks kemurnian (nisbah A260/A280). DNA dikatakan murni bila memiliki indeks kemurnian 1.8_2.0.

[DNA] (µg/mL) = fp 50 g/mL

260 × × μ

A

Indeks Kemurnian DNA =

260 260 A A

Keterangan:

[DNA] = konsentrasi DNA fp = faktor pengenceran

A260 = absorbans pada 260 nm

A280 = absorbans pada 280 nm

Pengujian DNA dengan PCR

Amplifikasi Fragmen DNA Spesifik Sapi dan Babi

Amplifikasi fragmen DNA spesifik dilakukan dengan metode PCR. Komponen reaksi yang digunakan sebanyak 25 µL, terdiri atas 50 µg sampel DNA, primer forward 15 pmol, primer reverse 5 pmol, campuran dNTP 200 µM, MgCl2 1 mM, dan Taq polymerase

0.5 unit beserta bufernya. Proses amplifikasi dijalankan dengan kondisi denaturasi awal pada suhu 95 oC selama 5 menit, kemudian dilakukan 35 siklus yang terdiri atas denaturasi pada suhu 95 oC selama 45 detik, penempelan primer pada suhu 60 oC selama 45 detik, dan pemanjangan DNA baru pada suhu 72 oC selama 1 menit. Setelah itu, pemanjangan akhir dilakukan pada suhu 72 oC selama 5 menit.

Elektroforesis dan Visualisasi Produk PCR

Produk PCR divisualisasikan dengan teknik elektroforesis gel agarosa 2%. Gel dibuat dari 0.6 g agarosa dan 30 mL larutan bufer (0.5 × TBE) yang dipanaskan. Larutan agarosa dibiarkan agak dingin sambil diaduk dengan pengaduk magnet, lalu ditambahkan 2.5 μL pewarna etidium. Sebanyak 5 μL produk PCR dilarutkan dalam 1 μL loading dye. Elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tegangan 100 volt atau sampai pewarna

biru bromtimol mencapai bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk dilakukan pemotretan menggunakan UV.

Validasi Metode Ekstraksi

Limit Deteksi (LD) dan Limit Kuantitasi (LK)

Penentuan limit deteksi dan limit kuantitasi dilakukan dengan mengukur kemurnian DNA hasil ekstraksi sebanyak 7 kali ulangan dengan spektrofotometer. Nilai limit deteksi dan limit kuantitasi diperoleh dari persamaan berikut:

SB 3 LD= ×

SB LK=K× Keterangan :

LD = limit deteksi LK = limit kuantitasi

SB = Simpangan baku kemurnian DNA

K = koefisien limit kuantitasi (K=10)

Presisi

Uji presisi dilakukan dengan mengukur kemurnian DNA hasil ekstraksi sebanyak 7 kali ulangan dengan spektrofotometer. Nilai persen simpangan baku relatif (SBR) dari 7 ulangan tersebut berdasarkan rekomendasi IUPAC dengan persamaan

1 1 2 ) -( SB − ∑ = = n n

i xi x

100% (%)

SBR = ×

x

SB

Keterangan:

SB = simpangan baku kemurnian DNA

xi = konsentrasi DNA pada setiap

ulangan

x

= konsentrasi DNA rata-rata

n = jumlah pengulangan SBR = simpangan baku relatif

Ketidakpastian Kemurnian DNA

(Uncertainty for Purity)

  Ketidakpastian presisi: 1 -1 2 ) -( ) ( n n

i xi xm p

u

∑ = =

Ketidakpastian baku rata-rata:

n m x u m u ) ( = Ketidakpastian gabungan: 2

⎟

⎟

⎠

⎞

⎜

⎜

⎝

⎛

= m x m u c u Ketidakpastian diperluas: c u k e u = ×

Pelaporan ketidakpastian kemurnian DNA:

[

]

±u_e

= Kemurnian DNA DNA

Kemurnian

Keterangan:

xm = rerata kemurnian DNA n = banyaknya sampel

k = faktor ketidakpastian dimana k adalah 2 untuk n-1 > 6 untuk selang kepercayaan 95% (IUPAC 2002)

Identifikasi Sampel Pasaran

Sampel diambil dari 3 pasar di Kota Bogor, yaitu Pasar Anyar, Pasar Bogor, dan Pasar Jambu Dua. Pengambilan sampel ditujukan pada pedagang-pedagang bakso yang membuat sendiri bakso yang dijualnya. Total sampel yang diambil sebanyak 2 butir per pedagang dengan rincian jumlah pedagang per pasar sebagai berikut: 3 pedagang dari Pasar Anyar (A1, A2, dan A3), 1 pedagang dari Pasar Bogor (B1), dan 1 pedagang dari Pasar Warung Jambu (J1). Tahapan pengujian sama seperti pada bakso yang dibuat dengan campuran daging babi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Teknik analisis berdasarkan DNA telah banyak digunakan dalam berbagai bidang. Sektor pangan merupakan salah satunya, yang memfokuskan pada pengujian keamanan bahan pangan untuk dikonsumsi.

Berkembangnya industri pangan menuntut masyarakat untuk lebih waspada terhadap keamanan bahan pangan yang dikonsumsi. Keamanan pangan didefinisikan sebagai kondisi dan upaya yang diperlukan untuk mencegah bahan pangan dari kemungkinan tercemari bahan biologis, kimia, dan bahan lain yang dapat mengganggu, merugikan, dan membahayakan kesehatan manusia (Peraturan Pemerintah Nomor 28 Tahun 2004). Maraknya pemalsuan produk makanan olahan saat ini membuat konsumen sangat dirugikan. Masalah kehalalan produk pangan sering ditemui, seperti adanya cemaran selain daging sapi, khususnya cemaran daging babi, pada produk makanan olahan bakso.

Identifikasi DNA secara PCR merupakan salah satu solusi untuk menyelesaikan masalah pemalsuan produk pangan. Teknik analisis PCR merupakan salah satu teknik deteksi dan identifikasi jenis hewan yang terkandung dalam suatu produk pangan yang sangat praktis diaplikasikan, akurat, dan mempunyai kelebihan dapat mendeteksi protein yang sudah terdegradasi (matang atau produk olahan) dalam kandungan yang sangat sedikit (μg) (Nuraini 2004). Ada beberapa tahapan pada analisis DNA dengan teknik PCR, salah satunya ialah isolasi DNA, yaitu proses ekstraksi dan amplifikasi DNA.

Validasi Metode Ekstraksi DNA

Isolasi DNA merupakan tahapan terpenting dalam analisis DNA. Ekstraksi merupakan proses yang sangat kritis dalam isolasi DNA dan memengaruhi mutu DNA yang diisolasi. Mutu DNA lebih lanjut akan mempengaruhi hasil amplifikasi DNA yang dilakukan.

kontaminan terjadinya fo

Ekstraks akan mengh Lapisan takb (fase air) t Presipitasi dengan pe Setelah didi dengan TE. Gambar 1 Validasi untuk mem baik sehing akurat. Vali Sambrook e

yang diuji kuantitasi, kemurnian dilakukan d DNA yang d

Kemurn mengukur k dengan spe DNA berk Kemurnian serapan pad 280 nm (A26

Limit Dete (LK) Limit de analit yang memberikan dengan blan diartikan seb sampel yang dan saksam dan limit k kemurnian ulangan. Ha

 

. Isoamil

oaming. si dengan fe hasilkan 3 fase berwarna yan terbentuk di

DNA dalam enambahan a

iamkan 1 mal

Fase yang proses kloroform

i metode ekstr mastikan hasi gga didapatka

idasi dilakuka

et al (1989). meliputi l presisi, d DNA. Penil dengan melih

diperoleh (An ian DNA konsentrasi h ektofotometer

korelasi den diperoleh de da panjang gel

60/A280).

eksi (LD) da

eteksi merupa g dapat did n respons sign ngko, sedang bagai jumlah g masih mem ma (Harmita 2

kuantitasi diuj DNA hasil e asilnya dapat d

alkohol me

enol dan klo e larutan (Gam ng mengandun

atas lapisan fase air di alkohol dan

am, DNA dip

g terbentuk ekstraksi

raksi DNA di l ekstraksi b an hasil PCR an mengikuti

Parameter-pa limit deteksi dan ketidak

laian parame at indeks kem ntonia et al. 20

diperoleh hasil ekstraks

. Indeks kem ngan mutu engan melihat

lombang 260

an Limit Ku

akan jumlah deteksi dan nifikan diban gkan limit ku

terkecil anali menuhi kriteria 2004). Limit

ji dengan me ekstraksi seba dilihat pada Ta

[image:13.595.326.509.85.284.2]

encegah oroform mbar 1). ng DNA n fenol. ilakukan NaCl. pulihkan sesudah fenol-ilakukan bermutu R yang metode arameter i, limit kpastian eter uji murnian 008) dengan si DNA murnian DNA. t nisbah nm dan uantitasi terkecil masih dingkan uantitasi it dalam a cermat deteksi engukur anyak 7 abel 1.

Tabel 1 H ku pa ce Ulangan sampel 1 2 3 4 5 6 7 Rerata SB LD LK Tabel 1 ekstraksi D kemurnian D kuantitasi se deteksi dan li Lampiran 2.

Presisi

[image:13.595.330.506.520.678.2]

Presisi m beberapa ha dengan cara Presisi men variabilitas bersangkutan ditentukan de relatif kem pengulangan ekstraksi DNA

Tabel 2 Ha me bak Ulangan sampel 1 2 3 4 5 6 7 Rerata SB SBR(%

asil uji limit uantitasi meto ada sampel emaran n l kem a memperlihatk DNA memili DNA sebesar ebesar 0.389. imit kuantitas menunjukkan asil penguku a yang sama nggambarkan

hasil-hasil n. Presisi meto

engan menguk murnian DNA

sampel. Hasi A dapat diliha

asil uji presis etode ekstraks kso dengan ce n

l kem

a

%)

t deteksi dan ode ekstraksi bakso d Indeks murnian DNA 1.903 1.842 1.857 1.938 1.923 1.850 1.913 1.889 0.039 0.117 0.389

kan bahwa m iki limit d r 0.117 dan

Perhitungan si dapat diliha

kesesuaian uran yang a (Sumardi galat acak analisis ode ekstraksi kur simpangan

A dari 7 il uji presisi m at pada Tabel

Hasil pengukuran menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA yang dilakukan mempunyai persen SBR sebesar 2.31%. Nilai tersebut menunjukkan bahwa metode ekstraksi yang digunakan memiliki ketelitian sedang (2% < %SBR < 5%) dan metode ini sesuai digunakan dengan kondisi laboratorium. Perhitungan uji presisi dapat dilihat pada Lampiran 2.

Ketidakpastian Kemurnian DNA

Ketidakpastian merupakan gambaran rentang hasil pengukuran yang akan didapatkan (Harvey 2000). Ketidakpastian kemurnian DNA ditentukan untuk melihat kisaran galat yang masih dapat diterima dalam ekstraksi DNA serta melihat mutu DNA yang didapat. Ketidakpastian kemurnian DNA ditentukan dari hasil pengukuran indeks kemurnian DNA dengan spektrofotometer terhadap hasil 7 kali ulangan ekstraksi. Hasil uji ketidakpastian kemurnian DNA dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3 Hasil uji ketidakpastian kemurnian metode ekstraksi DNA pada sampel bakso dengan cemaran

Ulangan sampel

Indeks kemurnian DNA

1 1.812 2 1.842 3 2.067 4 1.847 5 2.071 6 2.020 7 1.857 Rerata 1.930

Perhitungan ketidakpastian kemurnian DNA selengkapnya diberikan pada Lampiran 3. Didapat nilai ketidakpastian sebesar (1.93±0.04). Nilai tersebut masih sesuai dengan kemurnian DNA optimum yaitu 1.80_2.00 (Sambrook & Russel 2001).

Identifikasi Bakso

Analisis PCR dilakukan pada penelitian ini untuk mengetahui adanya cemaran daging babi pada produk pangan olahan bakso. Sampel yang diuji terdiri atas 2 jenis, yaitu sampel bakso dengan variasi cemaran daging babi dan sampel yang ada di pasaran. Identifikasi terhadap sampel bakso dengan variasi cemaran daging babi dimaksudkan untuk mengetahui tingkat terendah cemaran

yang masih dapat dideteksi dengan analisis PCR, sedangkan uji lapangan dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya cemaran daging babi pada sampel bakso yang dijual di pasaran.

Sampel bakso dengan variasi tingkat cemaran dibuat dengan cemaran sebanyak 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, dan 20% (b/b). Bakso daging sapi dengan cemaran daging babi 0.1% (b/b) berarti dalam 99.9 g daging sapi ditambahkan 0.1 g daging babi. Bakso pasar yang diuji diambil dari pedagang bakso kaki lima di 3 pasar, yaitu Pasar Anyar (A), Pasar Bogor (B), dan dan Pasar Jambu Dua (J).

DNA Total

Isolasi DNA kedua jenis sampel dilakukan dengan menggunakan metode ekstraksi DNA Sambrook et al (1989). DNA hasil ekstraksi kemudian diuji kualitatif maupun kuantitatif untuk mengetahui mutunya. Pengujian kuantitatif dengan spektrofotometer UV dilakukan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm untuk mengetahui kemurnian dan konsentrasi DNA hasil isolasi (Muladno 2010). Kemurnian DNA yang optimum ditunjukkan oleh indeks kemurnian DNA antara 1.8 dan 2.0. Asam nukleat menyerap sinar UV 260 nm, sedangkan protein kontaminan menyerap sinar UV 280 nm. Oleh karena itu, nisbah absorbans pada kedua panjang gelombang ini akan menunjukkan kemurnian DNA (Sambrook & Russel 2001). Hasil pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel bakso diberikan pada Lampiran 4.

Gambar 2 V

Molekul akan berger kutub posit dalam gel molekul D konsentrasi digunakan, DNA dapa etidium bro (intercalated basa DNA dengan radi sehingga da Gambar 3 ( Amplifikas DNA ba kualitatif m dengan PCR dilakukan isolasi sebe (a) Visualisasi D macam varias

l DNA bers rak dari kutub tif (anode). P bergantung DNA, bentuk agarosa, teg dan kekuatan at divisualisa omida (EtBr)

d) di antara (Gambar 3) asi UV akan m apat terdeteksi

Interaksi anta (EtBr) dan DN

i DNA

akso hasil iso aupun kuantit R. Identifikas dengan kons sar 50 μg/μL

)

DNA hasil eks si cemaran (1–

sifat asam s b negatif (kat Pergerakan D

pada bobot konformasi gangan listri n bufer elektro

asi karena p dapat terper a pasangan-p ), yang jika

memendarkan .

ara etidium b NA (Reha et a

olasi yang tel tatif selanjutn si DNA denga

sentrasi DNA L yang akan b

traksi pada ge –7) (a); sampe

ehingga tode) ke DNA di t/ukuran DNA, k yang oforesis. pewarna rangkap asangan disinari n cahaya bromida

al. 2003)

ah diuji nya diuji an PCR A hasil bereaksi f

el agarosa 1% el bakso pasar

pada proses Sampel dir komponen P

forward, pri MgCl2, enzim Amplikasi di (annealing) 6 Primer ya fragmen DN mengikuti M primer forwa

CTC CCA G TCT TGA

reverse ditunj

Tabel 4 S fr Jenis ternak R Sapi Babi Sumber: Matsu Proses re utama: denat (pemanjangan tahapan terse telah diatur. P denaturasi p denaturasi y adalah 95 o denaturasi sel penempelan

(b)

%: sampel bak r (1–10) (b).

amplifikasi d reaksikan d PCR yang t

mer reverse, m tag polym

ijalankan pad 60 oC. ang digunakan

NA spesifik Matsunaga et a

rd keduanya s GCT CCA TC

TGA AA-3 jukan pada Ta

ekuens prime ragmen DNA

Reverse (5’-3

CTA GAA A TGT AAG A CGT AAT AT AG

GTC GAT AG AGA TTT GT ATG ACC G

unaga et al. (19

eaksi PCR te turasi, penemp

n rantai DNA ebut akan terja

Pada tahap pe potongan DN

ang digunaka o

C. Untai tu lanjutnya akan

oleh primer

kso dengan be

dengan mesin dengan cam terdiri atas p , campuran

merase, dan a suhu penem

n dalam ampl k sapi dan

al. (1999). Se sama, yaitu 5’ CA AAC ATC ’, sekuens p abel 4.

er reverse sp sapi dan babi ’) Targe hasil ampl AAG CC TA 274 b (base GT TG TA 398 b 99)

erdiri atas 3 pelan, dan el A) (Gambar 4)

adi pada suhu ertama, akan NA utama. an pada pen unggal DNA n mengalami r forward m

  erbagai n PCR. mpuran primer dNTP, bufer. mpelan lifikasi babi ekuens ’-GAC C TCA primer pesifik et ifikasi bp

e pair)

reverse pada adalah pema o

[image:16.595.106.514.146.776.2] [image:16.595.100.522.557.734.2]

C sesuai d telah ditentu pada ampl cetakan pad Hasil a variasi cem Terlihat bah cemaran m beragam. F pada 274 bp DNA hasil agarosa 2% DNA yang dengan 7 Tabel 5. H bahwa frag setiap ting persentase k Gambar 5 Ta No 1 2

3 S

4 Ba 5 Ba

6 B

7 B

8 B

9 B

10 B

11 Kontro

Keterangan: +

a suhu 60 oC. anjangan ranta dengan panjan ukan. Produk lifikasi perta da siklus selanj amplifikasi D aran ditunjuk hwa sampel b menghasilkan

Fragmen DNA p dan babi pad reaksi PCR . Tingkat keb

berasal dari p tingkat cema Hasil yang di

gmen DNA kat cemaran keberhasilan y

Visualisasi h cemaran pad

abel 5 Tingka

Sampel Sapi Babi Sapi+Babi akso 0.1% akso 0.5% Bakso 1% Bakso 5% Bakso 10% Bakso 15% Bakso 20%

ol negatif (Air

+ DNA terampl

Proses yang ai DNA pada ng basa targ DNA yang te ama akan m

jutnya. DNA bakso kkan pada Ga

bakso dengan fragmen DNA A sapi akan da 398 bp. Vis dilakukan p berhasilan amp produk olahan aran disajika iperoleh menu teramplifikas n walaupun yang beragam. hasil amplifik da gel agarosa

at keberhasilan PCR ke Sapi + - + + + + + + + + r) -

lifikasi; - DNA

terakhir suhu 72 et yang erbentuk menjadi dengan mbar 5. n variasi A yang muncul sualisasi pada gel plifikasi n bakso an pada unjukan si pada dengan .

kasi DNA sa a 2%. Keterang

n amplifikasi D

e-1 PC Babi Sapi - + + - + + - + + + + + + + + + + + + + - - tidak teramplif Gambar 4 ampel bakso gan Gambar 5

DNA bakso de

CR ke-2

Babi S - + + - + + + + + + - fikasi Proses reaks Stirling 2003 dengan berba 5 pada Tabel 5

engan 7 varia

PCR ke-3 Sapi Babi + - - + + + + - + + + + + + + + + + + + - -

si PCR (Bart 3).

[image:17.595.98.515.100.801.2]

Persentase keberhasilan amplifikasi pada Tabel 5 menunjukkan bahwa semua tingkat cemaran teramplifikasi dengan baik, namun pada cemaran 0.1% (b/b) hanya terdeteksi fragmen DNA sapi pada 274 bp, sedangkan fragmen DNA babi sudah tidak dapat terdeteksi pada 398 bp. Hasil ini mengindikasikan, tingkat cemaran terkecil yang masih dapat terdeteksi pada sampel bakso adalah 0.5% (b/b). Meskipun tipis, fragmen yang terbentuk masih dapat terdeteksi. Kontrol positif yang digunakan pada pengujian ialah DNA sapi, babi, dan campuran sapi dan babi yang diambil dari

DNA darah, sedangkan air digunakan sebagai kontrol negatif.

[image:17.595.113.509.271.442.2]

Pengujian sampel dari pasar dilakukan 2 kali ulangan (duplo). Sampel Pasar Anyar diambil ada 3 (A1, A2, dan A3), Pasar Bogor 1 sampel (B1), dan Pasar Warung Jambu 1 sampel (J1). Gambar 6 menunjukkan bahwa seluruh sampel teramplifikasi dengan baik, ditunjukkan dengan munculnya fragmen DNA sapi pada 274 bp. Fragmen DNA babi tidak muncul untuk semua sampel dan hanya muncul pada kontrol positif. Persentase keberhasilan amplifikasi sampel bakso di pasaran dapat dilihat pada Tabel 6.

Gambar 6 Visualisasi hasil amplifikasi DNA sampel bakso dari pasar pada gel agarosa 2%. Keterangan Gambar 6 pada Tabel 6.

Tabel 6 Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA bakso dari pasar

No Sampel PCR ke-1 PCR ke-2 PCR ke-3 Keberhasilan amplifikasi/sampel

(%) Sapi Babi Sapi Babi Sapi Babi Sapi Babi

1 Sapi + - + - + - 100 0

2 Babi - + - + - + 0 100

3 Sapi+Babi + + + + + + 100 100

4 A11 + - + - + - 100 0

5 A12 + - + - + - 100 0

6 A21 + - + - + - 100 0

7 A22 + - + - + - 100 0

8 A31 + - + - + - 100 0

9 A32 + - + - + - 100 0

10 B11 + - + - + - 100 0

11 B12 + - + - + - 100 0

12 J11 + - + - + - 100 0

13 J12 + - + - + - 100 0

14 Kontrol negatif (Air) - - - 0 0

Persentase keberhasilan mencapai 100% untuk setiap sampel yang diujikan dan hanya DNA sapi yang teramplifikasi pada setiap sampel uji. Hasil tersebut menunjukkan bahwa pada sampel bakso yang diambil dari 3 pasar di Kota Bogor tidak ditemukan adanya cemaran babi.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Validasi metode ekstraksi DNA menghasilkan limit deteksi kemurnian DNA sebesar 0.117, limit kuantitasi kemurnian DNA sebesar 0.389, persen SBR 2.31%, dan ketidakpastian kemurnian DNA sebesar 1.93 ± 0.04. Berdasarkan hasil tersebut, metode ekstraksi DNA telah memiliki kelayakan yang baik untuk analisis PCR.

Teknik PCR yang dilakukan mampu mengidentifikasi cemaran daging babi dalam sampel bakso hingga tingkat cemaran 0.5% (b/b). Pengujian terhadap sampel bakso dari 3 pasar berbeda di kota Bogor (Pasar Anyar, Pasar Bogor dan Pasar Jambu Dua) dengan teknik PCR tersebut tidak menunjukkan adanya cemaran daging babi.

Saran

Perlu dilakukan pengujian parameter validasi yang lain seperti ketertiruan (reproducibility) dan ketangguhan metode (ruggedness). Pengujian juga perlu dilakukan pada jenis sampel yang lain seperti dendeng dan abon.

DAFTAR PUSTAKA

 

Antonia et al. 2008. The validation of the DNA extraction method from Apis mallifera L. Animal Sci Biotech 65:387-390.

Bartlett JMS, Stirling D. 2003. A Short History of the Polymerase Chain Reaction. New Jersey: Humana Pr.

Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya. Maj Ilmu Kefarmasian 3:117-135.

Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill.

Hayyan et al. 2009. Identifying of fats of halal and non halal animals using a geometric method. Halal Sci 3:43-51.

[IUPAC] International Union of Pure and Applied Chemistry. 2002. Harmonized Guidelines for Single-Laboratory Validation of Method of Analysis (IUPAC Technical Report). London: IUPAC.

Margawati ET, Ridwan M. 2010. Analysis of porcine contamination by using PCR technology in several meat ball products: to find an effective assessment system.

Berita Biol 10:93-98.

Matsunaga T et al. 1999. A quick and simple method for the identifcation of meat species and meat products by PCR assay.

Meat Sci 51:143-148.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor: IPB Pr.

Nuraini H. 2004. Pengembangan sekuen

Porcine Repetitive Element (PRE-1) sebagai penanda molekuler untuk mendeteksi material babi pada produk daging olahan [disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Peraturan Pemerintah Republik Indonesia Nomor 28 Tahun 2004 tentang Keamanan, Mutu, dan Gizi Pangan. Jakarta.

Reha D et al. 2003. Nature of stacking interactions between intercalators (ethidium, daunomycin, ellipticine, and 4′,6-diaminide-2-phenylindole) and DNA base pairs. Chem Soc 124:3366-3376.

Saez R, Sanz Y, Toldra F. 2003. PCR-based fingerprinting technique for rapid detection of animal species in meat product. Meat Sci 66:659-665.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989.

Molecular Cloning. A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Lab.

Sambrook J, Russel. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed ke-3. New York: Cold Spring Harbour Lab.

   

 

Lampiran 1 Bagan tahapan penelitian

Sampel

Preparasi Sampel

Degradasi Protein

Degradasi Bahan Organik

Presipitasi DNA

Ekstraksi DNA

Penentuan Kemurnian DNA

Validasi Metode Ekstraksi

DNA

Visualisasi Fragmen DNA

Pengujian DNA dengan PCR

Visualisasi Fragmen DNA

Hasil PCR

Lampiran 2 Pengolahan data uji limit deteksi, limit kuantitasi, dan presisi

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi 7 ulangan sampel bakso dengan cemaran No Sampel A260 A280 A260/A280 μg/μL

1 1 0.059 0.031 1.903 590

2 2 0.035 0.019 1.842 350

3 3 0.039 0.021 1.857 390

4 4 0.031 0.016 1.938 310

5 5 0.027 0.014 1.923 310

6 6 0.074 0.040 1.850 740

7 7 0.044 0.023 1.913 440

Rerata 1.889

SB 0.039

• Limit deteksi LD = 3×SB

LD = 0.117% kemurnian DNA  

• Limit kuantitasi LQ = 10 x SB

LQ = 0.389% kemurnian DNA

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi 7 ulangan sampel bakso dengan cemaran No Sampel A260 A280 A260/A280 μg/μL

1 1 0.031 0.016 1.938 310

2 2 0.030 0.016 1.875 300

3 3 0.039 0.021 1.857 390

4 4 0.039 0.020 1.950 390

5 5 0.031 0.016 1.938 310

6 6 0.027 0.014 1.923 270

7 7 0.038 0.019 2.000 280

Rerata 1.925

SB 0.044

SBR(%) 2.31

 

• Persisi

SBR (%) = SB×100% x

SBR (%) = 2.31%  

Lampiran 3 Pengolahan data ketidakpastian kemurnian DNA

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi 7 ulangan sampel bakso dengan cemaran No Sampel A260 A280 A260/A280 μg/μL

1 1 0.029 0.016 1.812 290

2 2 0.035 0.019 1.842 350

3 3 0.031 0.015 2.067 390

4 4 0.242 0.131 1.847 2420

5 5 0.029 0.014 2.071 290

6 6 0.101 0.050 2.020 1010

7 7 0.039 0.021 1.857 390

 

Ulangan sampel

Indeks

Kemurnian DNA

x

i

-

x

( )

2

x

-x

i

1 1.812 -0.118 0.0139

2 1.842 -0.088 0.0077

3 2.067 0.137 0.0187

4 1.847 -0.083 0.0068

5 2.071 0.141 0.0198

6 2.020 0.090 0.0081

7 1.857 -0.073 0.0053

Rerata 1.930

Ketidak pastian presisi:

1 1

2

n-n

i (xi-xm) u (p)

∑ = =

11592 0. u (p) =

Ketidakpastian baku rata-rata:

n ) m u (x m u =

7 11592 0. m u =

04382 0, m u =

Ketidakpastian gabungan: 2

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

=

Xm m u c

u

2

930 1

04382 0

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

=

. . c

u

0227 0. c u =

Ketidakpastian diperluas:

c u k e u = ×

0227 0

2 .

e u = ×

045 0, e u =

Ketidakpastian pengukuran kemurnian DNA

[

]

±u_e

= PengukuranKemurnian DNA DNA

Kemurnian

[ ]

1.93 0,04 DNA

Kemurnian = ±

Lampiran 4 Data pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel bakso

dengan variasi cemaran dan bakso pasar

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel baksodengan variasi cemaran  No Sampel A260 A280 A260/A280 μg/μL

1 Bakso 0.1% 0.008 0.007 1.143 80

2 Bakso 0.5% 0.013 0.004 3.250 210

3 Bakso 1% 0.029 0.014 2.071 290

4 Bakso 5% 0.061 0.027 2.259 610

5 Bakso 10% 0.040 0.015 2.667 400

6 Bakso 15% 0.016 0.007 2.286 160

7 Bakso 20% 0.101 0.050 2.020 1010

 

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel bakso pasar

No Sampel A260 A280 A260/A280 μg/μL