Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa

SITOTOKSISITAS EKSTRAK KULIT KAYU Pinus merkusii

Jungh. et de Vriese TERHADAP SEL KANKER SERVIKS

HeLa

KHOEROTUN NISA’

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

ABSTRAK

KHOEROTUN NISA’. Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa. Dibimbing oleh ANNA PRIANGANI ROSWIEM dan SYAMSUL FALAH.

Kanker serviks merupakan kanker yang paling banyak menyebabkan kematian pada wanita di Indonesia. Salah satu upaya pengobatan kanker dapat dilakukan dengan memanfaatkan senyawa dari bahan alam. Beberapa tanaman mempunyai potensi sebagai antikanker, salah satunya adalah kulit kayu Pinus merkusii. Tujuan dari penelitian ini adalah menguji aktivitas sitotoksik ekstrak kulit kayu Pinus merkusii terhadap sel HeLa dengan uji microculture tetrazolium technique (MTT). Penelitian ini juga menguji kandungan fitokimia dan penapisan awal sitotoksisitas dengan Artemia salina. Rendemen tertinggi diperoleh dari ekstrak etanol 70% sebesar 6.30%. Pinus merkusii mengandung flavonoid, triterpenoid, saponin, dan tanin. Hasil uji sitotoksisitas menggunakan A. salina menunjukkan bahwa ekstrak kulit kayu P. merkusii memiliki aktivitas dan potensi antikanker karena nilai LC50 < 1000 μg/mL. Ekstrak etanol 70% kulit kayu P. merkusii memiliki aktivitas sitotoksik paling tinggi terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 sebesar 266.01 μg/mL daripada ekstrak metanol, air, dan aseton dengan IC50 berturut-turut sebesar 408.13 μg/mL, 433.51 μg/mL, dan 880.24 μg/mL. Kata kunci: kanker serviks, Pinus merkusii, sel HeLa, sitotoksisitas

ABSTRACT

KHOEROTUN NISA'. Cytotoxicity of Pinus merkusii Jungh. et de Vriese Bark Extract against HeLa Cervical Cancer Cells. Under the direction of ANNA PRIANGANI ROSWIEM and SYAMSUL FALAH.

Cervical cancer is the most common death cause of cancer in Indonesian women. One of the efforts of cancer treatment is the utilization of natural materials compounds. Some plants have potential as anticancer, one of them is bark of Pinus merkusii. The purpose of this study was to determine the cytotoxic activity of Pinus merkusii bark extract against HeLa cells by microculture tetrazolium technique (MTT) assay. The study also tested the phytochemical content and the initial screening of cytotoxicity with Artemia salina. The Highest yield of 70% ethanol P. merkusii bark extract was 6.30%. Pinus merkusii contains flavonoids, triterpenoids, saponins and tannins. The results of cytotoxicity assay using A. salina showed that the Pinus merkusii bark extract has activity and potential as anticancer indicated by its LC50 values < 1000 μg/mL. The 70% ethanol extract of P. merkusii bark has highest cytotoxic activity against HeLa cells with IC50 value of 266.01 μg/mL which was higher than methanol, water, and aceton extract with IC50 values for respectively 408.13 μg/mL, 433.51 μg/mL, dan 880.24 μg/mL.

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

pada

Departemen Biokimia

SITOTOKSISITAS EKSTRAK KULIT KAYU Pinus merkusii

Jungh. et de Vriese TERHADAP SEL KANKER SERVIKS

HeLa

KHOEROTUN NISA’

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul Skripsi : Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa

Nama : Khoerotun Nisa’

NIM : G84080027

Disetujui oleh

Dr Anna P. Roswiem, MS Pembimbing I

Dr Syamsul Falah, SHut, MSi Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc Ketua Departemen

PRAKATA

Alhamdulillahirobbil’alamin, puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat serta salam pun tercurah pada Nabi Muhammad SAW. Karya ilmiah dengan judul “Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa” disusun berdasarkan penelitian yang telah dilaksanakan di Laboratorium Biokimia, IPB dan di Laboratorium Mikrobiologi Pusat Studi Satwa Primata (PSSP), Bogor. Kegiatan penelitian dilakukan pada Februari sampai Oktober 2012 di bawah bimbingan Dr Anna P. Roswiem, MS dan Dr Syamsul Falah, SHut, MSi.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr Anna Priangani Roswiem, MS selaku pembimbing utama dan Bapak Dr Syamsul Falah, SHut, MSi selaku pembimbing kedua yang telah memberikan saran, kritik, dan motivasi serta atas kesabarannya dalam membimbing selama penulisan karya ilmiah ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Ibu Silmi Mariya, SSi, MSi yang telah membantu mengerjakan dan membimbing dalam pelaksanaan uji MTT di PSSP. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada drh Sulistiyani, MSc, PhD; Dr Ir I Made Artika, MAppSc; dan Prof Dr drh Maria Bintang, MS sebagai komisi kelayakan skripsi dan penguji. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ayah, Ibu, dan seluruh keluarga atas doa dan motivasi yang selalu diberikan pada penulis. Tidak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Annisa Utami, Rina Fazilaturrahmi, Didit Haryadi, Khairrunnisa, Annisa Rosiyana, dan Lusianawati atas bantuannya selama menjalankan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini serta Nia Nuzul Kurniasih, Eka Purwatresna, Aina Mardiyah, Nur Sofiana S, Rian Triana, Yuanita N, Dita M, dan Satriaji Hartamto yang senantiasa memberikan dukungan dan motivasinya.

Kekurangan dan kesalahan merupakan hal yang lazim ditemui dalam tiap laporan, tidak terkecuali laporan ini. Oleh karena itu, penulis memohon maaf dan menanti saran, koreksi, dan kritik yang membangun untuk penulisan berikutnya yang lebih baik. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan.

Bogor, Februari 2013

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

PENDAHULUAN 1  METODE 2 

Bahan dan Alat 2 

Metode Penelitian 2 

HASIL 5  Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese 5  Fitokimia Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese 5 Sitotoksisitas pada Artemia salina Leanch 6  Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap

sel HeLa 6 

PEMBAHASAN 8 

SIMPULAN 10 

DAFTAR PUSTAKA 10 

LAMPIRAN 12

DAFTAR TABEL

 

1 Rendemen ekstrak kulit kayu P. merkusii 5

2 Kandungan fitokimia ekstrak kulit kayu P. merkusii 6 3 Nilai LC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii 6 4 Inhibisi ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa 7

DAFTAR GAMBAR

1 Nilai IC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii 7

2 Sel HeLa: (a) tanpa perlakuan, (b) inhibisi < 50%, (c) inhibisi > 50% 8

DAFTAR LAMPIRAN

1 Inhibisi dan IC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa 12 2 Analisis statistik % inhibisi ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel

PENDAHULUAN

Kanker merupakan salah satu penyakit mematikan setelah penyakit kardiovaskuler dan penyakit menular. Tahun 2008 terdapat 24.6 juta penderita kanker (semua jenis), 12.7 juta kasus baru, dan 6.7 juta kematian akibat kanker. Angka kematian akibat kanker secara global diperkirakan akan meningkat sebesar 45% dari 11.3 juta kasus baru kanker pada tahun 2007 menjadi 15.5 juta kasus pada tahun 2030 (WHO 2010).

Kanker serviks (mulut atau leher rahim) merupakan salah satu kanker yang paling sering dijumpai pada wanita. Kanker serviks sering terjadi karena infeksi Human Papilloma Virus (HPV) (Melva 2008). Penelitian menunjukkan bahwa terdapat 12 170 kasus kanker serviks di Amerika pada tahun 2012 (Siegel et al. 2012). Sebanyak 80% dari sekitar 500 000 wanita yang menderita kanker serviks setiap tahun di seluruh dunia terjadi di negara-negara berkembang dan mengakibatkan kematian sebanyak 250 000 orang (Wilson et al. 2004). Kanker serviks merupakan kanker yang paling banyak menyebabkan kematian pada wanita di Indonesia. Catatan medis di RS Dr. Sardjito Yogyakarta dalam kurun waktu satu tahun, terdapat 235 kasus kanker serviks (Yuniarto & Warsito 2012).

Pengobatan kanker serviks dilakukan sesuai tingkatan stadium klinis dan secara umum dapat digolongkan menjadi tiga, yaitu operasi, radioterapi, dan kemoterapi (Hahn & Payne 2003). Operasi bertujuan untuk menghilangkan sel-sel kanker dengan menghilangkan bagian yang terkena kanker dan jaringan di sekitarnya. Operasi biasanya dilakukan pada kanker serviks stadium awal. Sisa-sisa sel kanker yang tidak bersih setelah operasi dapat muncul kembali. Selain itu, operasi juga dapat menyebabkan penderita kehilangan kemampuan untuk bereproduksi atau hamil. Pengobatan dengan radiasi menggunakan sinar berenergi tinggi untuk membunuh sel-sel kanker. Pengobatan dengan radiasi memiliki efek samping, seperti mual, muntah, diare, iritasi (NCI 2012) dan bahkan dapat meningkatkan risiko munculnya kanker lain, seperti kanker uterus, ginjal, dan kandung kemih (ACS 2012). Pengobatan dengan kemoterapi ditujukan untuk menghancurkan sel kanker sehingga ukuran kanker mengecil dan kemunculannya kembali setelah pengobatan dapat dicegah. Kemoterapi menggunakan obat-obatan untuk membunuh sel kanker, dan pada kanker serviks kemoterapi biasanya dikombinasikan dengan terapi radiasi. Kemoterapi mampu membunuh pertumbuhan sel-sel kanker, tetapi juga dapat membahayakan sel-sel normal di sekitarnya (NCI 2012). Kemoterapi juga dapat meningkatkan risiko timbulnya kanker lain, yaitu leukemia (ACS 2012).

2

Pinus merkusii Jungh. et de Vriese merupakan satu-satunya jenis tumbuhan pinus yang tumbuh di Indonesia (Dahlian & Hartoyo 1997). Kulit kayu pinus merupakan limbah industri pengolahan berbahan baku kayu pinus. Kayu pinus dimanfaatkan untuk triplek, venir, pulp, konstruksi ringan, mebel, batang korek api, dan sumpit. Getahnya dapat dijadikan sabun, gondorukem, perekat, cat dan kosmetik, sedangkan kulit kayunya sampai saat ini hanya digunakan sebagai kayu bakar (Khaerudin 1999).

Penelitian mengenai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker dari beberapa jenis pinus telah dilakukan. Kulit kayu Pinus koraiensis memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker serviks HeLa (Li et al. 2011). Selain itu, kulit kayu Pinus massoniana memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker hati BEL-7402 (Cui et al. 2005). Berdasarkan penelitian tersebut dapat diasumsikan bahwa Pinus merkusii Jungh. et de Vriese juga memiliki kemampuan sitotoksik terhadap sel kanker serviks HeLa.

Limbah kulit kayu P. merkusii belum banyak dimanfaatkan dan diteliti, sehingga perlu diteliti tentang aktivitas sitotoksik ekstrak kulit kayu pinus terhadap sel kanker serviks HeLa. Tujuan dari penelitian ini adalah menguji aktivitas sitotoksik ekstrak kulit kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap sel kanker serviks (HeLa) secara in vitro. Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah ekstrak kulit kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker serviks (HeLa). Penelitian ini diharapkan dapat menambah nilai guna dari tanaman Pinus merkusii Jungh. et de Vriese.

METODE

Bahan dan Alat

Bahan baku utama yang digunakan adalah kulit kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese yang diperoleh dari areal hutan pinus Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor, sel kanker serviks HeLa (American Type Culture Collection® Catalog No. CCL-2TM), Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, fetal bovine serum (FBS), Phosphate Buffered Saline (PBS), penisilin-steptomisin) yang diperoleh dari Invitrogen USA), dan garam tetrazolium 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida.

Alat-alat yang digunakan adalah OGAWA® vacuum pan evaporator, penggiling kayu Villey Mill® hammer mill dengan penyaring berukuran 20 mesh, sentrifus Beckman®, Germany (tipe GS-6R dengan GH-3.8 swinging bucket rotor), inkubator CO2 (BINDER® C 150 dengan konsentrasi CO2 5%, kelembaban 95%, suhu 37oC), dan Bio-Rad® microplate reader Model 680 dengan ketelitian 100% dan kisaran panjang gelombang 340-800 nm (kalibrasi dan servis alat berkala setiap 3 bulan).

Metode Penelitian

Ekstraksi Simplisia Kulit Kayu Pinus Merkusii Jungh. et de Vriese

3 bawah sinar matahari. Setelah kering, kulit kayu pinus dibuat serbuk dengan hammer mill. Serbuk kulit kayu pinus tersebut kemudian diekstraksi.

Ekstraksi Etanol 70% (BPOM 2005). Ekstraksi dilakukan dengan mencampurkan 40 gram simplisia dengan 400 mL etanol 70%. Kemudian simplisia direndam dalam pelarut selama 24 jam dan dipisahkan maseratnya. Maserat yang diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kertas saring Whatmann No.1 dan proses maserasi diulang sebanyak dua kali. Semua maserat yang diperoleh dikumpulkan dan diuapkan menggunakan vacuum pan evaporator.

Ekstraksi Air (Abbas & Mahmudatussaadah 2006). Ekstraksi ini dilakukan dengan mencampurkan akuades dan simplisia dengan perbandingan 1:10, kemudian dipanaskan dengan suhu 80oC selama 3 jam. Ekstrak yang diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kertas saring Whatmann No.1 dan proses tersebut diulang sebanyak dua kali dengan menggunakan simplisia dan pelarut yang sama. Semua filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan diuapkan menggunakan vacuum pan evaporator.

Ekstraksi Aseton dan Metanol (Falah et al. 2010). Ekstraksi ini dilakukan dengan mencampurkan simplisia dan aseton pada suhu ruangan selama 48 jam, kemudian ekstrak yang diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kertas saring Whatmann No.1 dan proses tersebut diulang sebanyak dua kali. Residu yang diperoleh dilarutkan kembali dalam metanol dan diulang sebanyak dua kali. Semua filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan diuapkan menggunakan vacuum pan evaporator.

Uji Fitokimia (Harbone 1987)

Uji Flavonoid. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah 2 mL metanol sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditambahkan H2SO4 sebanyak 3 tetes. Terbentuknya warna merah akibat penambahan H2SO4 pekat menunjukkan adanya flavonoid.

Uji Alkaloid. Sebanyak 10 mL kloroform ditambah dengan ekstrak sampel 0.1 g dan beberapa tetes ammonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam diambil dan dibagi menjadi 3 bagian ke dalam plat tetes, kemudian ke dalam tiap bagian ditambahkan dengan masing-masing pereaksi, yaitu pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan merah oleh pereaksi Dragendorf, endapan putih oleh pereaksi Meyer, dan endapan coklat oleh pereaksi Wagner.

Uji Tanin. Sebanyak 1 g ekstrak sampel ditambah 10 mL akuades kemudian dididihkan selama 30 menit. Setelah dingin, campuran disaring dan filtratnya ditambah FeCl3 1% sebanyak 5 mL (b/v). Warna biru tua atau hitam menunjukkan adanya tanin.

Uji Saponin. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah akuades 5 mL dan dipanaskan selama 5 menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok. Timbulnya busa selama ± 10 menit menunjukkan adanya saponin.

4

Uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (Meyer et al. 1982)

Telur udang Artemia salina L. sebanyak 1 sudip dilarutkan dalam 250 ml air laut, kemudian dimasukkan aerator ke dalamnya dan didiamkan selama 2x24 jam supaya menjadi larva udang. Selanjutnya disiapkan stok larutan sampel dengan konsentrasi 2 000 μg/mL. Ke dalam masing-masing sumur dimasukkan 10 larva udang yang telah didiamkan 2x24 jam dalam 200 µL air laut. Kemudian ditambahkan 800 µL air laut. Selanjutnya pada sumur secara berurutan dari baris pertama sampai baris keempat dimasukkan sampel sehingga konsentrasi akhir menjadi 1 000 ppm, 500 ppm, 100 ppm, dan 10 ppm. Perhitungan larva yang masih hidup dan yang mati dilakukan setelah 24 jam. Setelah itu, dilakukan perhitungan untuk menentukan nilai LC50 melalui program SPSS.

Pengujian Aktivitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese pada Sel HeLa secara in vitro

Pengujian ini dilakukan oleh Laboratorium Bagian Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa Primata, Bogor.

Media Sel Kanker (LCAG 2009). Media DMEM bubuk dimasukkan ke dalam botol steril dan ditambahkan 3.7 gram NaHCO3, antibiotik penisilin-streptomisin 1%, dan 10% FBS, kemudian dihomogenisasi dan ditambahkan akuabides sampai larutan media menjadi 1000 mL.

Kultur Sel HeLa (Li et al. 2011). Sel HeLa ditumbuhkan dalam flask yang berisi media DMEM. Setelah sel tumbuh (menempel pada dinding flask), medianya dibuang dan sel HeLa dalam flask dibilas dengan larutan PBS. Setelah itu, dimasukkan enzim tripsin sebanyak 5 mL, lalu dinkubasikan selama 5 menit, dan kemudian ditambahkan media DMEM. Campuran tersebut disentrifus pada kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan pelet (sel HeLa) yang diperoleh ditambah dengan 5 mL DMEM. Setelah itu, dilakukan perhitungan jumlah sel HeLa. Jumlah sel dihitung hingga masing-masing sumur akan terisi 5.000 unit sel dari 100 μL kultur sel HeLa, dan dimasukkan ke dalam tiap sumur sebanyak 96 sumur. Kultur sel tersebut diinkubasi selama 24 jam (over night) dalam inkubator CO2.

Perlakuan Ekstrak. Setelah kultur sel HeLa diinkubasi selama 24 jam medianya dibuang, kemudian dilanjutkan dengan perlakuan ekstrak. Ekstrak yang diuji meliputi ekstrak air, ekstrak etanol 70%, ekstrak aseton, dan ekstrak metanol. Masing-masing larutan ekstrak terdiri dari 5 konsentrasi akhir pada microplate. Tahap awal perlakuan ekstrak adalah dengan membuat stok larutan ekstrak dengan konsentrasi masing-masing 2 000 μg/mL, yang dibuat dengan cara melarutkan 5 mg ekstrak dengan 50 μL DMSO, kemudian ditambah dengan 950

5

Uji Sitotoksisitas dengan MTT (CCRC 2000). Setelah diinkubasi 48 jam, dimasukkan garam tetrazolium sebanyak 10 μL tiap sumur. Warna campuran menjadi kuning. Setelah itu, diinkubasi selama 4 jam pada inkubator CO2. Setelah diinkubasi dan telah terbentuk kristal formazan, larutan ekstrak dibuang. Kristal formazan yang terbentuk dilarutkan dengan 100 μL etanol 96% pada tiap sumur. Warna larutan menjadi ungu. Nilai absorban dari formazan yang terbentuk diukur dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Semua perlakuan dilakukan triplo.

Analisis Data

Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dengan MTT berupa nilai absorban tiap sumur, kemudian nilai absorban tersebut dikonversi menjadi %inhibisi dengan menggunakan rumus (Zhang et al. 2005):

% Inhibisi = A kontrol-A sampel

A kontrol

x100%

Nilai Inhibition concentration 50% (IC50) ditentukan melalui persamaan

regresi linear dari log konsentrasi yang digunakan dengan nilai %sel hidup (CCRC 2000). Analisis statistik untuk membandingkan inhibisi tiap ekstrak

dilakukan dengan menggunakan One-Way ANOVA dengan SPSS. Jika terdapat

perbedaan yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program SPSS.

HASIL

Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese

Kulit kayu Pinus merkusii yang diekstraksi adalah simplisia berupa serbuk yang berwarna coklat kemerahan. Ekstraksi serbuk kulit kayu pinus menghasilkan ekstrak yang berbentuk serbuk setelah diuapkan. Ekstrak air yang diperoleh berwarna jingga kemerahan, ekstrak metanol dan etanol 70% berwarna coklat kemerahan, dan ekstrak aseton berwarna coklat kehitaman. Nilai rendemen ekstrak kulit kayu Pinus merkusii yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 1. Berdasarkan hasil yang diperoleh, ekstraksi dengan etanol 70% pada kulit kayu Pinus merkusii menghasilkan rendemen terbesar yaitu sebesar 6.30%.

Fitokimia Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese

Hasil uji fitokimia pada ekstrak kulit kayu pinus dapat dilihat pada Tabel 2. Keempat ekstrak mengandung senyawa flavonoid, tanin, saponin, dan triterpenoid.

Tabel 1 Rendemen ekstrak kulit kayu P. merkusii

Ekstrak Rendemen (%)

Air 4.61

Etanol 70% 6.30

6

Berdasarkan hasil uji fitokimia, walaupun mengandung senyawa yang sama tetapi intensitas warna yang ditimbulkan berbeda.

Sitotoksisitas pada Artemia salina Leanch

Aktivitas suatu senyawa ditunjukkan sebagai nilai konsentrasi letal 50 (LC50). Nilai LC50 dihitung dengan menggunakan analisis probit dengan SPSS. Tabel 3 menunjukkan hasil uji BSLT pada ekstrak kulit kayu P. merkusii. Keempat ekstrak kulit kayu Pinus merkusii memiliki nilai LC50 lebih kecil dari 1000 μg/mL.

Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap sel HeLa

Hasil dari uji sitotoksisitas dengan metode MTT berupa nilai absorban dari masing-masing ekstrak dengan beberapa konsentrasi. Rerata nilai absorban dari triplo masing-masing ekstrak dengan beberapa konsentrasi yang diperoleh digunakan untuk menghitung nilai % inhibisi (Lampiran 1). Nilai % inhibisi ini diperoleh dari perhitungan (Zhang et al. 2005), dan untuk mendapatkan rerata % inhibisi serta beda nyata antar perlakuan menggunakan Oneway ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Duncan (Lampiran 2). Nilai % inhibisi masing-masing ekstrak kulit kayu pinus dengan beberapa konsentrasi dapat dilihat pada Tabel 4. Berdasarkan data hasil yang diperoleh, ekstrak etanol 70% dengan konsentrasi 200 μg/mL dan ekstrak air konsentrasi 500 μg/mL mampu menginhibisi sel HeLa lebih dari 50%. Ekstrak aseton dan metanol dengan konsentrasi yang digunakan belum mampu menghambat sel HeLa lebih dari 50%. Ekstrak air memiliki persen inhibisi terbesar terhadap sel HeLa dengan nilai % inhibisi sebesar 59.34% pada

Tabel 2 Kandungan fitokimia ekstrak kulit kayu P. merkusii

Uji fitokimia Ekstrak

Air Etanol 70% Aseton Metanol

Flavonoid +++ +++ ++ +++

Alkaloid - - - +

Tanin ++ ++ +++ ++

Saponin +++ +++ + ++

Steroid - - - -

Triterpenoid ++ + +++ +

Keterangan: tanda (+) menunjukkan tingkat intensitas warna dan (-) menunjukkan senyawa metabolit sekunder tidak terdapat pada ekstrak

Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii

Ekstrak LC50 (μg/mL)

Air 634.79

Etanol 70% 465.45

9 aseton kulit kayu P. merkusii menunjukkan hasil positif pada uji flavonoid. Berdasarkan hasil uji fitokimia tersebut, kulit kayu P. merkusii diduga mampu menghambat pertumbuhan sel kanker serviks HeLa.

Penapisan awal senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antikanker dapat dilakukan dengan metode BSLT (Anderson 1991). BSLT merupakan salah satu metode untuk menguji bahan-bahan yang bersifat sitotoksik. Metode ini menggunakan larva Artemia salina Leach sebagai hewan coba. Suatu ekstrak dikatakan aktif sebagai antikanker berdasarkan metode BSLT jika nilai LC50 < 1000 μg/mL (Meyer et al. 1982). Berdasarkan hasil uji BSLT, keempat ekstrak kulit kayu pinus, yaitu ekstrak air, etanol 70%, aseton, dan metanol menunjukkan nilai LC50 < 1000 μg/mL. Hal ini menandakan bahwa keempat ekstrak tersebut memiliki aktivitas sebagai antikanker. Setelah tahap praskrining atau penapisan awal terhadap senyawa antikanker dengan metode BSLT, maka perlu dilanjutkan dengan uji sitotoksisitas menggunakan sel kanker secara in vitro untuk melihat pengaruh ekstrak secara langsung terhadap sel kanker.

Uji sitotoksisitas menggunakan sel kanker serviks HeLa dilakukan untuk melihat ada tidaknya aktivitas sitotoksik ekstrak kulit kayu Pinus merkusii terhadap sel kanker serviks. Metode pengujian sitotoksisitas yang banyak digunakan adalah dengan penggunaan microculture tetrazolium technique (MTT) (Arung et al. 2009). Metode pengujian sitotoksisitas MTT didasarkan pada prinsip kolorimetri (Itharat & Ooraikul 2007). Prinsip dari uji MTT adalah terjadinya mekanisme perubahan warna kuning dari garam tetrazolium (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromida) yang tereduksi menjadi kristal formazan berwarna ungu dalam mitokondria sel hidup (Mosmann 1983).

Uji sitotoksisitas digunakan untuk menentukan parameter nilai IC50. Nilai IC50 menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel. Nilai LC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii dengan metode BSLT tidak menunjukkan adanya hubungan positif dengan nilai IC50 terhadap sel kanker serviks HeLa dengan metode MTT. Penelitian lain juga menunjukkan hal yang serupa. Senyawa isopropanol dari ekstrak spesies invertebrata dan makroalga laut menunjukkan korelasi yang rendah antara sitotoksisitas dengan BSLT dan sitotoksisitas terhadap sel kanker paru-paru (A-549) serta sel kanker usus (HT-29) (Carballo et al. 2002). Klasifikasi aktivitas sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker dapat digolongkan menjadi tiga, yaitu kategori sangat toksik jika nilai IC50 < 10

μg/mL, kategori toksik jika nilai IC50 10-100 μg/mL, dan kategori cukup toksik jika nilai IC50 100-500 μg/mL (Weerapreeyakul et al. 2012). Berdasarkan klasifikasi tersebut, ekstrak etanol 70%, air, dan metanol kulit kayu P. merkusii yang memiliki nilai IC50 antara 100-500 μg/mL, mempunyai aktivitas sitotoksik yang tergolong cukup sitotoksik terhadap sel kanker serviks HeLa.

10

terlihat seperti terdegradasi menjadi bagian-bagian kecil seperti badan-badan apoptotik pada sel yang mengalami proses apoptosis.

Mekanisme penghambatan pertumbuhan sel kanker HeLa sendiri tidak diteliti dalam penelitian ini, sehingga belum diketahui secara pasti mekanisme penghambatan ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa. Senyawa prosianidin ekstrak etanol 95% kulit kayu P. koraiensis mampu menghambat pertumbuhan sel kanker HeLa melalui induksi apoptosis (Li et al. 2011). P. merkusii merupakan keluarga Pinaceae dan satu keluarga dengan P. koraiensis. Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa mekanisme penghambatan terhadap sel HeLa dari ekstrak kulit kayu P. merkusii juga terjadi melalui induksi apoptosis.

SIMPULAN

Ekstrak etanol 70% kulit kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese memiliki aktivitas sitotoksik paling tinggi terhadap sel kanker serviks HeLa secara in vitro dengan nilai IC50 sebesar 266.01 μg/mL daripada ekstrak metanol, air, dan aseton (IC50 > 400 μg/mL).

DAFTAR PUSTAKA

Abbas A, Mahmudatussaadah A. 2006. Minuman Fungsional Berbahan Dasar Teh dan Kayu Manis untuk Penderita Diabetes. Prosiding Seminar Nasional Iptek Solusi Kemandirian Bangsa; 2006 Ags 2-3; Yogyakarta,Indonesia. Yogyakarta (ID): ISBN. hlm 105-110.

[ACS] American Cancer Society. 2012. Cancer Facts & Figures 2012. Atlanta (US): American Cancer Soc.

Anderson A. 1991. List of insect pest susceptible to neem products. The Neem Tree-Source of Unique Natural products for Integrated Pest Management, Medicine, Industry and Other Purposes. ipp. Weinheim: VCH. 9: 195-204. Arung et al. 2009. Anti-cancer properties of diethylether extract of wood from

sukun (Artocarpus altilis) in human breast cancer (T47D) cells. Trop J Pharm Res. 8:317-324.

[BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2005. Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia. Jakarta (ID): BPOM RI.

[CCRC] Cancer Chemoprevention Research Center. 2000. Prosedur Tetap Uji Sitotoksis Metode MTT. Yogyakarta (ID): Fakultas Farmasi, Universitas Gajah Mada.

Carballo JL, Inda ZLH, Pérez P, Grávalos MDG. 2002. A comparison between two brine shrimp assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural products. BMC Biotechnology. 2(17):1-5.

Cui Y, Xie H, Wang J. 2005. Potential biomedical properties of Pinus massoniana bark extract. Phytother. Res. 19:34-38.doi:10.1002/ptr.1619.

11 Falah S, Safithri M, Katayama T, Suzuki T. 2010. Hypoglycemic effect of

mahogany (Swietenia macrophylla King) bark extracts in alloxan-induced diabetic rats. Wood Research Journal. 1(2): 89-94.

Hahn DB, Payne WA. 2003. Focus on Health. New York (US): Mc-Graw Hill. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Bandung: ITB Pr.

Itharat A, Ooraikul B. 2007. Research on Thai medicinal plants for cancer treatment. Research Signpost. 37(2):287-314.

Khaerudin. 1999. Pembibitan Tanaman HTI. Jakarta (ID): Penebar Swadaya. Li K, Li Q, Zhang T, Han Z, Li J, Liu Z, Zheng F. 2011. Procyanidins from Pinus

koraiensis bark inhibits HeLa cell growth by inducing apoptosis and reducing survivin protein expression. Afr. J. Biotechnol. 10(40):7766-7771. [LCAG] Lonza Cologne AG. 2009. Amaxa® Cell Line Nucleofector® Kit R for

HeLa Cells [ATCC® CCL-2™]. Jerman (DE): Lonza Cologne AG.

Melva. 2008. Faktor-faktor yang mempengaruhi kejadian kanker leher rahim pada penderita yang datang berobat di RSUP H. Adam Malik Medan tahun 2008 [tesis]. Medan (ID): Sekolah Pasacasarjana Universitas Sumatera Utara. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, Mclaughlin JL.

1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plants constituent. J. Medical Plant Res. 45: 31-34.

Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cyotoxicity. J. Immuno. Method. 65: 55-63. [NCI] National Cancer Institute. 2012. Cancer Treatment. National Cancer

Institut [internet]. [diunduh 2012 Okt 3]. Tersedia pada: http://www.cancer.gov/cancertopics/wyntk/cervix/page8.

Oba K, Teramukai S, Kobayashi M, Matsui T, Kodera Y, Sakamoto J. 2007. Efficacy of adjuvant immunochemotherapy with polysaccharide K for patients with curative resections of gastric cancer. Cancer Immunol. Immunother. 56(6): 905–911.

Siegel R, Naishadham D, Jemal A. 2012. Cancer statistics, 2012. Cancer J. Clin. 62:10-29.doi:10.3322/caac.20138.

Weerapreeyakul N, Nonpunya A, Barusrux S, Thitimetharoch T, Sripanidkulchai B.2012. Evaluation of the anticancer potential of six herbs against a hepatoma cell line. Chinese Medicine. 7(15):1-7.

Wilson CM, Tobin S, Young RC. 2004. The exploding worldwide cancer burden: The impact of cancer on women. Int. J. Gynecol Cancer 14: 1–11.

[WHO] World Health Organization. Globocan Stats Section of Cancer Information. 2010. Cancer. WHO [internet]. [diunduh 2012 Sep 16]. Tersedia pada: http://www.who.int/about/copyright/en/

Yuniarto Mi, Warsito B. 2012. Hubungan antara umur perkawinan dengan kejadian karsinoma serviks di Rumah Sakit Dr. Sardjito periode 1 Januari - 31 Desember 2005. FKIK, siap terbit.

12

Lampiran 1 Inhibisi dan IC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa Contoh perhitungan % inhibisi:

Ekstrak etanol 70% 200 µg/ml

• % Inhibisi = R A R A

R A x %

= . .

. x %

= 51.94%

• Rerata % sel hidup = 100% - % inhibisi = 100% - 51.94% = 48.06%

Keterangan: Rerata % inhibisi diperoleh dari Oneway ANOVA program SPSS Contoh perhitungan nilai IC50:

Ekstrak etanol 70%

Grafik Log konsentrasi dengan % sel hidup Perhitungan nilai IC50 berdasarkan persamaan garis:

y = ax + b

Keterangan: y = % inhibisi x = log konsentrasi y = -24.306x + 108.942 50 = -24.306x + 108.942 x = 2.425

IC50 = antilog 2.425 = 266.01 μg/mL

y = -24.306x + 108.942 R² = 0.934

0 20 40 60 80 100 120

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Sel hidup (%)

13 Lampiran 2 Analisis statistik % inhibisi ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap

14

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada tanggal 16 Mei 1990 di Pemalang, Jawa Tengah dari pasangan Amsori dan Mutmainah. Penulis merupakan anak terakhir dari tujuh bersaudara. Penulis lulus pada tahun 2002 dari SD Negeri 1 Wiyorowetan, kemudian melanjutkan pedidikan di SMP Negeri 1 Ulujami. Penulis lulus dari SMA Negeri 1 Comal pada tahun 2008 dan diterima di Departemen Biokimia, IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun yang sama.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam beberapa organisasi, antara lain sebagai anggota Badan Eksekutif Mahasiswa Tingkat Persiapan Bersama pada tahun 2008-2009 dan anggota himpunan profesi Biokimia IPB (CREBs) pada tahun 2009-2010 dan 2010-2011. Penulis juga mengikuti kepanitiaan beberapa acara di IPB. Selain itu, penulis juga aktif mengikuti beberapa kompetisi menulis baik tingkat nasional maupun internasional. Penulis mendapatkan hibah dana bersaing dari Dikti melalui Program Kreativitas Mahasiswa bidang Pengabdian Masyarakat pada tahun 2011 dan bidang Penelitian pada tahun 2012.