LAMPIRAN
Lampiran 1. Data Mentah Scoring Pita Polimorfik Padi Lokal Sumatera Utara
Nama Sampel IR64 Sigudang Sigambi Siasahan Siorsik Ramos KKB Talipuyu S_Putih S_Merah Martabe Mandailing
RM_580_1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
RM_580_2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
RM_580_3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
RM_131_1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
RM_131_2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
RM_413_1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
RM_413_2 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1
RM_413_3 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0
RM_413_4 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
RM_20_1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
RM_20_2 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1
RM_20_3 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
RM_20_4 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1
RM_20_5 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0
RM_20_6 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0
Lampiran 2. Matriks Kemiripan Genetik Berdasarkan Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan 4 Penanda SSR
IR64 Sigudang Sigambi Siasahan Siorsik Ramos KKB Talipuyu S_Putih S_Merah Martabe Mandailing IR64 1,000
Sigudang 0,7692 1,000
Sigambi 0,7692 0,6777 1,000
Siasahan 0,6154 0,8333 0,8333 1,000
Siorsik 0,6250 0,6777 0,6777 0,8000 1,000
Ramos 0,7692 0,6777 0,8333 0,6777 0,5333 1,000
KKB 0,7692 0,6667 0,8333 0,6667 0,5333 1,000 1,000
Talipuyu 0,6154 0,8333 0,6667 0,8333 0,6667 0,8333 0,8333 1,000
S_Putih 0,5333 0,7143 0,5714 0,7143 0,5882 0,7143 0,7143 0,5871 1,000
S_Merah 0,6250 0,6667 0,5333 0,6667 0,6667 0,6667 0,6667 0,8000 0,9412 1,000
Martabe 0,6667 0,5714 0,5714 0,5714 0,7059 0,5714 0,5714 0,5714 0,6250 0,7059 1,000
30
Lampiran 3. Gambar Benih Padi Lokal Sumatera Utara
a. IR64 b. Sigudang
c. Sigambi d. Siasahan
g. Kukubalam h. Talipuyu
i. Sigambiri Putih j. Sigambiri Merah
k. Martabe l. Mandailing
32
Lampiran 4. Deskripsi Koleksi Padi a. Sigambiri Putih
Tanaman golongan indica (cere)
Umur dataran rendah 110-114 hari, dataran tinggi 159- 163 hari, bentuk tegak, tinggi ±140 cm, anakan produktif 11-13 batang, Batang warna hijau, ketebalan : ±0.8 cm, warna batang tanpa malai
±124 cm
Daun warna hijau, warna tepi daun hijau tua, permukaan kasar, panjang ±68 cm, lebar ±1.8 cm, warna lidah coklat susu, bentuk lidah tumpul, warna telinga hijau kekuningan, posisi daun bendera agak tegak, leher malai pendek, tipe malai terbuka dan merunduk, panjang malai 25-26 cm
Bunga umur 50% berbunga: dataran rendah ±90 hari, dataran tinggi ±124 hari
Gabah bentuk medium, panjang ±0.76 cm, lebar ±0.32 cm, warna kuning jerami, kerontokan sedang, bobot 1000 butir gabah ±27 gr
Beras bentuk medium, panjang beras pecah kulit ±0.7 cm, lebar beras pecah kulit ±0.3 cm, warna beras pecah kulit kotor/kecoklatan, panjang beras sosohan ±0.62 cm, lebar beras sosohan ±0.27, warna beras sosohan putih
Sifat-Sifat Khusus Lainnya
Yusuf (2014)
b. Sigambiri Merah
Tanaman golongan indica (cere)
Umur umur dataran rendah 114-118 hari, dataran tinggi 161- 163 hari, bentuk tegak, tinggi ±140 cm, anakan produktif 11-13 batang, warna kaki hijau
Batang warna hijau tua, ketebalan ±0.7 cm, warna batang tanpa malai ±124 cm
Daun warna hijau, warna tepi daun hijau tua, permukaan kasar, panjang ±70 cm, lebar ±1.8 cm, warna lidah coklat susu, bentuk lidah tumpul, warna telinga hijau kekuningan, posisi daun bendera agak tegak, leher malai pendek, tipe malai terbuka dan merunduk, panjang malai 25-27 cm Bunga umur 50% berbunga: dataran rendah ±90 hari, dataran
tinggi ±123 hari
Gabah bentuk medium, panjang ±0.77 cm, lebar ±0.34 cm, warna kuning jerami, kerontokan sedang, bobot 1000 butir gabah ±27 gr
34
tua, panjang beras sosohan ±0.56 cm, lebar beras sosohan ±0.29, warna beras sosohan merah muda
Sifat-Sifat Khusus Lainnya
potensi hasil 4.84 t/ha, rata-rata hasil 4.10 t/ha, kadar amilosa 26.74%, ketahanan terhadap penyakit blas: ras 033 tahan (T), ras 073 dan ras 173 agak tahan (AT), ketinggian tempat: adaptif sampai 1300 m d.p.l, toleran suhu rendah, keracunan alumunium: toleran, tekstur nasi pera, ekspresi atau kombinasi: genotif, rumpun tanaman termasuk tinggi ±140 cm, berumur panjang ±5.5 bulan di dataran tinggi, berumur sedang ±116 hari di dataran rendah
DAFTAR PUSTAKA
Abdullah, B. 2006. Potensi Padi Liar sebagai Sumber Genetik dalam Pemuliaan Padi. Pemulia Tanaman pada Balai Besar Penelitian Tanaman Padi. Sukamandi. Jawa Barat
Afifah, E. N. 2012. Penggunaan Penanda Molekuler untuk Mempercepat dan Mempermudah Perbaikan Kualitas Tanaman Teh (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze). Makalah Seminar. Yogyakarta. Universitas Gadjah Mada.
Azizah, A. 2009. Perbandingan Pola Pita Amplifikasi DNA Daun, Bunga dan Buah Kelapa Sawit Normal dan Abnormal. [SKRIPSI]. Program Studi Biokimia. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Isntitut Pertanian Bogor.
Bahagiawati., Septiningsih, E. M., Yunus, M., Prasetiyono, J., Dadang, A dan Sutrisno. 2005. Aplikasi Teknologi Molekuler untuk Verifikasi Indentitas Genetik Varietas Sayuran Komersil. J. Hort. 15(3): 153-159.
Bansal, H., Kumar, R., Vivex & Sanjay. 2013. Analysis of in Rice (Oryza sativa L.) using Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and Simple Sequence Repeats (SSR) Markers. Acedemic Journal. 12(35): 5404-5412.
Borges, A., Rossa, M. S., Recchia, G., Queiroz-Silva, J. R. D., Bressan, E. D. A. B & Veasey, E. A. 2009. CTAB Methods for DNA Extraction of Sweetpotato for Microsatellite Analysis. Sci. Agric. (Piracicaba, Braz.). 66(4): 529-534.
Chakravarthi, B. K & Naravaveni, R. 2006. SSR Marker Based DNA Fingerprinting and Diversity Study in Rice (Oryza satiiiva. L.). African Journal of Biotechnology. 5(9): 684-688.
Daradjat, A. A., Silitonga, S dan Nafisah. 2015. Ketersediaan Plasma Nutfah untuk Perbaikan Varietas Padi. Balai Besar Penelitian Tanaman Padi. 1-10.
Fatchiyah, Estri, L.A., Sri, W., Sri R. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Penerbit Erlangga. Jakarta.
29
Handayani, T., Sastrosumarjo, S., Sopandie, D., Suharsono dan Setiawan, A. 2012. Analisis Marka Morfologi dan Molekuler Sifat Ketahanan Kedelai Terhadap Intensitas Cahaya Rendah. Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi Bogor.
Haris, T. N. 1994. Development and Germanation Studies of The Sugar Palm (Arenga pinata Merr) Seed. [DISERTASI]. Malaysia: Universitas Putra Malaysia.
Indhirawati, R., Purwantoro, A & Basunanda, P. 2015. Karakterisasi Morfologi dan Molekuler Jagung Berondong Stroberi dan Kuning (Zea mays L. Everta Group). Vegetalika. 4(1): 102-114.
Irwanto. 2007. Analisis Vegetasi untuk Pengelolaan Kawasan Hutan Lindung Pualu Marsegu, Kabuoaten Seram Bagian Barat, Provinsi Maluku . [TESIS]. Program Studi Ilmu Kehutanan. Jurusan Ilmu-Ilmu Pertanian Seolah Pasca Sarjana. UGM. Yogyakarta.
Julisaniah, N. I., Sulistyowati, L & Sugiharto, A. N. 2008. Analisis kekerabatan Mentimun (Cucumus sativa L.) Menggunakan Metode RAPD-PCR dan Isozim. Jurnal Biodiversitas. 9(2): 99-102.
Kanawapee, N. Sanitchon, J., Srihaban, P & Theerakulpisut, P. 2011. Genetic Diversity Analysis of Rice Cultivar (Oryza sativa L.) Differing in Salinity Tolerance Based on RAP and SSR Markers. Electronic Journal of Biotechnology. 14: 6-4.
Khush, G. S. 1997. Origin, Dispersal, cultivation and Variation of Rice. Plant Molecular Biology. 35: 25-34.
Kristamtini., Taryono., Basunanda, P dan Murti, R. H. 2014. Keragaman Genetik Kultivar Padi beras Hitam Lokal Berdasarkan Penanda Mikrosatelit. Jurnal AgroBiogen. 10(2): 69-76.
Langga, I. F., Restu, M & Kusv.rinanti, T. 2012. Optimalisasi Suhu dan Lama Inkubasi dalam ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reines) serta Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. J. Sains & Teknologi. 12(3): 265-276.
Litt, M and Lutty, J. A. 1989. A Hypervariable Microsatellite Revealed by in vitro Amplication of a Dinucleotide Repeat within the Cardiac Muscle Actin Gene. Am. J. Hum. Genet. 44: 397-401.
Ricer Germplasms of Bangladesh. International Journal of Biosciences. 2(10): 64-72.
McCouch, SR., Teytelman, L., Xu, Y., Lobos, KB., Clare, K., Walton, M., Fu, B., Maghirang, R., Li, Z., Xing, Y., Zhang, Q., Kono, I., Yano, M., Fjellstrom, R., DeClerck, G., Schneider, D., Cartinhour, S., Ware, D and Stein, L. 2002. Development and Mapping of 2240 New SSR Markers for Rice (Oryza sativa L.). DNA Research. 9(6): 199-207.
Meti, N., Smala K. C., Bastia, D. N & Rout G. R. 2013. Genetic Diversity Analysis in Aromatic Rice Genotypes Using Microsatellite Based Simple Sequence Repeat (SSR) Marker. Academic Journal. 12(27): 4238-4250.
Miah, G., Rafii, M. Y., Ismail, M. R., Puteh, A. B., Rahim, H. A., Islam Kh. N and Latif, M. A. 2013. A Review of Microsatelite Markers and Their Application in Rice Breeding Programs to Improve Blast Disease Resistance. International Journal of Molecular Science. 14:22499- 22528.
Moeijopawiro, S. 2010. Marka Mikrosatelit sebagai Alternatif Uji BUSS dalam Perlindungan Varietas Tanaman Padi. Buletin Plasma Nutfah. 16(1).
Morgante, M., Hanafey, H. and Powell, W. 2002. Microsatellites are Preferentially Associated with Non Repetitive DNA in Plant Genome. Nat. Genet. 30: 194–200.
Mulyani, Y., Purwanto, A & Nurruhwati, I. 2013. Perbandingan beberapa Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Dini Koi Herpes Virus (KHV) pada Ikan Mas (Cyprinus caprio L.). Fakults Perikanan dan Ilmu Universitas Padjadjaran Jatinangor.
Norsalis, E. 2011. Padi Gogo dan Sawah. Publish : 29-10-2011 03:33:43.
Nurmiyati., Sigiyarto & Sajida. 2009. Kimpul (Xanthosoma spp.) Characterization Based on Morphological Characteristic and Isozymic Analysis. BioScience. 1(3): 138-145
Padmadi, B. 2009. Identifikasi Sifat Aroma Tanaman Padi Menggunakan Marka Berbasis Gen Aromati. [SKRIPSI]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
31
Purwono dan Purnamawati, H. 2007. Budidaya Tanaman Pangan Unggul. Swadaya. Bogor.
Putri, L. A. P., Mahyuni, K. H., Basyuni, M dan Setyo, I. E. 2013. Analisis Awal: Pemakaian Marka Molekuler RAPD untuk Pendugaan Keragaman Genetik Plasma Nutfah Aren Sumatera Utara. Prosiding Seminar Nasional Agroforestri. Hl, 705-781.
Shakil. S. K., Sultana, S., Hasan, Md. M., Hossain Md. M, Ali, Md. S & Prodhan, S. H. 2015. SSr Marker Based Genetic Diversity of Modern Rice Varieties and Coastal Landraces in Bangladesh. Indian Journal of Biotechnology. 14 : 33-41.
Simatupang, Y. R. 2015. Analisis Keanekaragaman Genetik Markisa (Passiflora spp. ) di Sumatera Utara Berdasarkan Penanda RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). [SKRIPSI]. Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sumatera Utara. Medan.
Singh, A., Saini, R., Singh, J., Arya, M., Ram, M., Pallavi., Mukul & Singh, P. K. 2015. Genetic Diversity Studies in Rice (Oryza sativa L.) using Microsatellite Markers. International journal of Agriculture, Enviroment and Biotechnoloy. 8(1): 143-152.
Siregar, H. 1981. Budidaya Tanaman Padi di Indonesia. PT. Sastra Hudaya. Jakarta.
Sitaresmi, T., Wening, R. H., Rakhmi, A. T., Yunani, N dan Susanto, U. 2013. Pemanfaatan Plasma Nutfah Padi Varietas Lokal dalam Perakitan Varietas Unggul.
Suryanto, D. 2003. Melihat Kenakekaragaman Organisme Melalui Beberapa Teknik Genetika Molekular. Universitas Sumatera Utara.
Suryatini, K. Y. 2011. Analisis Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropa curcas L.) dengan Metode Inter Simple Sequence Repeats (SSR). [TESIS]. Program Studi Bioteknologi Pertanian Universitas Udayanaa.
Syafrudin and Santoso, T. J. 2011. Optimasi Teknik Isolasi dan Purifikasi DNA yang Efisien dan Efektif pada Kemiri Sunan (Reutalis trisperma (Blanco) airy Shaw). Jurnal Litri. 17 (1): 11-17.
Tasliah., Mahrup & Prasetiyono, J. 2013. Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri (Xanthomonas Oryzae pv. oryzae) dan Uji Patogenisitasnya pada Galur-Galur Padi Isogenik. Jurnal AgroBiogen. 9 (2): 49-57.
Utama, M. Z. H. 2015. Budidaya Padi pada Lahan Marjinal. Andi Offset. Yogyakarta.
Utami, R. G., Carsono, N dan Wicaksana. N. 2015. Evaluasi Karakter Tahan Wereng Cokelat, Aromatik dan Kegenjahan pada Genotip Padi Hasil Piramidisasi Menggunakan Marka Molekuler dan Marka Fenotipik, Agric. Sci. J. 2(1): 1-12.
Wijayanto, T. 2013. Prospek Penerapan Bioteknologi dalam Pemanfaatan dan Pengembangan Biodeversitas Padi Lokal Sulawesi Tenggara. Jurnal Agroteknos. 3(1): 41-47.
Wright, J.M dan Bentzen, P. 1994. Microsatellites: Genetic Markers for the Future. Rev. Fish Biol. Fish. 4: 384–388.
BAB 3
BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei s/d Oktober 2016 di Laboratorium Genetika dan Molekuler, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikropipet, autoclave, mesin PCR, nanofotometer, hot plate, thermo mixer, cooling dry, magnetik bar, beaker glass, tabung erlenmeyer, mesin sentrifugasi, perangkat elektroforesis, waterbath, dan freezer.
Bahan yang digunakan adalah 11 koleksi padi lokal Sumatera Utara dan 1 koleksi padi Hibrida.
3.3 Prosedur
3.1 Persiapan Bahan Tanaman
Tabel 3.1 Daftar Sampel Padi yang digunakan dalam analisis keanekaragaman genetik
No Sampel Padi Jenis Daerah Asal
1. IR64 Hibrida -
2. Sigudang Gogo Kab. Tapanuli Selatan
3. Sitolas/Sigambi Gogo Kab. Labuhan Batu Utara
4. Siasahan Gogo Kab. Tapanuli Selatan
5. Siorsik Sawah Kab. Tapanuli Selatan
6. Ramos Gogo Kab. Labuhan Batu Utara
7. Kukubalam Gogo Kab. Labuhan Batu Utara
8. Talipuyu Gogo Kab. Tapanuli Selatan
9. Sigambir Merah Gogo dan sawah Kab. Karo dan Simalungun 10. Sigambir Putih Gogo dan sawah Kab. Karo dan Simalungun
11. Martabe Sawah Kab. Tapanuli Selatan
12. Mandailing Gogo Kab. Mandailing Natal
3.2 Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode CTAB (Cetyl Methyl Ammonium Bromide) sesuai protokol yang direkomendasikan Doyle & Doyle
(1987) yang telah dimodifikasi.
Daun padi sebanyak 0,1 g digunting kecil-kecil dan dimasukkan kedalam mortar yang telah berisi 700 µL 2 % CTAB buffer ekstraksi (20 mM EDTA, 0,1 M
Tris-HCL pH 8,0, 1,4 M NaCl, 2 % CTAB, dan 0,4 % β-mercaptolethanol ) yang telah di pre-heating pada suhu 65°C, kemudian digerus dengan menggunakan pestle. Sampel yang telah halus dimasukkan ke dalam 1,5 mL mikrotube.
11
dengan menggunakan alkohol 70 % dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 °C. Pelet dikeringkan (sampai alkohol tidak berbau. Pelet di larutkan dengan 100 µ L akuabides dan diinkubasi selama 1 jam dengan suhu 37°C dan disimpan pada suhu -20°C sebagai stok.
3.3Uji Kualitatif dan Kuantitaif DNA Total
Pengujian kualitatif dan kuantitatif DNA total dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarose dengan kosentrasi 1 % dan nanofotometer (IMPLEN P-360 Nano Photometer P-Class) dengan panjang gelombang 260 nm. Kemudian DNA dihitung kemurniaanya dengan perbandingan absorbansi 260/280.
3.3.1 Elektroforesis
Agarose sebanyak 1 g didihkan dalam 100 mL TAE 1X untuk membuat gel agarose 1 %. Setelah panasnya turun (±37 °C) larutan dicetak ke dalam cetakan elektroforesis. Larutan TAE 1X dituang ke dalam baki elektroforesis sampai terendam atau sampai pada garis hitam. Marker 1 kb diamsukkan ke dalam sumur yang pertama sebagai penanda. Loading dye sebanyak 2 µ L dipipet dan diletakkan di atas kertas parafilm. Sampel DNA dipipet sebanyak 10 µ L, di mix dengan loading dye (pada kertas parafilm) dan dimasukkan ke dalam sumur gel agarose.
Elektroforesis dirunning pada 100 V selama 45 menit. Gel agarose yang telah dirunning direndam dengan larutan EtBr (Ethidium Bromide) sebanyak 10 µ L dalam 1 L aquades suling selama 10 menit. Gel divisualisasikan di bawah transiluminator UV dan didokumentasi.
3.3.2 Nanofotometer
sampel diukur dengan membagi nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dengan 280 nm, nilai kisaran kemurnian DNA adalah 1.8 – 2.0. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau fenol akan menyerap cahaya pada 280 nm (Fatchiyah et al., 2011).
3. 3 Amplifikasi DNA
Amplikasi PCR dilakukan dengan volume 25 µ L dengan campuran reaksi yang dapat dilihat pada tabel 3.2. Program PCR yang digunakan sebagai berikut: amplifikasi yang dilakukan sebanyak 35 siklus dengan denaturasi awal pada suhu 94°C selama 1 menit, anneling 51,3-55,5°C selama 45 detik dan pemanjangan 72°C selama 1 menit dan pemanjangan akhir 72°C selama 5 menit. Adapun primer yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 4 primer yaitu RM 20, RM 580, RM 413 dan RM 131 (Tabel 3.3)
Tabel 3.2 Reaksi Amplifikasi DNA Total Padi
No Bahan Reaksi Kosentrasi Volume
1. PCR mix Go Taq Green - 12,5 µL
2. RNAse Free water - 8,5 µL
3. Primer (macrogen) Foward 10 mM 1 µL
4. Primer (macrogen) Reverse 10 mM 1 µL
5. DNA template - 2 µL
Total Volume 25 µL
Tabel 3.3 Sekuens primer mikrosatelit dan hasil optimasi suhu penempelan
No Nama Primer
Sekuen Primer (Forward/ Reverse) TA (Temperature
Anneling) 1. RM 580 F: GATGAACTCGAATTTGCATCC
R: CACTCCCATGTTTGGCTCC
54,7°C
2. RM 131 F: TCCTCCCTCCCTTCGCCCACTG R: CGATGTTCGCCATGGCTGCTCC
54,7°C
3. RM 413 F: GGCGATTCTTGGATGAAGAG R: TCCCCACCAATCTTGTCTTC
55,5°C
4. RM 20 F: ATCTTGTCCCTGCAGGTCAT R: GAAACAGAGGCACATTTCATTG
13
3. 4 Elektroforesis Hasil Amplifikasi DNA
Hasil amplifikasi PCR dipisahkan pada gel agarose 1,5% dalam bufer TAE (Tris Acetate EDTA) 1x dengan tegangan 70 V selama 60 menit. Gel direndam dalam EtBr selama 10 menit. Gel direndam kembali dengan akuabides selama 5 menit dengan tujuan memperjelas warna DNA. Gel divisualisasikan di bawah transiluminator UV dan didokumentasi.
3.5 Analisis Data
3.5.1 Scoring Pita Polimorfik
Profil DNA yang dihasilkan diterjemahkan menjadi data biner, 1 (satu) menunjukkan ada pita dan 0 (nol) menunjukkan tidak ada pita DNA. Data yang telah didapatkan diolah dengan menggunakan aplikasi microsoft excel 2013 dan disimpan dalam bentuk format excel 97-2003 workbook. Data pada microsoft excel kemudian diimport ke NTEDIT.
3.5.2 Analisis Keragaman Genetik
Estimasi kekerabatan didasarkan atas jumlah kesamaan pita yang teramplifikasi akan dianalisis dengan perangkat lunak NTSys (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) Version 2.02. Scoring pita polimorfik
yang telah didapat pada microsoft excel diubah menjadi format NTSys pada NTEDIT dikarenakan program NTSys hanya bisa membaca data dalam bentuk format NTSys. Data dikelompokkan (Clustering) dengan menggunakan metode UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithme Average) berdasarkan Coeficient Dice untuk menyajikan data dalam bentuk pohon dendogram, dalam
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil analisis keanekaragaman genetik dengan menggunakan 4 penanda SSR yaitu RM 20, RM 580, RM 131 dan RM 413 menujukkan hasil sebagai berikut. 4.1 Hasil Isolasi DNA Total Padi Lokal Sumatera Utara
Hasil isolasi DNA total 12 koleksi padi dielektroforesis pada gel agarose 1 % (Gambar 4.1). Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui kualitas DNA yang diperoleh sehingga dapat digunakan dalam analisis selanjutnya yaitu amplifikasi DNA total dengan PCR.
Gambar 4.1 Elektroferogram DNA total Padi Lokal Sumatera Utara. M (marker 1 kb) 1. IR64 2. Sigudang 3. Sigambi 4. Siasahan 5. Siorsik 6. Ramos 7. Kukubalam 8. Talipuyu 9. Sigambiri Putih 10. Sigambiri Merah 11. Martabe 12. Mandailing
Pada Gambar 4.1. menunjukkan hasil pita DNA dengan menggunakan metode CTAB 2%-4%. Seluruh pita DNA total memperlihatkan pita yang utuh dan memiliki ukuran diatas 1000 bp. Menurut Syafruddin & Santoso (2011), keutuhan pita yang ditandai dengan tidak adanya smear pada pita DNA yang diperoleh menjadi penting karena pada proses PCR, DNA yang masih utuh akan memberikan hasil yang relatif lebih akurat.
15
12 yaitu pada koleksi padi Ramos, Kukubalam, Sigambiri Merah, Martabe dan Mandailing sedangkan pita yang paling tipis diperoleh pada sumur gel 2 yaitu padi Sigudang. Pita tipis pada DNA total yang diperoleh pada isolasi DNA dengan menggunakan metode CTAB, kemungkinan disebabkan karena teknis kerja yang dilakukan saat isolasi, yaitu saat proses pemipetan. Diduga pada saat pemipetan pada proses purifikasi, lapisan atas tidak keseluruhan diambil melainkan hanya 600 µL, sedangkan masih terdapat sisa dari lapisan atas yang kemungkinan larutan yang
tidak terambil, mengandung banyak DNA total. Menurut Mulyani et al., (2013) pengambilan lapisan air yang menagdung Clorofoam:Isoamylalcohol yang telah disentrifugasi ikut menetukan jumlah DNA total yang diambil. Disamping itu proses pengambilan DNA tersebut ikut menentukan kualitas DNA hasil isolasi yang ditunjukkan pada proses elektroforesis.
Isolasi DNA yang dilakukan telah mengalami modifikasi pada beberapa tahapan yaitu saat inkubasi pada sampel yang telah digerus dengan suhu 65 °C selama 45 menit kemudian divortex setiap 15 menit sekali yang jika mengacu pada protokol yang telah dilakukan oleh Borge et al., (2009) hanya dibolak-balik saja. Hal ini sesuai dengan yang telah dilaporkan oleh Mulyani et al., (2013) proses penghomogenan dengan vortex mixer membantu dalam proses lisis sel.
4.2 Uji Kualitas dan Kuantitas DNA Total Padi Lokal Sumatera Utara
Tabel 4.2 Pengukuran Kosentrasi dan Kemurnia DNA daun Padi
No Nama Sampel Kemurniaan Kosentrasi
1. IR64 1,867 350 ng/µL
2. Sigudang 1,930 275 ng/µL
3. Sigambi 1,787 210 ng/µL
4. Siasahan 1,833 52,5 ng/µL
5. Siorsik 1,937 305 ng/µL
6. Ramos 1,83 353 ng/µL
7. Kukubalam 1,929 410 ng/µL
8. Talipuyu 2,00 50 ng/µL
9. Sigambiri Putih 1,922 308 ng/µL
10. Sigambiri Merah 1,865 232 ng/µL
11. Martabe 1,905 453 ng/µL
12 Mandailing 1,835 418 ng/µL
Pada Tabel 4.2 menunjukkan hasil uji kualitatif DNA total padi dengan nilai kemurnian terendah diperoleh sebesar 1,830 pada koleksi padi Siasahan dan nilai kemurniaan tertinggi sebesar 2,00 pada koleksi padi Talipuyu, hal ini sesuai dengan literatur dari Fatchiyah et al., (2011) bahwa nilai kisaran kemurnian DNA adalah 1.8 – 2.0. Kemurnian DNA target sangat penting, karena ketidakmurnian suspesi DNA dapat mempengaruhi reaksi amplifikasi dan dapat menghambat kerja enzim DNA polimerase. Oleh sebab itu, hasil isolasi DNA total padi pada penelitian ini sudah dapat digunakan untuk analisis amplifikasi DNA dengan menggunakan mesin PCR.
17
tingginya kosentrasi cetakan DNA yang digunakan dalam PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA yang kurang baik. Cetakan DNA yang terlalu banyak kemungkinan menyulitkan primer yang digunakan untuk menempel.
Menurut Haris et al., (2003), kosentrasi DNA akan berdampak pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Kosentrasi DNA yang rendah akan menghasilkan fragmen yang tipis, sebaliknya kosentrasi DNA yang tinggi akan menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit membedakan antar fragmen.
4.3 Amplifikasi DNA Total Padi Lokal Sumatera Utara dengan Menggunakan Marka SSR
Amplifikasi DNA total koleksi padi lokal dan padi hibrida dengan menggunakan 4 marka SSR yaitu primer RM 580, RM 413, RM 131 dan RM 20. 4 primer yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari penelitian yang telah dilakukan oleh Singh et al., (2015) yang menggunakan primer RM 580, RM 413, RM 131 dan RM 20 sebagai penanda genetik dalam menganalisis kenakeragaman koleksi padi internasional.
Dari Gambar 4.3 menunjukkan bahwa seluruh primer yang digunakan dapat mengamplifikasi seluruh DNA total dari 12 koleksi padi yang diuji. Seluruh DNA total menghasilkan pita sebesar 603bp-1769bp dan memiliki total pita yang teramplifikasi pada seluruh primer sebesar 89 pita.
Hasil amplifikasi DNA menunjukkan bahwa seluruh primer yang digunakan dalam penelitian ini menghasilkan pita yang baik dan dengan keadaan pita yang jelas, hal ini dikarenakan menurut Simatupang (2015), dipengaruhi oleh kondisi DNA hasil ekstraksi yang menunjukkan adanya kesamaan sekuens antara DNA cetakan dengan primer. Menurut Langga (2012), semakin banyak sekuens yang dapat dikenali oleh primer pada sebuah DNA template, maka akan menghasilkan pita yang lebih banyak.
Pita-pita yang diperoleh dari hasil amplifikasi pada seluruh koleksi padi dengan menggunakan 4 primer menunjukkan pola pita yang teramplifikasi berbeda-beda pada masing-masing primer. Hal ini menunjukkan adanya polimorfisme pada seluruh pita yang dihasilkan. Menurut Suryatini (2011) polimorfisme ditandai dengan ada dan tidak adanya pita pada suatu sampel serta perbedaan ukuran pita yang dihasilkan setiap sampel. Polimorfisme yang dimiliki oleh masing-masing primer disajikan pada Tabel 4.4 di bawah ini
Tabel 4.4 Data Polimorfisme tiap Penanda SSR yang Digunakan
No Primer Ukuran Pita Jumlah Pita Polimorfik Jumlah Pita Monomorfik Total Pita Persentase Pita Polimorfik
1. RM 580 603bp-1578bp 12 12 24 50 %
2. RM 20 200bp-1769bp 19 10 29 65,52 %
3. RM 131 793bp-1685bp 9 7 16 56,25 %
4. RM 413 1431bp-1706bp 11 2 13 84,61 %
Total 51 31 82 64,1 %
19
Secara umum keempat primer yang digunakan dalam analisis ini dapat diketegorikan sebagai primer yang memiliki polimorfisme tinggi, maka keempat primer ini adalah primer yang baik. Pada penelitian Singh et al., (2015), dari 28 primer yang digunakan dalam menganalisis keanekaragaman koleksi padi internasional, primer RM 580, RM 20, RM 413 dan RM 131 merupakan primer yang memiliki nilai Polymorphic Informationt Content (PIC) tertinggi dari primer-primer yang lainnya. Menurut Tasliah et al ., (2013), nilai PIC didefinisikan sebagai nilai yang menginformasikan tingkat polimorfisme suatu marka yang digunakan. Menurut Kristamtini et al., (2014) jika semakin tinggi persentase lokus polimorfik maka, semakin tinggi pula koefisien keragaman yang timbul dalam populasi.
4.4 Analisis Keanekaragaman Genetik Padi Lokal Sumatera Utara
Hubungan kekerabatan genetik pada setiap jenis tanaman padi pada penelitian ini, dapat ditentukan berdasarkan kemiripan genetik antar individu, yang dapat dilihat dari nilai koefisien yang diperoleh pada masing-masing individu. Nilai koefisien yang diperoleh disajikan dalam bentuk dendogram (Gambar 4.5) dan matriks kemiripan genetik (Lampiran 2).
Analisis keanekaragaman genetik dilakukan pada 12 koleksi padi yang terdiri dari 11 koleksi padi lokal Sumatera Utara yaitu Sigudang, Sigambi, Siasahan, Siorsik, Ramos, Kukubalam, Talipuyu, Sigambiri Merah, Sigambiri Putih, Martabe dan Mandailing, dan 1 koleksi padi hibrida yaitu IR64. Kemiripan genetik dengan nilai tertinggi terdapat pada koleksi padi antara Ramos dan Kukubalam yaitu sebesar 1,00 (100%), hal ini menunjukkan bahwa koleksi padi Ramos dan Kukubalam adalah kembar identik secara genetik. Walaupun secara morofologinya (Lampiran 3) koleksi benih padi Ramos dan Kukubalam memiliki warna dan ukuran yang berbeda. Hal ini terjadi mungkin disebabkan karena telah berbaur benih padi Ramos dan Kukubalam, karena para petani kebanyakan mencampur benih padi dengan jenis lainnya saat musim panen tiba.
itu, hal ini menunjukkan bahwa antara koleksi padi Mandailing dan Sigudang, Mandailing dan Sigambi serta Mandailing dan Siasahan memiliki hubungan kekerabatan genetik yang cukup jauh.
Jika dibandingkan dengan koleksi padi hibdrida yaitu padi IR64, jarak genetik terjauh diperoleh antara koleksi padi IR64 dan Sigambiri putih serta IR64 dan Mandailing, yang memiliki jarak genetik sebesar 0,53 (53%). Dan jarak genetik terdekat diperoleh pada koleksi padi antara IR64 dan Sigudang, IR64 dan Ramos, IR64 dan Sigambi serta IR64 dan Kukubalam, yaitu sebesar 0,76 (76%). Tinginya nilai jarak genetik yang dimiliki antar individu, menandakan bahwa jarak genetik yang dimiliki semakin dekat. Kedekatan suatu jarak genetik akan membuat suatu individu cenderung mengelompok pada suatu kelompok yang sama. Oleh karena itu koleksi padi IR64, Sigambi, Kukubalam dan Ramos berada pada satu kelompok yang sama (grafik dendogram gambar 4.5). Namun, koleksi padi Sigudang tidak berada pada satu kelompok yang sama walaupun memiliki jarak genetik yang sama dengan IR64. Hal ini disebabkan karena koleksi padi Sigudang memiliki jarak genetik yang cukup jauh dengan koleksi padi Sigambi, Kukubalam dan Ramos yaitu sebesar 0,66 (66%).
Jarak genetik yang dimiliki oleh suatu individu menjadi penting dalam pemuliaan tanaman. Hal ini disebabkan jika semakin jauh jarak genetik antar individu maka semakin beragam pula genetik yang dimiliki, dan semakin beragam genetik yang dimiliki maka semakin baik pula digunakan sebagai bahan untuk pemuliaan tanaman. Koleksi padi Mandailing merupakan koleksi padi yang sangat baik digunakan sebagai bahan pemuliaan tanaman karena secara genetis, koleksi padi Mandailing memiliki jarak genetik terjauh dari seluruh koleksi padi pada penelitian ini. Sedangkan koleksi padi Ramos, Kukubalam dan Sigambi tidak cukup baik digunakan dalam pemuliaan tanaman kerena memiliki jarak yang dekat.
21
Informasi hubungan genetik diantara individu di dalam dan diantara spesies mempunyai kegunaan penting bagi perbaikan tanaman. Dalam program pemuliaan tanaman, pendugaan hubungan genetik sangat berguna untuk mengelola plasma nutfah, identifikasi kultifar, membantu seleksi tetua untuk persilangan, serta mengurangi jumlah individu yang dibutuhkan untuk pengambilan sampel dengan kisaran keragaman genetik yang luas (Julisaniah et al., 2008).
Gambar 4.5 Dendogram hasil pengelompokkan dua belas padi berdasarkan hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan empat penanda SSR
Dari hasil pengelompokkan dengan metode UPGMA berdasarkan Coeficient Dice dengan menggunakan software NTSys, menunjukkan dendogram
kelompok 3 terdiri dari Sigambiri Merah dan Sigambiri Putih yang berasal dari Kabupaten Karo dan Simalungun.
Kelompok 2 terdiri dari koleksi padi Sigudang, Siasahan dan Talipuyu. Kelompok 4 hanya terdiri dari koleksi padi Siorsik saja dan kelompok 5 terdiri dari Martabe dan Mandiling. Ketiga kelompok ini merupakan kelompok yang mengelompok secara acak tidak berdasarkan atas sebaran wilayahnya. Meskipun demikian kelompok 2 merupakan kelompok yang seluruh koleksi padinya, berasal dari satu wilayah yang sama yaitu dari Kabupaten Tapanuli Selatan. Koleksi padi yang berasal dari wilayah Kabupaten Tapanuli Selatan tidak hanya Sigudang, Siasahan dan Talipuyu saja, namun koleksi padi Siorsik dan Martabe juga berasal dari wilayah Tapanuli Selatan. Tetapi keduanya tidak mengelompok bersama di kelompok 2 melainkan terpisah. Dimana koleksi padi Siorsik mengelompok sendiri, sedangkan Martabe mengelompok bersama dengan koleksi padi Mandailing yang berasal dari Kabupaten Mandailing Natal.
Pengelompokkan koleksi padi pada kelompok 2, 4 dan 5 yang terjadi secara acak, hal ini mungkin dikarenakan koleksi padi yang masih berada pada wilayah yang sama yaitu Sumatera Utara sehingga, benih padi sudah berbaur dengan benih padi yang berasal dari daerah lain. Dimana benih padi tersebut dibawa oleh para petani dan kemudian membudidayakannya di daerah petani yang membawa benih padi tersebut. Sehingga menyebabkan, keanekeragaman genetik koleksi padi tidak berdasarkan atas sebaran wilayahnya. Menurut Kristamtini et al., (2014) implikasi dari dendogram tersebut adalah kultivar-kultivar yang berada pada satu kelompok menunjukkan adanya kemiripan genetik yang besar atau memiliki jarak genetik yang kecil.
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari hasil penelitian ini diperoleh kesimpulan sebagai berikut
a. Dari 11 koleksi padi lokal yang berasal dari Sumatera Utara dengan menggunakan 4 primer SSR yaitu RM 580, RM 20, RM 413 dan RM 131, menghasilkan total 82 pita DNA, 51 pita DNA merupakan pita polimorfik dan 31 pita DNA merupakan pita yang monomorfik, dan berada pada ukuran 200bp-1769bp. Persentase pita polimorfik tertinggi diperoleh pada primer RM 413 yaitu sebesar 84% dan terendah sebesar 50% yang diperoleh pada primer RM 580 dengan rata-rata polimorfisme yang diperoleh pada seluruh primer yaitu sebesar 64,11%.
b. Jarak genetik terjauh dimiliki oleh koleksi padi Mandailing dengan rata-rata kemiripan genetik yang dimiliki sebesar 0,55 (55%), hal ini menunjukkan bahwa genetik yang dimiliki oleh koleksi padi Mandailing cukup beragam dan cukup baik digunakan sebagai bahan pemuliaan tanaman. Seluruh koleksi padi mengelompok di koefisien 0,58(58%) menjadi 5 kelompok, 2 kelompok mengelompok berdasarkan sebaran wilayahnya sedangkan 3 kelompok mengelompok secara acak.
5.2 Saran
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Botani Padi (Oryza sativa L.)
Padi merupakan tanaman pangan penting yang menyediakan bahan pangan pokok, dan 35-60% kalorinya dikonsumsi lebih dari 2,7 milyar penduduk dunia. Sekitar 80% total padi yang ditanam, 55% merupakan padi lahan sawah irigasi dan 25% sisanya adalah padi tadah hujan yang berada pada dataran rendah (Gorantla et al., 2005)
Di alam ditemukan ribuan varietas tanaman padi yang dikenal manusia, namun tidak semuanya mempunyai nilai ekonomis. Spesies yang dibudayakan oleh petani umumnya adalah spesies Oryza sativa L. Genus Oryza terdiri tidak kurang dari 25 spesies, beberapa spesies yang dikenal oleh masyarakat antara lain Oryza sativa, Oryza glaberrima, Oryza australiensis, Oryza latifolia, Oryza
longistaminata, Oryza meridionalis, Oryza officinalis, Oryza punctata, Oryza
rufipogan dan Oryza nivara. Salah satu spesies yang memiliki nilai ekonomi tinggi
dari beberapa spesies tersebut adalah spesies Oryza sativa L. Yang sangat berkembang karena mampu berproduksi dan beradaptasi dengan baik (Utama, 2015). Ada dua spesies padi yang dibudidayakan manusia secara massal, Oryza sativa yang berasal dari Asia dan O. glaberrima yang berasal dari Afrika Barat
(Norsalis, 2011).
5
berambut dengan ukuran panjang antara 7-10 mm dan lebar sekitar 3 mm. Pada waktu masak, buah akan bewarna kuning, pada jenis tertentu ada yang rontok ada yang tidak. Buah (padi) memiliki kandungan yang berbeda, ada yang kaya pati, tetapi ada juga yang kaya perekat (ketan). Tanaman padi dapat tumbuh di ketinggian antara 1-2000 meter dari permukaan laut. Umur tanaman padi sangat bervariasi, dari yang berumur genjah sampai berumur dalam. Varietas yang berumur genjah sudah dapat dipanen pada umur 90 hari, tetapi pada varietas dalam, tanaman padi baru dapat dipanen pada umur lebih dari 6 bulan. Varietas yang dibudidayakan oleh petani umumnya sudah dapat dipanen pada umur 3-4 bulan setelah tanam, sehingga pada sawah irigasi petani dapat menanam padi 2-3 kali dalam satu tahun, tergantung varietas yang digunakan (Utama, 2015).
2.2 Keanekaragaman Genetik Padi
Indonesia merupakan suatu negara dengan keanekaragaman hayati sangat tinggi atau disebut megabiodiversity (Suryanto, 2003). Indonesia memiliki kekayaan plasma nutfah padi yang cukup besar berupa varietas lokal dan atau spesies liar. Kepulauan Nusantara di zaman dahulu kala menjadi satu dengan benua Asia, merupakan Pusat Asal Tanaman (Center of Species Origin) padi. Varietas lokal padi telah berabad-abad dibudidayakan secara turun-temurun oleh sekelompok masyarakat pada agroekosistem spesifik, sehingga varietas lokal masing-masing memiliki sifat tahan/toleran terhadap cekaman biotik maupun abiotik yang terjadi pada agroekosistem spesifik terkait (Sitaresmi et al., 2013). Keanekaragaman genetik dapat terjadi karena adanya perubahan nukleotida penyusun DNA. Perubahan ini mungkin dapat mempengaruhi fenotipe suatu organisme yang dapat dipantau dengan mata telanjang, atau mempengaruhi reaksi individu terhadap lingkungan tertentu. Secara umum keanekaragaman genetik dari suatu populasi dapat terjadi karena adanya mutasi, rekombinasi, atau migrasi gen dari satu tempat ke tempat lain (Suryanto, 2003).
adalah O. glaberrima yang ditanam pada skala kecil di Afrika Barat (Khush, 1997). Jenis yang dikenal adalah O. sativa dengan dua subspesies. Pertama, Japonica (padi bulu) yang ditanam di Indonesia. Adaptasi Japonica yang berkembang di beberapa daerah di Indonesia disebut subspesies Javanica. Berdasarkan sistem budidaya, padi dibedakan dalam dua tipe, yaitu padi kering (gogo) dan padi sawah. Padi gogo ditanamn di lahan kering (tidak digenangi), sedangkan padi sawah ditanam di sawah yang selalu tergenang. Varietas unggul padi yang saat ini banyak ditanaman berasal dari hasil silanagn IRRI atau silangan dalam negri. Varietas hasil silangan IRRI diawali dengan IR, yaitu IR 48, IR 64, IR 65, IR70, IR 72 dan IR 74. Varietas hasil silangan dalam negeri antara lain: Cisadane, Cisanggarung, Cisantana, Cisakon, Citanduy, Citarum, Fatmawati, Sintanur, Winongo dan Yuwono (Purwono & Purnamawati, 2007). Tanaman padi yang didomestikasi di Asia umumnya tergolong spesies sativa. Dalam spesies Oryza sativa, telah terbentuk populasi genotipe padi yang sangat beragam dan berbeda dari satu sentra produksi ke sentra produksi lainnya. Dalam terminologi pemuliaan dan teknik budi daya, populasi genotipe yang homogen (uniform), unik, dan stabil disebut sebagai varietas atau kultivar (Sitaresmi et al., 2013).
2.3 Plasma Nutfah Padi Lokal
Biodiversitas (plasma nutfah) padi merupakan sumber genetik yang sangat diperlukan untuk membentuk varietas padi unggul, dengan cara merakit sifat-sifat yang diinginkan melalui program pemuliaan, baik konvensional maupun inkonvensional. Kelompok plasma nutfah padi antara lain varietas introduksi, varietas unggul, kultivar primitif, galur-galur harapan, dan varietas lokal (Wijayanto, 2013).
7
kondisi suboptimal tersebut. Setiap musim petani memilih varietas padi dengan rasa nasi enak, sehingga varietas lokal pada umumnya memiliki mutu yang tinggi (Sitaresmi et al., 2013).
2.4 Marka Molekular
Kemajuan dalam bidang biologi molekuler, memungkinkan keragaman genetik suatu populasi dapat diamati pada tingkat DNA. Marka molekuler ini tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan (Handayani et al., 2012). Pendekatan genetika molekuler dengan menggunakan penanda DNA telah berhasil membentuk penanda molekuler yang mampu mendeteksi gen dan sifat-sifat tertentu. Marka molekuler pada tanaman dapat dibedakan menjadi dua yaitu penanda molekuler berdasarkan teknik PCR dan marka molekuler tanpa menggunakan teknik PCR. Penanda molekuler yang berdasarkan teknik PCR antara lain Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), AFLP dan SSR sedangkan RFLP merupakan penanda
molekuler yang tidak menggunakan teknik PCR (Afifah, 2012).
2.5 SSR
Istilah mikrosatelit ini pertama kali diciptakan oleh Litt dan Luty (Litt & Luty,
1998). Mikrosatelit sederhana dengan motif berulang yang terdiri dari 1 sampai 6
pasangan basa, dan dapat ditemukan pada wilayah coding dan non – coding.
Dengan laju mutasi dari jenis penanda genetik dapat diperkirakan antara 10-2 dan
10-4 per generasi. Urutan berulang-ulang tersebut membentuk motif yang unik untuk suatu jenis organisme. Mikrosatelit banyak dijumpai pada genom eukariot dan umumnya terdistribusi secara merata pada genom organisme tertentu. Marka mikrosatelit ini bersifat kodominan dan memiliki tingkat keragaman alel yang tinggi serta mudah, cepat, dan ekonomis dalam aplikasinya karena berdasarkan teknik PCR (Bahagiawati et al., 2005).
Keuntungan utama dari mikrosatelit sebagai penanda genetik adalah bahwa
marka ini mewarisi model Mendel sebagai penanda kodominan. Selanjutnya,
tingkat polimorfisme yang tinggi, kelimpahan tinggi dan distribusi yang luas di
seluruh genom, membuat mikrosatelit sebagai salah satu penanda genetik yang
2002 & Wright & Bentzen, 1994). Dan juga, marka mikrosatelit atau SSR memiliki variasi alelik yang tinggi, mudah dianalisis dengan menggunakan teknik PCR dan memiliki kemampuan untuk diulang (reprodusibilitas) yang tinggi (McCouch et al. 2002). Namun, kelemahan dari analisis mikrosatelit ini adalah biaya yang relatif tinggi dan teknis yang sulit karena menggunakan primer yang spesifik (Miah et al.,
2013).
2.6 Kromosom Padi
Padi budidaya (Oryza sativa L.) yang telah berkembang penggunaannya hingga saat ini adalah spesies padi dari genus Oryza. Genus ini mempunyai sedikitnya 23 spesies, termasuk dua spesies padi budidaya O. Sativa yang dikenal sebagai padi Asia dan O. Glaberrima Stud yang berasal dari afrika (Abdullah, 2006).
O. Sativa memiliki kromosom 2n = 24, AA dan O. Glaberrima memiliki
BAB 1
LATAR BELAKANG
1.1Latar Belakang
Sebagian besar masyarakat Indonesia menggunakan padi sebagai makanan pokok, dan sekaligus juga sebagai sumber mata pencaharian. Oleh karena itu, upaya peningkatan produksi komoditas pangan penting untuk mendapat prioritas yang tinggi (Patti & Silahooy, 2013). Padi merupakan komoditas utama di Indonesia yang berperan penting dalam mendukung ketahanan pangan. Jumlah penduduk Indonesia terus meningkat sehingga menyebabkan tingkat konsumsi rata-rata beras juga meningkat (Utami et al., 2015).
Sumatera Utara banyak memiliki sumber daya alam yang cukup potensial dan salah satu lumbung padi di Indonesia (Siregar, 2015). Padi lokal Sumatera Utara cukup tinggi, yang dapat digunakan dalam pemuliaan tanaman. Namun keberadaan padi hibrida semakin mengancam keberadaan padi lokal di Sumatera Utara saat ini, padi lokal Sumatera Utara sudah semakin berkurang dan banyak yang sudah tidak ditemukan lagi. Menurut Daradjat et al., (2015) perubahan pemanfaatan lahan ekosistem sawah dataran tinggi menjadi lahan untuk pertanaman sayuran dan hortikultura lainnya, menjadi salah satu penyebab varietas padi lokal hampir punah. Apabila keanekaragaman genetik padi lokal rendah maka akan meningkatkan kerawanan genetik padi jika terjadi wabah hama dan atau penyakit. Varietas lokal sering memiliki daya adaptasi yang lebih unggul dibandingkan dengan varietas modern, terutama dari aspek ketahanan terhadap cekaman biotik (hama dan penyakit), cekaman abiotik (keracunan hara, kondisi lingkungan biofisik yang kurang optimum), dan mutu gabah dan rasa nasinya.
dalam identifikasi plasma nutfah, konservasi, pemilihan tetua untuk program seleksi (Putri et al., 2013).
Hingga saat ini banyak ditemukan marka molekuler berbasis DNA, seperti Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP), amplified fragment lenght
polymorphism (AFLP), simple sequnece repeat (SSR), dan single nucleotide
polymorphism (SNP) (Susanto et al., 2015). Marka SSR merupakan marka yang
banyak digunakan, karena bersifat kodominan, dapat mendeteksi keragaman alel pada tingkat tinggi, serta mudah dan tidak terlalu mahal untuk dianalisis dengan menggunakan Polymerase chain reaction (PCR) (Moeijopawiro, 2010). Seperti yang telah dilaporkan oleh Kristamtini et al., (2014) bahwa marka SSR mampu
membedakan kultivar padi hitam lokal. Marka SSR juga dapat membedakan padi
aromatik dan bukan aromatik hasil penelitian Padmadi (2009). Namun, penggunaan
marka SSR untuk keanekaragaman genetik padi lokal di Indonesia masih sedikit
dilakukan khususnya di Sumatera Utara. Data genetik mengenai padi lokal
Sumatera Utara saat ini belum ada, maka perlu dilakukan penelitian untuk
menganalisis keanekaragaman genetik padi lokal Sumatera Utara berdasarkan
marka SSR.
1.2 Permasalahan
Sumatera Utara merupakan salah satu provinsi yang memiliki plasma nutfah padi lokal yang cukup tinggi. Padi lokal yang dimiliki Sumatera Utara semakin lama semakin menghilang atau bahkan tidak ditemukan lagi, hal ini dikarenakan para petani yang sudah beralih ke padi hibrida dan beralih ke tanaman lain. Maka perlu dilakukan analisis keanekaragaman genetik dengan menggunakan marka SSR agar dapat membantu dalam pemuliaan tanaman.
1.3 Tujuan Penelitian
3
1.4 Hipotesis
Padi lokal Sumatera Utara memiliki keanekaragaman genetik tinggi yang dapat dideteksi dengan menggunakan marka molekuler SSR.
1.5 Manfaat Penelitian
KEANEKARAGAMAN GENETIK PADI (Oryza sativa L.) LOKAL SUMATERA UTARA DENGAN MENGGUNAKAN PENANDA SIMPLE
SEQUENCE REPEAT (SSR)
ABSTRAK
GENETIC DIVERSITY OF LOCAL RICE (Oryza sativa L.) NORTH SUMATERA WITH USE MARKER SIMPLE SEQUENCE REPEAT (SSR)
ABSTRACT
Analysis genetic diversity of local rice Sumatera Utara can be done using molecular markers, one of which is the Simple Sequence Repeat (SSR). The four primer SSR is primer RM 20, RM 580, RM 413 and RM 131 used to this research for analysis genetic diversity of 11 colection from local rice of Sumatera Utara and 1 colection rice hybrid. Amplificafed alel with Polymerase Chain Reaction (PCR) had electroforesis in gel agarose. The final totals get 82 band taht determinated by 200bp-1769bp in all primer. The higher polymorphic band in primer RM 20 as many as 19 band DNA and the lowest polymorphic band in primer RM 131 as many as 9 band DNA. The highest percentage of polymorphic band exist in primer RM 413 as many as 84.61%. The data is grouped by using Unweight Pair Group Method with Arithme Average (UPGMA) to present the data in the form dendogram. The result shows that there are five groups with the similarity coefficient values is 0.58 to 1.00 (58% -100%).
KEANEKARAGAMAN GENETIK PADI (Oryza sativa L.) LOKAL SUMATERA UTARA DENGAN MENGGUNAKAN PENANDA SIMPLE
SEQUENCE REPEAT (SSR)
SKRIPSI
OLEH
RIRI INDRIYANI 120805020
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
KEANEKARAGAMAN GENETIK PADI (Oryza sativa L.) LOKAL SUMATERA UTARA DENGAN MENGGUNAKAN PENANDA SIMPLE
SEQUENCE REPEAT (SSR)
SKRIPSI
Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains
OLEH
RIRI INDRIYANI 120805020
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
PERSETUJUAN
Judul : Keanekaragaman Genetik Padi (Oryza sativa L.) Lokal Sumatera Utara dengan Menggunakan Penanda Simple Sequence Repeat (SSR)
Kategori : Skripsi
Nama : Riri Indriyani
Program Studi : Sarjana (S1) Biologi Nomor Induk Mahasiswa : 120805020
Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara
Disetujui di: Medan, Januari 2017
Komisi Pembimbing,
Pembimbing 2 Pembimbing 1
Dr. Elimasni, M. Si. Dr. Saleha Hannum, M. Si
NIP. 196505241991032001 NIP. 197108312000122001
Disetuji Oleh
Departemen Biologi FMIPA USU Ketua
KEANEKARAGAMAN GENETIK PADI (Oryza sativa L.) LOKAL SUMATERA UTARA DENGAN MENGGUNAKAN PENANDA SIMPLE
SEQUENCE REPEAT (SSR)
SKRIPSI
Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil karya sendiri. Kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.
Medan, Januari 2017
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT yang telah memberikan kasih dan anugerahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul Keanekaragaman Genetik Padi (Oryza Sativa L.) Toleran Suhu Rendah dengan Menggunakan Penanda Simple Sequence Repeat (SSR). Solawat dan salam saya ucapkan kepada Rasulullah Muhammad SAW, sahabat dan keluarga beliau.
Selama melakukan peneltian, saat berada di lapangan maupun di laboratorium, banyak sekali dukungan yang penulis dapatkan dari berbagai pihak. Penulis ingin menyampaikan terimakasih kepada:
a. Bapak Sohibun dan Juminah yang telah memberikan dukungan moril dan nasihat-nasihat untuk penulis dari awal penelitian hingga akhir penelitian. b. Ibu Dr. Saleha Hannum M. Si sebagai dosen pembimbing I atas dorongan,
diskusi, bantuan dan kasih sayang yang diberikan kepada penulis dari awal hingga akhir.
c. Ibu Dr. Elimasni, M. Si sebagai dosen pembimbing II atas perhatian, diskusi dan nasihat-nasihat, di tengah kesibukkan akitivitas beliau.
d. Ibu Dr. Isnaini Nurwahyuni, M. Si sebagai dosen penguji I yang telah memberikan masukan dan saran yang membangun sehingga semakin menyempurnakan penulisan ini.
e. Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M. Biomed sebagai dosen penguji II atas berbagai saran yang telah diberikan kepada penulis sehingga memudahkan penulis dalam menyelesaikan penelitian ini.
f. Bapak Ir. Amrizal Yusuf dari BPTP Sumuatera Utara atas segala perhatian, konsultasi dan nasihat yang telah diberikan kepada penulis dalam mencari berbagai informasi padi Sumatera Utara dan pemberian benih yang sangat membantu penulis dalam menyelesaikan penelitian.
h. Ibu Yullianida, Sp, M.Si dari BBPadi Sukamandi Jawa Barat atas keluangan waktu yang telah diberikan beliau di tengah-tengah kesibukan untuk mengirimkan benih padi kepada penulis.
Terimakasih atas segala doa, harapan dan dukungan yang telah diberikan kepada penulis. Penulis menyadari sepenuhnya bahwa dalam penulisan skripsi ini masih terdapat kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun demi kesempurnaan skripsi ini.
Medan, Januari 2017
KEANEKARAGAMAN GENETIK PADI (Oryza sativa L.) LOKAL SUMATERA UTARA DENGAN MENGGUNAKAN PENANDA SIMPLE
SEQUENCE REPEAT (SSR)
ABSTRAK
GENETIC DIVERSITY OF LOCAL RICE (Oryza sativa L.) NORTH SUMATERA WITH USE MARKER SIMPLE SEQUENCE REPEAT (SSR)
ABSTRACT
Analysis genetic diversity of local rice Sumatera Utara can be done using molecular markers, one of which is the Simple Sequence Repeat (SSR). The four primer SSR is primer RM 20, RM 580, RM 413 and RM 131 used to this research for analysis genetic diversity of 11 colection from local rice of Sumatera Utara and 1 colection rice hybrid. Amplificafed alel with Polymerase Chain Reaction (PCR) had electroforesis in gel agarose. The final totals get 82 band taht determinated by 200bp-1769bp in all primer. The higher polymorphic band in primer RM 20 as many as 19 band DNA and the lowest polymorphic band in primer RM 131 as many as 9 band DNA. The highest percentage of polymorphic band exist in primer RM 413 as many as 84.61%. The data is grouped by using Unweight Pair Group Method with Arithme Average (UPGMA) to present the data in the form dendogram. The result shows that there are five groups with the similarity coefficient values is 0.58 to 1.00 (58% -100%).
DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PENGESAHAN i
PERNYATAAN ii
KATA PENGANTAR iii
ABSTRAK v
ABSTRACT vi
DAFTAR ISI vii
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR GAMBAR x
DAFTAR LAMPIRAN xi
BAB 1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang 1
1.2. Permasalahan 2
1.3. Tujuan Penelitian 2
1.4. Hipotesis 3
1.5. Manfaat Penelitian 3
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Botani Padi (Oryza sativa L.) 4
2.2. Kanekaragaman Genetik Padi (Oryza sativa L.) 4 2.3. Plasma Nutfah Padi (Oryza sativa L.) Lokal 6
2.4. Marka Molekular 6
2.5. SSR (Simple Sequence Repeat) 7
BAB 3. METODOLOGI
3.1. Waktu dan Tempat 8
3.2. Alat dan Bahan 8
3.3. Prosedur 8
3.1. Persiapan Bahan Tanaman 8
3.2. Isolasi DNA 9
3.3 Uji Kualitatif dan Kuantitaif DNA Genom Padi 10
3.3.1 Elektroforesis 10
3.3.2 Nanofotomoter 10
3.4. Amplifikasi DNA 11
3.5. Elektroforesis Hasil Amplifikasi DNA 12
3.6. Analisis Data 12
3.4.1. Scoring Pita Polimorfik 12
3.4.2. Analisis Keragaman Genetik 12 BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi DNA Genom Padi Lokal Sumatera Utara 13 4.2 Uji Kualitas dan Kuantitas DNA Genom Padi Lokal 14 Sumatera Utara
dengan Mengguakan Marka SSR
4.4 Analisis Keanekaragaman Genetik Padi Lokal Sumatera 18 Utara
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan 22
5.2 Saran 22
DAFTAR PUSTAKA 23
DAFTAR TABEL
Nomor Judul Halaman
Tabel
Tabel 3.1 Sampel padi lokal yang digunakan dalam analisis 8 keanekaragaman genetik
Tabel 3.2 Reaksi amplifikasi DNA genom padi 11
Tabel 3.3 Sekuens primer mikrosatelit dan hasil optimasi suhu 11 Penempelan
DAFTAR GAMBAR
Nomor Judul Halaman
Gambar
4.1 Hasil visualisasi isolasi DNA genom padi 13 4.3 Hasil elektoroforesis amplifikasi DNA genom padi lokal 16 dengan primer SSR
4.5 Dendogram hasil pengelompokkan dua belas koleksi padi 20 berdasarkan hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Judul Halaman
Lampiran
Lampiran 1. Data mentah scoring pita polimorfik 27 Lampiran 2. Matriks kemiripan genetik hasil amplifikasi DNA 28
menggunakan 4 penanda SSR
Lampiran 4. Gambar benih padi lokal Sumatera Utara dan Hibrida 30
