ANALISIS KEANEKARAGAMAN GENETIK JERUK KEPROK (Citrus nobilis) SUMATERA UTARA MENGGUNAKAN MARKA SIMPLE SEQUENCE REPEAT (SSR) SKRIPSI

(1)

ANALISIS KEANEKARAGAMAN GENETIK JERUK KEPROK (Citrus nobilis) SUMATERA UTARA MENGGUNAKAN MARKA SIMPLE

SEQUENCE REPEAT (SSR)

SKRIPSI

NAOMI CLARA PANGARIBUAN 120805039

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

2018

(2)

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains

NAOMI CLARA PANGARIBUAN 120805039

``

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

2018

(3)

PERNYATAAN

SKRIPSI

Saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah hasil karya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.

Medan, April 2018

Naomi Clara Pangaribuan 120805039

(4)

PENGESAHAN SKRIPSI

Judul : Analisis Keanekaragaman Genetik Jeruk

Keprok (Citrus nobilis) Sumatera Utara Menggunakan Marka Simple Sequence Repeat (SSR)

Kategori : Skripsi

Nama : Naomi Clara Pangaribuan

Nomor Induk Mahasiswa : 120805039 Program Studi : Sarjana 1

Fakultas : MIPA- Universitas Sumatera Utara

Disetujui di Medan, April 2018

Pembimbing II Pembimbing I

Dr. Isnaini Nurwahyuni, M. Sc Dr. Saleha Hannum, M. Si NIP. 19600523 198502 2 001 NIP. 1971083 1200012 2 001

(5)

PENGESAHAN SKRIPSI

Judul : Analisis Keanekaragaman Genetik Jeruk

Keprok (Citrus nobilis) Sumatera Utara Menggunakan Marka Simple Sequence Repeat (SSR)

Kategori : Skripsi

Nama : Naomi Clara Pangaribuan

Nomor Induk Mahasiswa : 120805039 Program Studi : Sarjana 1

Fakultas : MIPA- Universitas Sumatera Utara

Disetujui di Medan, April 2018

Pembimbing II Pembimbing I

Dr. Isnaini Nurwahyuni, M. Sc Dr. Saleha Hannum, M. Si NIP. 19600523 198502 2 001 NIP. 1971083 1200012 2 001

Ketua Program Studi

Dr. Saleha Hannum, M. Si NIP. 1971083 1200012 2 001

(6)

ii

ABSTRAK

Jeruk keprok merupakan salah satu jenis jeruk yang digemari rakyat Indonesia. Sumatera Utara merupakan salah satu sentra produsen jeruk di Indonesia yang memiliki beberapa koleksi jeruk keprok, yaitu keprok Sipirok, keprok Maga dan keprok Brastepu. Namun sampai saat ini belum ada informasi keanekaragaman genetik pada tingkat molekuler, untuk itu dilakukan pendataan keragaman genetik secara molekuler dengan metode Simple Sequence Repeat (SSR). Pada penelitian ini, 8 sampel berasal dari 3 kabupaten di Sumatera Utara. Hasil analisis 4 primer yaitu dengan total pita 48 (100 bp-300 bp), pita polimorfik 31, dan pita monomorfik 18.

Keragaman genetik dengan menggunakan NTsys mengelompok pada nilai koefisien kemiripan 0,74 sebanyak 3 kelompok. Jarak genetik terendah pada Sibanggor Tonga dengan Baringin Siumuran yaitu 0,63 (63%), dan jarak tertinggi yaitu 1,0 (100%) pada Huta Namale dengan Huta Lombang, Aek Kambiri dan Aek Horsik.

Kata kunci: Jeruk Keprok, Keanekaragaman Genetik, NTsys. SSR.

(7)

iii

ANALYSIS GENETIC DIVERSITY OF JERUK KEPROK (Citrus nobilis) IN SUMATERA UTARA USING MARKER SIMPLE

ABSTRACT

Mandarin fruit is one type of orange that popular in Indonesia. Sumatera Utara is one of the centers of citrus producers in Indonesia which have some collection of mandarin fruit is Maga, Sipirok, and Brastepu. But until now there has been no information on genetic diversity at the molecular level, for it to do collect data of genetic diversity on molecular using marker Simple Sequence Repeat (SSR).

This research used 8 samples which were taken from 3 districts in Sumatera Utara.

The analysis with 4 primers resulted total 48 bands (100 bp-300 bp), consisted of 30 polymorphic bands and 18 monomorphic bands. Analysis of genetic diversity using NTsys clustered on 0,74 similarity coefficient value into 3 group. Distance the lowest genetic on the Sibanggor Tonga with Baringin Siumuran is 0,63 (63%), and the highest distance is 1,0 (100%) on Huta Namale with Huta Lombang, Aek Kambiri, and Aek Horsik.

Keywords: Mandarin Fruit, Genetic Diversity, Ntsys, SSR.

(8)

iv

PENGHARGAAN

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Kuasa, atas segala anugerah dan berkat dari-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan hasil penelitian ini dengan judul “Analisis Keanekaragaman Genetik Jeruk Keprok (Citrus nobilis) Sumatera Utara Menggunakan Marka Simple Sequence Repeat (SSR)”.

Ucapan terimakasih terbesar pertama kali penulis sampaikan kepada kedua orang tua Penulis, Ayahanda dan Alm. Ibunda tercinta yang selalu memberikan doa, semangat, perhatian, pengorbanan dan kasih sayang terbesar kepada penulis. Kepada kakak dan adik yang selalu menghibur dan memberikan semangat kepada penulis.

Seluruh keluarga besar Pangaribuan dan Sinambela atas segala bantuan yang diberikan kepada penulis baik moril maupun materi.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih banyak kepada Ibu Dr. Saleha Hannum, M.Si selaku Dosen Pembimbing I atas dorongan, perhatian dan bimbingan yang diberikan kepada penulis dan kepada Ibu Dr. Isnaini Nurwahyuni, M.Sc selaku Dosen Pembimbing II atas arahan dan kepercayaan yang diberikan kepada Penulis, kepada Bapak Prof. Dwi Suryanto, M.Sc selaku Dosen Penguji I dan Ibu Dr. Elimasni, M.Si selaku Dosen Penguji II yang telah banyak memberikan saran dan masukan untuk penyusunan skripsi ini. Semoga Tuhan Yang Maha Esa membalas jasa-jasa Bapak dan Ibu sekalian.

Dalam kesempatan ini juga penulis juga menyampaikan ucapan terimakasih kepada teman-teman seperjuangan AOC12 yang tidak dapat sebutkan satu per satu, dan ucapan terimakasih terkhusus anggota CG26 yang selalu ada memberi dukungan dan mendoakan penulis. Buat CGL Johansen, CGL Bang Andre, kak Angel, kak Kissy dan Bang Samgar terimakasih banyak penulis ucapkan atas dukungan material dan doa yang tidak henti-hentinya diberikan untuk penulis.

Terimakasih banyak kepada sahabat penulis yaitu Villa Tamora Purba dan Wilda Hutagalung, yang selalu mengingatkan saya untuk mengerjakan penelitian dan perbaikan skripsi ini. Dan selalu ada untuk memarahi penulis untuk tetap kuat, berdoa dan semangat walaupun masalah yang selalu datang.

(9)

v

Penulis menyadari bahwa masih terdapat banyak kekurangan dan ketidak sempurnaan dalam penulisan hasil penelitian ini, untuk itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak agar tercapai kesempurnaan dalam penulisan hasil penelitian ini. Juga terimakasih kepada semua pihak yang telah membantu penulis baik secara langsung dan tidak langsung, kepada keluarga, teman sejawat, dan para dosen. Mohon maaf atas segala kekurangan.

Medan, April 2018

Penulis

(10)

vi

DAFTAR ISI

Halaman

PENGESAHAN LAPORAN TUGAS AKHIR i

ABSTRAK ii

ABSTRACT iii

PENGHARGAAN iv

DAFTAR ISI vi

DAFTAR TABEL viii

DAFTAR GAMBAR ix

DAFTAR LAMPIRAN x

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Perumusan Masalah 2

1.3 Tujuan Penelitian 2

1.4 Manfaat Penelitian 2

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jeruk Keprok (Citrus nobilis) 3

2.2 Botani Jeruk Keprok 3

2.3 Marka Molekuler 5

2.3.1 Penanda Simple Sequence Repeat (SSR) 6 BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat 8

3.2 Prosedur Penelitian 8

3.2.1 Pengkoleksian Sampel 8

3.2.2 Pengamatan Morfologi 8

3.2.3 Isolasi DNA 9

3.2.4 Kuantifikasi DNA Menggunakan Elektroforesis 10 3.2.5 Kuantitatif DNA Menggunakan Nanofotometer 10

3.2.6 Analisis PCR 10

3.3 Analisis Data 12

3.3.1 Scoring Pita Polimorfik 12

3.3.2 Analisis Kekerabatan Genetik 12 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Koleksi Jeruk Keprok dari 3 Kabupaten di Sumatera Utara

13 4.2 Karakteristik Morfologi Jeruk Keprok 13 4.3 Hasil Isolasi DNA Total Jeruk Keprok Sumatera Utara 15 4.4 Amplifikasi DNA Genom Jeruk Keprok Sumatera

Utara dengan Primer SSR

16 4.5 Analisis Keragaman Genetik Jeruk Keprok Sumatera

Utara

17

(11)

vii

4.5.1 Keanekaragaman Genetik Jeruk Keprok Sipirok

18 4.5.2 Keanekaragaman Genetik Jeruk Keprok Maga 18 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan 21

5.2 Saran 21

DAFTAR PUSTAKA 22

LAMPIRAN 25

(12)

viii

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

3.1 Koleksi Jeruk Keprok dari 3 Kabupaten di Sumatera Utara 8

3.2 Reaksi Amplifikasi DNA Jeruk Keprok 11

3.3 Sekuen Primer SSR dan Suhu Annealing 11

4.1 Karakteristik Morfologi Jeruk Keprok Maga, Sipirok, dan Brastepu dari Sumatera Utara

13 4.2 Konsentrasi Dan Kemurnian DNA Genom Jeruk Keprok 16 4.3 Pita DNA Jeruk Keprok Berdasarkan 4 Primer SSR 17 4.4 Persentasi Kemiripan Genetik Jeruk Sipirok Berdasarkan

Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan 4 Penanda SSR

18 4.5 Persentasi Kemiripan Jeruk Keprok Maga Berdasarkan Hasil

Amplifikasi DNA Menggunakan 4 Penanda SSR

19

(13)

ix

DAFTAR GAMBAR

2.1 Morfologi Buah Jeruk Keprok 3

4.1 Hasil Elektroforesis DNA Total Jeruk Keprok Lokal Sumatera Utara

15 4.2 Profil SSR Dari 3 Jenis Keprok Dari 8 Lokasi Yang

Berbeda

17 4.3 Dendogram Hasil Pengelompokan 8 Koleksi Jeruk

Keprok Berdasarkan Hasil Amplifikasi DNA Dengan Menggunakan 4 Penanda SSR

20

(14)

x

DAFTAR LAMPIRAN

1 Bagan Protokol Ekstraksi 20

2 Gambar Jeruk Keprok Sumatera Utara 21

3 Hasil Scoring Pita Polimorfik Jeruk Keprok Sumatera Utara

22 4 Persentase Kemiripan Genetik Berdasarkan Hasil

Amplifikasi DNA Menggunakan 4 Penanda SSR

23

(15)

1

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tanaman jeruk merupakan tanaman buah tahunan yang berasal dari Asia.

Cina merupakan tempat pertama kali tanaman jeruk tumbuh (Ridjal, 2008). Jeruk digemari masyarakat baik sebagai buah segar maupun olahan. Sebagai komoditas yang bernilai ekonomi tinggi pengembangan jeruk perlu mendapat perhatian yang besar mengingat kontribusinya yang besar pada perekonomian nasional (Simatupang, 2009).

Spesies jeruk yang berbeda banyak tumbuh di lebih dari 50 negara di dunia, salah satunya yaitu Indonesia (Jannati et al., 2009). Tanaman jeruk mengalami perkembangan di Indonesia dalam pembudidayaan yang mencakup luas lahan dan jumlah produksi serta permintaan pasar (BALITJESTRO, 2011). Menurut Kantor Deputi Menegristek Bidang Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Ilmu Pengetahuan dan Tekhnologi MIG Corp. (2012), salah satu jenis jeruk lokal yang dibudidayakan di Indonesia adalah jeruk keprok (Citrus nobilis).

Provinsi Sumatera Utara termasuk daerah yang cukup baik untuk ditanami jeruk termasuk jeruk keprok (Citrus nobilis). Variasi dari jeruk keprok yang ada di Sumatera Utara diantaranya jeruk keprok Maga, jeruk keprok Sipirok, dan jeruk keprok Brastepu. Namun produksi jeruk keprok asal Sumatera Utara semakin hari semakin menurun hal ini ditunjukkan semakin susahnya menemukan jeruk-jeruk keprok ini dikalangan petani jeruk. Dengan demikian budidaya jeruk keprok asal Sumatera Utara sangat mendesak dilakukan agar jeruk-jeruk ini tidak punah. Jeruk keprok ini merupakan aset berharga dalam keanekaragaman hayati di Indonesia khususnya Sumatera Utara. Salah satu cara yang dilakukan yaitu dengan mendata keanekaragaman genetiknya.

Salah satu metode yang digunakan untuk analisis keanekaragaman genetik adalah menggunakan penanda Simple Sequence Repeat (SSR). Saat ini informasi keanekaragaman genetik jeruk keprok di Sumatera Utara dengan menggunakan penanda SSR belum ada. Untuk itu dilakukan analisis keanekaragaman genetik jeruk keprok asal Sumatera Utara dengan menggunakan penanda SSR. Menurut Jannati et

(16)

2

al. (2009), penanda Simple Sequence Repeat (SSR) atau dengan nama lain Mikrosatelit merupakan penanda dengan tingkat polimorfisme tinggi, kodominan, multiallelik, dan baik digunakan untuk penentuan keanekaragaman genetik.

Penggunaan beberapa penanda molekuler sudah banyak dilakukan untuk analisis keanekaragaman jeruk (Yulianti et al., 2010; Agisimanto et al., 2007; Jannati et al., 2009).

1.2 Permasalahan

Salah satu buah jeruk yang paling diminati dan diandalkan di Indonesia khususnya masyarakat di Sumatera Utara yaitu jeruk keprok. Di Sumatera Utara belum pernah dilakukan penelitian tentang keragaman jeruk keprok. Untuk itu dilakukan penelitian tentang analisis keragaman genetik jeruk keprok dari 3 kabupaten di Sumatera Utara. Salah satu satu metode yang digunakan untuk analisis keanekaragaman genetik adalah menggunakan penanda Simple Sequence Repeat (SSR). Untuk itu dilakukan analisis keanekaragaman genetik jeruk keprok di Sumatera Utara dengan menggunakan penanda SSR.

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk mengetahui keanekaragaman genetik jeruk keprok (Citrus nobilis) dari 3 kabupaten di Sumatera Utara dengan menggunakan marka Simple Sequence Repeat (SSR).

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bagi peneliti dan penulis tentang keanekaragaman genetik dari jeruk keprok di Sumatera Utara dengan menggunakan marker SSR sehingga dapat mengembangkan produktivitas dari jeruk lokal asal Sumatera Utara yang memiliki kualitas tinggi agar dapat menguasai pasar, dan bermanfaat bagi pemuliaan tanaman.

(17)

3

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jeruk Keprok (Citrus nobilis)

Indonesia merupakan daerah tropis yang banyak ditanami jeruk baik dataran rendah dan dataran tinggi. Beberapa variasi jeruk keprok telah menjadi tanaman unggulan daerah dan nasional seperti keprok SoE dari Nusa Tenggara Timur; Keprok Batu 55 dari Batu, Jawa Timur; Keprok Maga, Keprok Sipirok, Keprok Siompu, Keprok Cholkun, dan Keprok Brastepu dari Sumatera Utara; Keprok Tawangmangu dari Jawa Tengah; Keprok Garut dari Jawa Barat; Keprok Pulung dari Ponorogo;

Keprok Madura dari Madura.

Salah satu daerah di Indonesia yang saat ini sangat menggemari jeruk keprok adalah Sumatera Utara. Sementara itu, variasi jeruk keprok yang paling digemari dan sedang dibudidayakan diberbagai daerah di Sumatera Utara diantaranya Keprok Maga dari Mandailing Natal, Keprok Sipirok dari Tapanuli Selatan, dan Keprok Brastepu dari Brastagi. Biasanya, jeruk-jeruk ini diolah dan dimanfaatkan sebagai bahan minuman serta bahan baku obat tradisional.

2.2 Botani Jeruk Keprok

Menurut Endarto dan Endri (2016), ciri khas jeruk keprok adalah memiliki rongga antara kulit buah dengan daging buah yang membuatnya mudah dikupas (Gambar 2.1). Bila sudah matang, kulit buah berwarna oranye muda. Memiliki rasa yang manis, berair banyak dan bertekstur daging buah lunak. Permukaan buahnya halus. Memiliki rasa yang manis, berair banyak, dan bertekstur daging buah lunak.

Adanya aroma spesifik dari daun jeruk secara umum seperti jeruk keprok dan jeruk manis memiliki aroma daun jeruk secara umum sama dan sulit dibedakan sesama keprok dan manis (Martasari dan Mulyanto, 2008).

(18)

4

Gambar 2.1 Morfologi Buah Jeruk Keprok (Martasari dan Supriyanto, 2005) Buah yang sudah matang ada yang berwarna hijau muda, atau kuning orange.

Bobot buah jeruk keprok rata-rata mencapai 200 g/buah. Selain itu kulit buah juga mengkilat, licin, penuh pori-pori, dan sedikit berbau harum. Rasa ada yang manis, dan masam. Tiap ruang (juring buah) mengandung banyak biji. Biji berbentuk bulat telur terbalik dan mengkilat (Martasari dan Supriyanto, 2005).

Adapun syarat tumbuh dari jeruk keprok yaitu kebun jeruk tidak tertutup oleh genangan air. Kebun jeruk untuk lahan basah perlu dibuat drainase. Untuk daerah pasang surut dibuat baluran (bedengan) dengan ukuran tinggi 0,5 meter dan lebar 3 meter dan panjangnya menurut petakan lahan. Di areal sawah bias ditanami jeruk dengan cara membuat gundukan seluas 1 m² dengan tinggi 50 - 60 cm. pH tanah yang sesuai adalah 5 - 7,5 dan pH maksimum 6.

Daerah-daerah di dunia tempat tumbuh jeruk adalah daerah tropis dan subtropis, 35 derajat lintang selatan dan 35 derajat lintang utara. Curah hujan yang baik antara 1.270 mm - 1.900 mm per tahun. Selama musim kering selama tiga bulan curah hujan diharapkan tetap ada sekitar 100 mm. Kelembaban udara 70 - 80%. Air tanah: terdapat pada kedalaman 50 cm pada musim hujan dan 1,5 m pada musim kemarau.

Tanaman jeruk ditanam pada berbagai jenis tanah mulai dari tanah berpasir sampai tanah liat berat. Paling baik pada bekas endapan sungai. Tanaman jeruk memerlukan cukup air terutama bila mulai berbunga, tetapi tidak tahan genangan, oleh karena itu drainase harus baik. Sinar matahari sangat diperlukan untuk pertumbuhan jeruk sehingga jerukmanis yang ditanam di tempat terlindung

(19)

5

pertumbuhannya kurang baik danmudah terserang penyakit (Purnomosidhi et al., 2002).

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penanaman yaitu dengan membuang polibag dan memeriksa akar tanaman. Pemeriksaan akar tanaman dilakukan dengan cara menggunting akar yang busuk atau bengkok. Apabila akar tunggang bengkok melilit jangan ditanam. Pemeliharaan tanaman jeruk dilakukan dengan penyiangan gulma. Adapun tahapan dari penyiangan gulma yaitu pemangkasan, pemupukan, dan penyiraman (Endarto dan Endri, 2016).

2.3 Marka Molekular

Penanda molekul adalah penanda yang mengandalkan sifat-sifat aplikatif DNA atau cDNA. Jadi, penanda biokimia tidak termasuk di dalamnya meskipun sebenarnya juga merupakan molekul. Penanda molekul bersifat stabil karena DNA bersifat baka dan tidak terpengaruh lingkungan (Afifah, 2012). Teknik pemasaran molekuler mungkin langkah pertama menuju efisiensi konservasi, pemeliharaan, dan pemanfaatan pada perbedaan genetik jeruk manis. Ini digunakan lebih lanjut untuk analisis perbedaan genetik, gen pemetaan dan perbaikan utama dari tanaman di tingkat genetik (Sankar et al., 2014). Umumnya marka molekuler yang banyak digunakan saat ini adalah yang berbasis PCR (Lukman et al., 2013).

Teknologi pemuliaan dengan bantuan marka molekuler mempunyai kelebihan dibandingkan dengan pemuliaan konvensional antara lain: (1) Teknologi marka molekuler dapat meningkatkan reliabilitas. Hasil seleksi pemuliaan konvensional berdasarkan fenotipe dipengaruhi oleh lingkungan dan interaksi antar alel. Dengan marka molekuler, efek lingkungan, pleiotropi, dan epistatis dapat dihindari, (2) Dengan marka molekuler, seleksi dapat dilakukan pada saat tanaman masih kecil sehingga sangat membantu terutama jika sifat yang diinginkan hanya dapat dilihat apabila tanaman sudah dalam fase generatif, (3) Teknologi marka molekuler dapat mendeteksi hasil persilangan yang linkage drag (sifat yang tidak di Kontribusi inginkan sangat dekat dan terkait erat dengan sifat yang diinginkan). Dengan pemuliaan konvensional, dalam satu kali persilangan akan membawa ribuan gen.

Namun dengan teknologi marka molekuler, seleksi dapat dilakukan lebih selektif sehingga cepat diketahui hasil persilangan dengan gen-gen pembawa sifat yang

(20)

6

diinginkan saja, (4) Teknologi marka molekuler dapat membedakan hasil persilangan antara yang homozigot dan heterozigot, (5) Dengan teknologi marka molekuler dapat dilakukan pyramiding resistance dengan tepat dan cepat, karena introgresi masing- masing gen pada hasil persilangan dapat ditelusuri (Peleman dan van der Voort, 2003; Edward dan McCouch, 2007 dalam Bahagiawati, 2012).

Menurut Weising et al. (1995) dalam Kurniasih et al. (2011), penggunaan marka molekuler memiliki beberapa keuntungan dalam membantu pemuliaan, karena dapat digunakan untuk: (1) analisis pautan dan pemetaan genetik, (2) identifikasi genotip, (3) menduga keragaman genetik dan kekerabatan inter dan intra spesies atau varietas dan membantu menjelaskan filogenetiknya.

Menurut Bangun (2007) dan Lestari et al. (2012), pada era sekarang metode untuk identifikasi varietas berdasarkan polimorfisme DNA atau sidik jari DNA telah dikembangkan seiring kemajuan ilmu biologi. Berbagai teknik molekuler yang telah dikembangkan antara lain adalah Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR), DNA Amplified Finger printing (DAF), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplification Fragment Length Polymorphism (AFLP), Sequence Tagged Microsatellites (STMS), Single Sequence Repeat (SSR), Sequence-Tagged Site (STS), Sequence Characterized Amplified Region (SCAR), dan Single Nucleotide Polymorphism (SNP) yang masing-masing mempunyai kelebihan dan kelemahan.

2.3.1 Penanda Simple Sequence Repeat (SSR)

Mikrosatelit atau Simple Sequence Repeat (SSR) merupakan marka berbasis Polymerase Chain Reaction (PCR) yang memerlukan primer (Millah et al., 2012).

SSR terdiri dari banyak variabel tanden berulang yang memiliki motif sequen sederhana, biasanya mono-, di-, tri-, atau tetranukleotida repeat, sangat berguna bagi beberapa jenis tanaman (Yadav et al., 2007). Marker ini bersifat kodominan, multiallelic, penanda genetik tingkat polimorfisme yang tinggi, tepat untuk studi keanekaragaman genetik (Jannati, 2009), hanya membutuhkan sedikit DNA (Kurniasih et al., 2011), frequently, didistribusikan merata pada seluruh genom, dan penanda yang paling diandalkan (Golein et al., 2005). SSR merupakan alat bantu yang sangat akurat untuk membedakan genotipe, evaluasi kemurnian benih,

(21)

7

pemetaan, dan seleksi genotip untuk karakter yang diinginkan (Prasetiyono dan Tasliah, 2004) dalam Afifah (2012).

Ada beberapa permasalahan dalam penggunaan penanda mikrosatelit.

Permasalahan ini dapat dikelompokkan kedalam problem praktek dan problem data.

Problem praktek meliputi: (1) pemilihan primer untuk mikrosatelit, banyak jenis primer yang telah didisain untuk analisis mikrosatelit pada tanaman. Primer-primer itu perlu di-screening dan dioptimasi sebelum diaplikasikan pada jenis tanaman tertentu, karena setiap tanaman mempunyai karakteristik spesifik yang berbeda satu sama lain. (2) Slippage selama proses amplifikasi, termopolimerase dapat slip sehingga menghasilkan produk yang berbeda dalam ukurannya. (3) ukuran produk amplifikasi berbeda dari ukuran produk sebenarnya. Ketidak akuratan dalam identifikasi alel mungkin juga disebabkan oleh Taq polimerase yang menambah nukleotida adenosin sampai ujung 3’ produk amplifikasi (Zulfahmi, 2013).

Simple Sequence Repeat (SSR) yang dikenal juga mikrosatelit tersusun atas dua sampai enam DNA seperti (AT)n, (AGC)n, atau (GACA)n tersebar pada genom makhluk hidup eukariotik (Kurniasih et al., 2011). Marker SSR sangat banyak digunakan saat ini untuk penelitian yaitu mengidentifikasi kemurnian genetik bibit jagung hibrida (Hipi et al., 2013), utilitas seluruh genus Poenix (Billotte et al., 2004), identifikasi Vaccinium dari EST dan perpustakaan genomik (Boches et al., 2005).

(22)

8

BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2016 sampai dengan November 2017 di Laboratorium Genetika, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.2 Prosedur Penelitian 3.2.1 Pengkoleksian Sampel

Daun tanaman jeruk keprok dikoleksi dari 3 kabupaten di Sumatera Utara yaitu kabupaten Karo, kabupaten Mandailing Natal, dan kabupaten Tapanuli Selatan yang merupakan daerah pembudidayaan tanaman jeruk keprok. Jeruk keprok yang di koleksi adalah jeruk keprok Maga, jeruk keprok Sipirok, dan jeruk keprok Brastepu.

Tabel 3.1 Koleksi jeruk keprok dari 3 kabupaten di Sumatera Utara

No. Jeruk Keprok Asal

1. KB Berastagi,

Kab. Karo

2. KM1 Desa Sibanggor Tonga,

Kab. Mandailing Natal

3. KM2 Desa Huta Namale,

4. KM3 Desa Huta Lombang,

5. KS1 Desa Banjar Tikus,

Kab. Tapanuli Selatan

6. KS2 Desa Baringin Siumuran,

7. KS3 Desa Aek Kambiri,

8. KS4 Desa Aek Horsik,

3.2.2 Pengamatan Morfologi

Sampel tanaman jeruk keprok yang dikoleksi dari 3 kabupaten di Sumatera Utara dilakukan pengamatan karakteristik morfologi dengan dicatat secara deskriptif.

(23)

9

Pengamatan morfologi jeruk keprok meliputi karakteristik daun (bentuk, ujung daun, tipe daun, warna, dan permukaan), batang (tipe permukaan dan warna), dan buah.

3.2.3 Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode Cetylmethyl ammonium bromide (CTAB) (Doyle dan Doyle, 1987) yang telah dimodifikasi oleh Santoso (2005). Daun jeruk yang telah dikoleksi ditimbang sebanyak 1g tanpa tulang daun digerus dalam mortar pestel yang telah ditambahkan 500 µL buffer ekstraksi CTAB 3% (CTAB: 4,1 g NaCl, 10 g CTAB, 0,5 M EDTA pH 8,0, 1M Tris-HCl pH 8,0, 1,40 M NaCl, 29,22 g sodium klorida, 3% PVP dan 0,30% ß-mercapto etanol) dan PVP 0,01 g hingga menjadi bubur halus. Bubur halus dipindahkan ke dalam tabung sentrifus ukuran 1,5 mL.

Proses lisis dinding sel dilakukan dengan menginkubasi tabung berisi sampel ke dalam water bath suhu 65°C selama 60 menit dan dibolak balik setiap 10 menit.

Tabung didinginkan pada suhu ruang ± 5 menit dan ditambahkan khloroform:

isoamil-alkohol (CIA 24:1) 500 μL. Tabung di vortex mixer dan disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan 600-800 μL CIA 24:1, dan disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Langkah ini diulang sampai tidak ada lapisan putih antara supernatant dan CIA 24:1.

Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan ditambah 500 μL isopropanol dingin dan 1/10 sodium asetat dari stok supernatan. Tabung dibolak-balik secara hati-hati untuk melarutkan supernatan. Tabung berisi sampel lalu disimpan pada suhu -20°C selama over night dan disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.

Fase cair lalu ditumpahkan dengan meletakkan tabung dengan posisi terbalik di atas kertas tisu sampai pelet DNA mengering. Proses ini dilakukan dengan hati-hati dan dipastikan pellet DNA masih melekat pada dasar tabung.

Stok DNA dicuci dengan alkohol 70% sebanyak 100 μL selanjutnya DNA dikeringkan dan dilarutkan dengan 50 μL buffer TE. RNA dihilangkan dengan RNA- se sebanyak 5 µL diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1 jam dan dinonaktifkan pada suhu 70 ºC selama 3 menit, selanjutnya DNA disimpan pada suhu -20 ºC.

(24)

10

3.2.4 Kuantifikasi DNA Menggunakan Elektroforesis

Kualitas DNA dilihat dengan elektroforesis pada agarose gel 0,8%.

Prosesnya, 2 μL stok DNA dicampur dengan 8 μL air suling dan 2 μL loading dye.

Campuran sampel, dimasukkan ke dalam sumur gel alat elektroforesis yang telah diisi buffer TAE 1x (Tris free base, Glacial Acetic Acid, dan 0,5 M EDTA pH 8,0).

Sebagai pembanding digunakan DNA ladder pada sumur pertama, elektroforesis dijalankan pada tegangan 70 volts selama 1 jam sampai DNA bermigrasi/bergerak lebih kurang 1 cm di atas batas bawah.

3.2.5 Kuantitatif DNA Menggunakan Nanofotometer

Untuk uji kuantitas DNA menggunakan nanofotometer dengan panjang gelombang 260 nm. Stok DNA dihitung kemurniannya dengan perbandingan absorbansi 260/280. Kalibrasi nanofotometer dilakukan untuk setiap pengukuran sampel yang berbeda. Sebanyak 2 µL ddH2O diteteskan di atas kuvet nanofotometer ditutup dengan Lid dan ditekan tombol blank. Kemudian 1 µL DNA sampel diteteskan di atas kuvet ditutup dengan Lid dan ditekan tombol sampel. Dicatat nilai kemurnian dan konsentrasi DNA yang didapat.

Mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut : [DNA] = Å260 x 50 x Faktor pengenceran Keterangan :

Å260 = nilai absorbansi pada 260 nm

50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per ml (dsDNA)

3.2.6 Analisis PCR-SSR

Reaksi amplifikasi pada mesin PCR (Tabel 3.2) yang dilakukan menggunakan 12.5 µL 2X Dream Taq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific), 1µL forward primer, 1 µL reverse primer, dan 2 µL dari templat DNA, dan 8,5 µL air bebas nuklease. Primer yang digunakan seperti pada Tabel 3.3. Program PCR di set dengan suhu predenaturasi 94ôC selama 5 menit, diikuti oleh 32 siklus yang terdiri dari tiga tahap yaitu denaturasi 94 ôC selama 1 menit, tahap berikutnya penempelan (annealing) pada suhu yang dioptimasi sesuai masing-masing primer selama 30 detik, kemudian tahap pemanjangan (elongasi) dengan suhu 72 ôC selama

(25)

11

1 menit, diakhiri dengan tahapan pemanjangan akhir suhu 72 ^oC selama 4 menit (Golein et al., 2005).

Tabel 3.2 Campuran reaksi amplifikasi DNA Jeruk Keprok

No. Bahan Reaksi Konsentrasi (mM) Volume (µL)

1. PCR mix Go Taq Green - 12,5

2. Primer Reverse 10 1

3. Primer Forward 10 1

4. DNA template - 2

5. RNAse free water - 8,5

Total Volume 25

Tabel 3.3 Sekuen Primer Simple Sequence Repeat (SSR) dan suhu annealing No. Nama

Primer

Sekuen Primer (Forward/Reverse) Suhu Annealing (TM) ºC

Referensi

1. TAA15 F: GAAAGGGTTACTTGACCAGGC

R: CTTCCCAGCTGCACAAGC

61,3 58,4

Jannati et al., 2009 dan Olein et al., 2005.

2. TAA27 F: GGATGAAAAATGCTCAAAATG

R: TAGTACCCACAGGGAAGAGAGC

53,5 64,0

Jannati et al., 2009 dan Hussein et al., 2003.

3. TAA41 F: AATGCTGAAGATAATCCGCG

R: TGCCTTGCTCTCCACTCC

56,4 58,4

4. CAC23 F: ATCACAATTACTAGCAGCGCC

R: TTGCCATTGTAGCATGTTGG

59,4 56,4

Selanjutnya hasil PCR dielektroforesis menggunakan agarosa 1.5% dengan pengaturan arus listrik 70 V selama 1 jam dalam buffer TAE 1x (pH 8), gel dibilas dengan aquades selama 2 menit, pewarnaan (staining) gel agarosa menggunakan 10 µL/L etidium bromide selama 10 menit, dan direndam aquades selama 5 menit.

Kemudian pita hasil amplifikasi dapat diamati menggunakan UV Transiluminator (G:BOX Syngene). Hasil pita dibandingkan dengan 100 bp DNA ladder.

Polimorfisme pada seluruh lokus dikonfirmasi dengan melakukan tiga pengulangan pada setiap primer.

(26)

12

3.3 Analisis Data

3.3.1 Scoring Pita Polimorfik

Scoring pita pada gel profil SSR dilakukan secara manual, dengan ketentuan penilaian 1 (satu) dan 0 (nol). Angka 1 (satu) diberikan jika ada pita, dan 0 (nol) jika tidak ada ditemukan.

3.3.2 Analisis Kekerabatan Genetik

Estimasi kekerabatan didasarkan atas jumlah kesamaan pita yang teramplifikasi akan dianalisis dengan perangkat lunak Numerical Taxonomy And Multivariate Analysis System (NTSys). Hasil analisis disajikan dalam bentuk dendrogram menggunakan metode Unweighted Pair-Group With Arithme Average (UPGMA).

(27)

13

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil penelitian meliputi karakteristik morfologi dan analisis molekuler jeruk keprok dari 3 kabupaten di Sumatera Utara adalah sebagai berikut.

4.1 Hasil Koleksi Jeruk Keprok dari 3 Kabupaten di Sumatera Utara

Penelitian tentang keanekaragaman genetik jeruk keprok di Sumatera Utara telah berhasil mengkoleksi jeruk keprok dari 3 kabupaten di Sumatera utara, yaitu 4 jeruk keprok Sipirok, 3 jeruk keprok Maga dan 1 jeruk keprok Brastepu. Koleksi jeruk keprok yang sedikit akibat tanaman sudah tua dan banyak yang mati, sehingga jarang ditemukan di daerah penduduk. Pada tanaman jeruk keprok Brastepu sangat sulit ditemukan di Kabupaten Karo, hal ini disebabkan masyarakat lebih memilih bercocok tanam sayuran dibandingkan jeruk keprok yang banyak terserang penyakit sehingga berdampak pada nilai produktifitas yang semakin menurun.

4.2 Karakteristik Morfologi Jeruk Keprok

Gambar tanaman jeruk keprok (Lampiran 2) dan deskripsi morfologi dari jeruk keprok Sumatera Utara terdapat pada Tabel 4.1. Berdasarkan Tabel 4.1 ciri morfologi dari 3 koleksi jeruk keprok Sumatera Utara. Daun, buah, dan batang pada 3 koleksi jeruk keprok memiliki beberapa perbedaan. Jeruk keprok maga memiliki daun dengan bentuk bulat telur (ovate) sedangkan pada jeruk keprok sipirok dan brastepu memiliki bentuk lanset (lanceolat) bagian terlebar disekitar pangkal dan menyempit diujung daun. Jeruk keprok Sipirok memiliki kulit buah berpori-pori nyata sedangkan jeruk keprok maga dan brastepu memiliki permukaan kulit buah licin. Pada ketinggian batang, jeruk keprok memiliki tinggi yang berbeda-beda. Jeruk keprok maga memiliki tinggi batang sekitar 6-8 meter, jeruk keprok sipirok memiliki tinggi batang sekitar 3-8 meter sedangkan jeruk keprok brastepu memiliki tinggi batang sekitar 2-8 meter.

(28)

14

Tabel 4.1 Karakteristik Morfologi Jeruk Keprok Maga, Sipirok, dan Brastepu dari Sumatera Utara

Jeruk Keprok

Ciri-ciri Morfologi

Daun Buah Batang

Maga

Margin tipe repandus, bentuk bulat telur (ovate), ujung runcing/tajam (acutus), tidak bersayap, permukaan licin, warna bagian atas hijau tua dan bawah hijau muda (pucat).

Bentuk bulat gepeng, puncak ujung berlekuk, pangkal berleher pendek, warna buah matang kuning orange, dan kulit buah licin (mengkilat).

Tinggi 6-8 m, memiliki duri, percabangan banyak, dan kecil-kecil.

Sipirok

Margin tipe repandus, lanceolat (tombak) ujung runcing/lancip (acutus), sayap daun tidak ada, permukaan licin, warna bagian atas hijau tua, bagian bawah hijau muda, dan kedudukan daun mendatar.

Bentuk bulat gepeng, warna kuning sampe orange, kulit berpori- pori nyata, dan ujung buah datar sampai berlekuk.

Brastepu

Margin tipe repandus, bentuk lanceolat (tombak) ujung runcing/lancip (acutus), permukaan licin, bagian atas daun warna hijau, dan bawah hijau muda.

Memiliki kulit berpori-pori nyata, bentuk bulat gepeng, warna kuning orange dan permukaan licin.

Menurut Martasari dan Supriyanto (2005), karakteristik umum yang dimiliki oleh jeruk keprok yaitu: berbatang rendah, tinggi 2-8 m. Tanaman ini ada yang berduri ada yang tidak. Dahan kecil, cabangnya banyak, dan tajuknya rindang. Letak dahan berpencar. Daun jeruk keprok berukuran kecil, berbentuk tunggal, dan bertangkai pendek. Warna permukaan atas daun hijau tua, dan permukaan bawah daun hijau muda.

Menurut Hardianto et al. (2007), sifat morfologi tidak semuanya dapat dijadikan sebagai karakter yang mantap untuk membedakan suatu kelompok dengan yang lain. Sebab ada sifat-sifat dari tanaman yang sangat dipengaruhi oleh perubahan lingkungan (nutrisi, suhu, kelembapan, dan iklim).

(29)

15

4.3 Hasil Isolasi DNA Total Jeruk Keprok Sumatera Utara.

Hasil isolasi DNA total 8 koleksi jeruk keprok dielektroforesis pada gel agarose 0,8 % (Gambar 4.1). Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui kualitas DNA yang diperoleh dari proses isolasi sehingga dapat digunakan untuk analisis berikutnya yaitu amplifikasi DNA total dengan PCR.

Gambar 4.1 Hasil elektroforesis DNA total Jeruk Keprok lokal Sumatera Utara. M (Marker 1 kb), KB (Keprok Brastepu), KM (Keprok Maga), KS (Keprok Sipirok).

Hasil elektroforesis DNA genom dari 8 koleksi jeruk keprok menunjukkan hasil pita yang utuh tanpa smear. Hal ini menunjukkan pita DNA yang dihasilkan terbebas dari kontaminan seperti protein, polisakarida, lemak dan lain sebagainya.

Daun jeruk yang diisolasi memiliki ukuran pita DNA diatas 1 kb dan digunakan untuk tahapan selanjutnya. Ukuran DNA genom 1 kb sangat cocok digunakan untuk tahap PCR karena ukuran DNA target yaitu sekitar ≥100 bp sedangkan pita dibawah dari 100 bp merupakan RNA yang dianggap sebagai kontaminan yang mengganggu proses amplifikasi. Menurut Ibrahim (2011), uji elektroforesis akan menunjukkan berat molekul dari yang besar (tinggi) ke rendah dari DNA genom. Jika DNA genom terisolasi dengan baik maka menunjukkan berat molekul yang besar (tinggi).

Hasil isolasi selanjutnya dilakukan pengukuran secara kuantitatif dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 260/280 nm. Pada Tabel 4.2 menunjukkan konsentrasi yang dihasilkan berkisar antara 264-835 ng/µL. Konsetrasi tertinggi pada koleksi KS1 yaitu 835 ng/µL, sedangkan konsentrasi terendah pada koleksi KM1 yaitu 264 ng/µL. Konsentrasi yang dihasilkan digunakan untuk analisis PCR dan menghasilkan pita yang bagus. Sedangkan kemurnian pada jeruk keprok berkisar antara 1,775-1,986. Kemurnian terendah pada koleksi KS2 yaitu 1,775 dan kemurnian tertinggi pada koleksi KM2 yaitu 1,986. Menurut Jorgez et al. (2006), kemurnian DNA yang bagus diharapkan dari panjang gelombang 260/280 berkisar antara 1,82,0. Tinggi atau rendahnya nilai kemurnian dari DNA sampel ditentukan

(30)

16

adanya polisakarida dan kontaminan lainnya. Namun nilai kemurnian 1,7 dapat digunakan untuk uji amplifikasi (PCR) dan menghasilkan pita yang bersih tanpa smear. Menurut Langga et al. (2012), tingkat kemurnian tersebut sudah memenuhi persyaratan yang dibutuhkan dalam analisis molekuler karena mendekati nilai kemurnian yang tinggi dan DNA yang dihasilkan cukup bersih.

Tabel 4.2 Konsentrasi Dan Kemurnian DNA Genom Jeruk Keprok

No. Nama Sampel Kemurnian Konsentrasi

(ng/µL)

1. KB 1,886 368

2. KM1 1,986 264

3. KM2 1,792 345

4. KM3 1,786 710

5. KS1 1,785 835

6. KS2 1,775 750

7. KS3 1,808 368

8. KS4 1,832 340

4.4 Amplifikasi DNA Genom Jeruk Keprok Sumatera Utara dengan Primer SSR.

Hasil visualisasi dari amplifikasi DNA genom dari jeruk keprok dapat dilihat pada Gambar 4.2 elektroferogram menunjukkan bahwa 4 primer berhasil mengamplifikasi DNA genom dengan jumlah pita rata-rata 2 pita dan DNA ladder yang digunakan yaitu 100 bp. Pita-pita yang dihasilkan pada primer TAA15 berdasarkan DNA ladder berukuran 300 bp, 250 bp dan 100 bp, primer TAA27 berdasarkan DNA ladder berukuran 200 bp, 150 bp dan 100 bp, primer TAA41 berdasarkan DNA ladder berukuran 200 bp, 150 bp, dan 100 bp, sedangkan primer CAC23 berdasarkan DNA ladder berukuran 200 bp dan 100 bp.

(31)

17

A B

C D

Gambar 4.2 Profil SSR dari 3 jenis keprok dari 8 lokasi yang berbeda menggunakan marker (M) 100 bp dan 4 primer yaitu (A) TAA15, (B) TAA27, (C) TAA41, dan (D) CAC23.

Hasil amplifikasi 4 primer SSR pada 8 koleksi jeruk keprok menghasilkan 49 pita DNA, masing-masing primer SSR memiliki 10-15 pita. Pita yang paling banyak muncul rata-rata 1 pita (monomorfik) yaitu pada primer TAA15 dan CAC23. Pita yang muncul akan menunjukkan suatu karakter atau ciri pada suatu koleksi. Primer TAA27 memiliki jumlah pita terbanyak yaitu 15 pita. Primer dengan jumlah pita terendah sebanyak 10 pita, yaitu CAC23. Pada lokus polimorfis yang memiliki pita terendah 4 pita, yaitu CAC23 dan pita terbanyak 14 pita yaitu TAA27. Menurut Langga et al. (2012), intensitas pita DNA hasil amplifikasi oleh setiap primer sangat dipengaruhi oleh kemurnian dan konsentrasi DNA cetak.

Tabel 4.3 Pita DNA Jeruk Keprok berdasarkan 4 Primer SSR.

No. Nama Primer Total Pita Lokus Polimorfis Lokus Monomorfis

1 TAA15 11 5 6

2 TAA27 15 14 1

3 TAA41 13 8 5

4 CAC23 10 4 6

49 31 18

4.5 Analisis Keanekaragaman Genetik Jeruk Keprok Sumatera Utara

Hasil analisis kenekaragaman genetik dibahas berdasarkan sesama variasi dari masing-masing 8 koleksi jeruk keprok di Sumatera Utara sebagai berikut:

(32)

18

4.5.1 Keanekaragaman Genetik Jeruk Keprok Sipirok

Hasil amplifikasi 4 koleksi tanaman jeruk keprok sipirok dengan 4 primer menghasilkan 20 pita. Nilai koefisien kemiripan disajikan dalam bentuk persentase kemiripan genetik (Tabel 4.4) dan dendogram (Gambar 4.3)

Tabel 4.4 Persentase Kemiripan Genetik Jeruk Keprok Sipirok Berdasarkan Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan 4 Penanda SSR.

KS1 KS2 KS3 KS4

KS1 100%

KS2 80% 100%

KS3 72% 89% 100%

KS4 72% 89% 100% 100%

Dari Tabel 4.4 terdapat persentase kemiripan dari jeruk keprok Sipirok untuk menentukan hubungan kesamaan genetik antar individu dalam 4 koleksi jeruk keprok Sipirok. Kemiripan terbesar terdapat pada koleksi KS3 dengan koleksi KS4 yaitu 100%. Hal ini menunjukkan bahwa secara genetik merupakan kembar identik.

Sedangkan persentase kemiripan terendah pada koleksi KS1dengan koleksi KS4 dan KS3 yaitu sebesar 72%.

4.5.2 Keanekaragaman Jeruk Keprok Maga

Hasil amplifikasi 3 koleksi jeruk keprok maga menghasilkan 20 pita DNA.

Berdasarkan Tabel 4.5 jarak genetik terendah memiliki nilai kemiripan 100% yang ditemukan pada koleksi KM2 dengan koleksi KM3. Sedangkan jarak genetik tertinggi terdapat pada koleksi KM1 dengan koleksi KM2 dan koleksi KM3 yaitu 67%. Koleksi KM1, KM2, dan KM3 terletak di daerah yang sama yaitu Kabupaten Mandailing Natal namun koleksi KM1 dengan KM2, dan KM3 memiliki jarak genetik yang jauh. Hal ini dikarenakan pada daerah tersebut masyarakat setempat sudah sering melakukan teknik okulasi. Sesuai dengan pernyataan Nurwahyuni et al.

(2012), bahwa pada umumnya jeruk melakukan penyerbukan sendiri tetapi masyarakat sering melakukan teknik okulasi untuk perbanyakan dan pembudidayaan tanaman jeruk yang menghasilkan tanaman berkualitas yang sama dengan induknya.

Akan tetapi teknik tersebut dapat mempengaruhi tingkat keragaman genetik tanaman jeruk keprok di Sumatera Utara.

(33)

19

Tabel 4.5 Persentase Kemiripan Genetik Jeruk Keprok Maga Berdasarkan Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan 4 Penanda SSR.

KM1 KM2 KM3

KM1 100%

KM2 67% 100%

KM3 67% 100% 100%

Dari hasil pengelompokan dengan menggunakan software NTSys, menunjukkan 8 koleksi jeruk mengelompok pada nilai koefisien kemiripan 0.63.

Semakin tinggi nilai koefisien kemiripan suatu tanaman maka semakin bereda dengan tetuanya, sedangkan semakin rendah nilai koefisien kemiripan suatu tanaman maka semakin mirip dengan tetuanya. Terdapat 3 kelompok dari 8 koleksi jeruk keprok yang mengelompok secara acak. Pada kelompok 1 terdiri dari koleksi Brastepu (KB) dan Sibanggor Tonga (KM1) yang berasal dari kabupaten Karo (Berastagi) dan Kabupaten Mandailing Natal. Kelompok 2 berjumlah 5 koleksi yang diisi oleh 2 kabupaten yaitu Kabupaten Mandailing Natal terdiri dari Huta Namale (KM2) dan Huta Lombang (KM3), dan Kabupaten Tapanuli Tengah terdiri dari koleksi Aek Kambiri (KS3), Aek Horsik (KS4), dan Baringin Siumuran (KS2).

Kelompok 3 hanya diduduki oleh koleksi Banjar Tikus (KS1) yang berasal dari Kabupaten Tapanuli Tengah.

Gambar 4.3 Dendogram hasil pengelompokan 8 koleksi jeruk keprok berdasarkan hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan 4 primer SSR.

84%

89%

74%

(34)

20

Delapan individu dari setiap jeruk keprok mengelompok ke dalam populasi yang berbeda. Kemiripan genetik dalam populasi yang tertinggi ialah pada populasi jeruk keprok maga dimana terdapat individu Huta Namale, Huta lombang dan jeruk keprok Sipirok terdapat individu Aek kambiri, Aek Horsik dengan nilai koefisien kemiripan 100% (1,0) dan berada dalam kelompok yang sama, oleh karena itu anggota-anggota dalam populasi jeruk keprok Maga dan Sipirok tersebut membawa sifat dan karakter genetik yang sama. Menurut Hidayat dan Pancoro (2008), organisme yang berada dalam satu kelompok mempunyai anggota-anggota yang memiliki banyak kesamaan karakter atau ciri serta hubungan yang sangat dekat dan diperkirakan diturunkan dari satu nenek moyang. Kemiripan genetik terendah pada populasi jeruk keprok Maga terdapat koleksi Huta Namale, Huta Lombang dan populasi jeruk keprok Sipirok terdapat koleksi Aek Kambiri, Aek Horsik, Baringin Siumuran, Banjar Tikus dengan nilai koefisien kemiripan 74% (0,74). Jeruk keprok Brastepu dan jeruk keprok Maga Sibanggor Tonga memiliki nilai koefisien kemiripan genetik sebesar 84% (0,84). Nilai koefisien 74%, 84%, dan 89% memiliki anggota-anggota yang mengalami beberapa perubahan karakter dari nenek moyang dan diturunkan. Masyarakat yang bertanam jeruk keprok di Sumatera Utara sudah melalukan sistem tempel tunas (okulasi) dengan batang tanaman jeruk lainnya sehingga menyebabkan perubahan karakter. Sekarang ini, masyarakat lebih memilih bibit tanaman jeruk keprok yang sudah ditempel (okulasi) dengan tanaman jeruk lainnya yang tahan terhadap hama atau penyakit. Menurut Agisimanto et al. (2007), fenomena distribusi bibit jeruk yang bervariasi telah ikut memicu munculnya keragaman jeruk baru dibeberapa lokasi. Hal ini mungkin respon genetik terhadap perubahan dan daya adaptasi jeruk. Seringnya petani menyeleksi mata tunas dari pohon yang baik dan menjadikannya menjadi bibit kemungkinan berpengaruh besar terhadap kemunculan keragaman baru. Untuk itu, perubahan karakter atau sifat pada jeruk keprok berpengaruh terhadap rendahnya nilai koefisien keragaman genetik dari jeruk keprok tersebut.

(35)

22

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari hasil peneitian ini diperoleh kesimpulan sebagai berikut

a. Hasil analisis 8 sampel jeruk keprok dari 3 kabupaten di Sumater Utara dengan 4 primer adalah total pita 48 (100 bp-300 bp), pita polimorfik 30, dan pita monomorfik 18. Pita polimorfik tertinggi diperoleh pada primer TAA41 sebanyak 14 pita DNA dan terendah sebanyak 4 pita DNA pada primer CAC23.

b. Seluruh koleksi jeruk keprok mengelompok pada nilai koefisien kemiripan 0,63 (63%). Pada koefisien kemiripan 0,74, koleksi jeruk keprok mengelompok menjadi 3 kelompok.

5.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian berlanjut dengan menggunakan lebih banyak primer dan membandingkan dengan jeruk keprok yang ada di daerah lain seperti jeruk keprok Batu 55 dan lainnya guna membantu pemuliaan tanaman jeruk keprok di Indonesia.

(36)

22

DAFTAR PUSTAKA

Afifah EN, 2012. Penggunaan Penanda Molekuler Untuk Mempercepat Dan Mempermudah Perbaikan Kualitas Tanaman Teh (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze). Makalah Seminar Budidaya Pertanian. Yogyakarta:

Universitas Gadjah Mada.

Agisimanto D, Martasari C dan Supriyanto A, 2007. Perbedaan Primer RAPD Dan ISSR dalam Identifikasi Hubungan Kekerabatan Genetik Jeruk Siam (Citrus suhuniensis L. Tan.) Indonesia. Jurnal Hort. 17(2):101-110.

[Anonim], 2011. [BALITJESTRO] Budidaya Jeruk Bebas Penyakit.

http://kaltim.litbang.deptan.go.id. [ 23 Feb 2016].

Bahagiawati, 2012. Kontribusi Teknologi Marka Molekuler dalam Pengendalian Wereng Coklat. Pengembangan Inovasi Pertanian. 5(1):1-8.

Bangun IIS, 2007. Marka Molekuler. Ilmu dan Budaya. 27(4).

Billotte N, Marseillac N, Brottier P, Noyer L, Collet JPJ, Moreaut C, Couvreur T, Chevalleier H, Pintaud C, 2004. Nuclear Microsatellite Markers for the Date Palm (Phoenix dactylifera L.): Characterization and Utility Across the Genus Phoenix and In Other Palm Genera. Molecular Ecology Notes.

(4):256-258.

Boches SP, Bassil VN, and Rowland J, 2005. Microsatellite Markers For Vaccinium From EST and Genomic Libraries. Molekular Ecology Notes.

(5):657-660.

Chaerani, Utami WD, Hidayatun N, Abdullah B, dan Suprihatno B, 2014.

Asosiasi Antara Marka SSR dengan Ketahanan Terhadap Wereng Batang Coklat pada Varietas dan Calon Galur Harapan Padi. Jurnal Entomologi Indonesia. 11(1):43-52.

Endarto O, dan Endri M, 2016. Pedoman Budidaya Jeruk Sehat. Bogor, Indonesia: World Agroforestry Centre (ICRAF) Southeast Asia Regional Program. Hal: 1-100.

Golein B, Talaie A, Zamani Z, Ebadi A, and Behjatnia A, 2005. Assessment of Genetic Variability in Some Iranian Sweet Oranges (Citrus sinensis [L.]

Osbeck) and Mandarins (Citrus reticulate Blanco) Using SSR Markers.

International Journal of Agriculture and Biology. 7(2):167-170.

Handoyo D, dan Ari R, 2001. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polimerase Chain Reaction (PCR). Unitas. 9(1):17-29.

Hardiyanto, Mujiarto E, dan Sulasmi SE, 2007. Kekerabatan Genetik Beberapa Spesies Jeruk Berdasarkan Taksonometri. Jurnal Hotr. 17(3):203-216.

Hariyati T, Kusnadi J, Arumingtyas EL, 2013. Genetic Diversity of Hybrid Durian Resulted from Cross Breeding Between Durio Kutejensis and Durio zibethinus Based on Random Amplified Polymorphic DNAs (RAPD). American Journal of Molecular Biology. 3: 153-157.

Hidayat T, dan Pancoro A, 2008. Kajian Filogenetik Molekuler Dan Peranannya Dalam Menyediakan Informasi Dasar Untuk Meningkatkan Kualitas Sumber Genetik Anggrek. Jurnal Agrobiogen. 4(1):35-40.

Hipi A, Surahman, Ilyas MS, dan Giyanto, 2013. Seed Genetic Purity Assessment of Maize Hybrid Using Microsatellite Markers (SSR). International Journal of Applied Science and Technology. 3(5):66-71.

(37)

23

Jannati M, Fotouhi R, Abad PA, and Saleh Z, 2009. Genetic Diversity Analysis of Iranian Citrus Varieties Using Microsatellite (SSR) Based Markers.

Journal of Horticulture and Forestry. 1(7):120-125.

Jorgez JC, Dang DD, Simpson LJ, Lewis ED, and Bischoff ZF, 2006. Quantity Versus Quality: Optimal Methods For Cell-Free DNA Isolation From Plasma Of Pregnant Women. Genetic In Medicine. 8(10):615-619.

[Anonim], 2012. Kantor Deputi Menegastek Bidang Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi MIG Corp.

Kurniasih S, Rubiyo, Setiawan A, Purwantara A, dan Sudarsono, 2011. Analisis Keragaman Genetik Plasma Nutfah Kakao (Theobroma cacao L.) Berdasarkan Marka SSR. Jurnal Littri. 17(4):156-162.

Golein B, Talaie A, Zamani Z, Ebadi A, and Behjatnia A, 2005. Assessment Of Genetic Variability In Some Iranian Sweet Orange (Citrus sinensis [L.]

Osbeck) and Mandarins (Citrus reticulata Blanco) Using SSR Markers.

International Journal Of Agriculture and Bology. 7(2):167-170.

Langga FI, Restu M, dan Kuswinanti T, 2012. Optimalisasi Suhu Dan Lama Inkubasi Dalam Ekstraksi Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reinw) Serta Analisis Keragaman Genetik Dengan Teknik RAPD-PCR. Jurnal Sains dan Teknologi. 12(3):265-276.

Lestari P, Risliawati A, dan Koh JH, 2012. Identifikasi dan Aplikasi Marka Berbasis PCR Untuk Identifikasi Varietas Padi dengan Palatabilitas Tinggi. Jurnal Agrobiogen. 8(2):69-77.

Lukman R, Afifuddin A, dan Hoerussalam, 2013. Pemanfaatan Teknologi Molekular Breeding dalam Pemuliaan Ketahanan Tanaman Terhadap Hama dan Penyakit. Jurnal Agroteknos. 2(3):101-108.

Martasari C, dan Mulyanto H, 2008. Teknik Identifikasi Varietas Jeruk. Iptek hortikultura. 4:6-12.

Martasari C, dan Supriyanto A, 2005. Jeruk Keprok Tropika Indonesia:

Keragaman Kultivar Dan Karakter, Sentral Produksi, Dan Teknologi Inovasi. Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia. Hl, 36-53.

Millah IM, Habibah AN, Suwarni E, dan Rertoningsih A, 2012. Analisis Keanekaragaman Genetika dan Diferensiasi Jati Jawa dan Madura Berdasarkan Marka Mikrosatelit Untuk Mendukung Fingerprinting Jati.

Biosaintifikasi. 4(2):113-120.

Nuraida D, 2012. Pemuliaan Tanaman Cepat dan Tepat Melalui Pendekatan Marka Molekuler. Pemuliaan Tanaman Cepat. 2(2):97-103.

Nurwahyuni I, 2013. Teknik In Vitro Jeruk Keprok Brastagi (Citrus nobilis Brastepu) Sebagai Strategi Biokonservasi Mengatasi Kepunahan Jeruk Lokal Sumatera Utara. Prosiding Seminata FMIPA Universitas Lampung.

Hl, 419-427.

Nurwahyuni I, Justin AN, Rosmayati, dan Fauziah H, 2012. Teknik Okulasi Jeruk Keprok Brastepu (Citrus nobilis Var. Brastepu) Untuk Menghasilkan Bibit Bebas Penyakit CVPD. Prosiding Semirata BKS-PTN B MIPA 2012- biologi. Universitas Negeri Medan. Hl, 594-599.

Pabendon BM, Dahlan M, Sutrisno, dan George CLM, 2006. Karakterisasi Kemiripan Genetik Koleksi Inbrida Jagung Berdasarkan Marka Mikrosatelit. Jurnal Agrobiogen. 2(2):45-51.

Pracaya, 2003. Jeruk Manis Varietas, Budidaya, dan Pascapanen. Jakarta:

Penebar Swadaya. Hl, 5-11.

(38)

24

Purnomosidhi P, Suparman, Roshetko, JM, dan Mulawarman, 2002. Perbanyakan dan Budidaya Tanaman Buah-Buahan dengan Penekanan pada Durian, Mangga, Jeruk, Melinjo, dan Sawo: Pedoman Lapangan. Bogor, Indonesia: International Centre for Research in Agroforestry (ICRAF) dan Winrock International. Hl, 1-32.

Putri PAL, HKM, Basyuni M, dan Setyo EI, 2013. Analisi Awal: Pemakaian Marka Molekuler RAPD Untuk Pendugaan Keragaman Genetik Plasma Nuftah Aren Sumatera Utara. Prosiding Seminar Nasional Agroforestri;

Medan. Hl, 705-707.

Ridjal AJ, 2008. Analisis Faktor Determinan Keikutsertaan Petani Berkelompok, Pendapatan dan Pemasaran Jeruk Siam di Kabupaten Jember. Journal SEP. 1(2):1-9.

Sankar GT, Gopi V, Deepa B, and Gopal K, 2014. Genetic Diversity Analysis of Sweet Orange (Citrus Sinensis osbeck) Varieties/Clones Through RAPD Markers. Int J.Curr. Microbial. App. Sci. 3(4):75-84.

Santoso PJ, Granitia A, Indriyani NLP, Pancoro A, 2016. Analisis Lokus dan Keragaman Sumberdaya Genetik Durian (Durio sp.) Berdasarkan Marka Mikrosatelit. Jurnal Hortikultura. 26(1):9-20.

Simatupang S, 2009. Karakterisasi dan Pemanfaatan Plasma Nuftah Jeruk In Situ oleh Masyarakat Lokal Sumatera Utara. Buletin Plasma Nuftah. 2(15):70- 74.

Vanijajiva O, 2012. The Application of ISSR Markers in Genetic Variance Detection Among Durian (Durio zibethinus Murr.) Cultivars in The Nonthaburi Province. Procedia Engineering. 32:155-159.

Yadav O, Mitcchell S, Zamora A, Fulton T, and Kresovich S, 2007. Development of New Simple Sequence Repeat Markers For Pearl Millet. SAT eJournal.

3(1):34-37.

Yulianti F, Martasari C, Karsinah, dan Hartanto T, 2010. Variasi Genetik Jeruk Keprok SoE (Citrus reticulate Blanco) Hasil Radiasi Sinar Gamma Menggunakan Penanda ISSR. Buletin Plasma Nutfah. 2(16):134-139.

Zulfahmi, 2013. Penanda DNA Untuk Analisis Genetik Tanaman. Jurnal Agroteknologi. 3(2):41-52.

(39)

25

LAMPIRAN Lampiran 1. Bagan Protokol Ekstraksi

`

Disentrifuse 12.000 rpm selama 10 menit H2SO4 + Etanol Absolut

Dicuci pada Alkohol 70%

Dipindahkan Supernatan ke Tube b

Pelet dilarutkan di buffer TE

Dilarutkan ddH2O pada pelet akhir Diinkubasi -20⁰C overnight

Isopropanol 10x vol. Supernatan+

H2SO4 1/10 vol. Supernatan ^M

Disentrifuse 12.000 rpm selama 10 menit Isopropanol 10x volume supernatan Dipindahkan Supernatan ke Tube baru

Inkubasi 65ºC selama 1 jam

Kloroform: Isoamil Alkohol (24:1)

Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit

Kloroform: Isoamil Alkohol (24:1)

Dibolak-balik + Vortex

Digerus + PVP + buffer ekstraksi CTAB 2%

0.01 g daun Citrus

Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit Dipindahkan Supernatan ke Tube baru

Digerus+PVP+Buffer ekstraksi CTAB 3%^M

RNA-se 1 µL ^M

Diinkubasi 37 ⁰C selama 1 jam ^M

Diinkubasi 75 ⁰C selama 3 menit ^M

(40)

26

Lampiran 2. Gambar Jeruk Keprok Sumatera Utara

Tanaman Keprok Maga Buah Keprok Maga

Tanaman Keprok Brastepu Buah Keprok Brastepu

Tanaman Keprok Sipirok Buah Keprok Sipirok

(41)

27

(42)

28

(43)

Lampiran 3. Hasil Scoring Pita Polimorfik Jeruk Keprok Sumatera Utara Nama

Sampel Brastepu Sibanggor_tonga Huta_namale Huta_lombang Banjar_tikus Baringin_siumuran Aek_kambiri Aek_horsik

TAA15_300 0 1 0 0 0 0 0 0

TAA15_250 1 1 0 0 0 0 0 0

TAA15_100 1 1 1 1 1 1 1 1

TAA27_250 1 0 0 0 1 0 0 0

TAA27_150 0 1 1 1 0 0 1 1

TAA27_100 1 1 1 1 1 1 1 1

TAA41_200 1 1 0 0 0 0 0 0

TAA41_150 1 1 0 0 1 0 0 0

TAA41_100 1 1 1 1 1 1 1 1

CAC23_200 1 1 0 0 0 0 0 0

CAC23_100 1 1 1 1 1 1 1 1

(44)

Lampiran 4. Persentasi Kemiripan Genetik Berdasarkan Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan 4 Penanda SSR

Brastepu S_ Tonga H_ Namale H_Lombang Banjar Tikus

B_Siumura n

Aek Kambiri

Aek Horsik Brastepu 100%

Sibanggor Tonga 84% 100%

Huta Namale 58% 67% 100%

Huta Lombang 58% 67% 100% 100%

Banjar Tikus 80% 62% 72% 72% 100%

Baringin

Siumuran 61% 58% 89% 89% 80% 100%

Aek Kambiri 58% 67% 100% 100% 72% 89% 100%

Aek Horsik 58% 67% 100% 100% 72% 89% 100% 100%

Jarak Terendah Jarak Tertinggi