DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2014
KLONING GEN
CYP71AV
ASAL
Artemisia annua
DI DALAM
Escherichia coli
DH-
5α
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Kloning gen
CYP71AV asal Artemisia annua di dalam Escherichia coli DH-5α” adalah karya bersama saya dengan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, November 2014
Olivia Scarinta
ABSTRAK
OLIVIA SCARINTA. Kloning gen CYP71AV asal Artemisia annua di dalam
Escherichia coli DH-5α. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan ARIS TJAHJOLEKSONO.
Kasus infeksi malaria menyebabkan 1.7 – 2.5 juta orang/tahun mengalami kematian. Artemisia annua mengandung senyawa artemisinin yang efektif untuk membasmi jenis-jenis malaria yang resisten terhadap kuinin dan klorokuin.
CYP71AV merupakan gen yang memiliki peranan penting dalam biosintesis artemisinin dengan cara mengkatalis oksidasi dari produk intermediate yang banyak dihasilkan dalam biosintesis artemisinin yaitu amorpha-4,11-diene. Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning gen CYP71AV melalui teknologi DNA rekombinan. Gen CYP71AV diamplifikasi dari cDNA total dengan menggunakan primer spesifik. cDNA CYP71AV disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T Easy. Plasmid rekombinan yang mngandung gen CYP71AV diintroduksikan ke dalam
Escherichia coli galur DH5-α. Pengurutan cDNA CYP71AV menghasilkan sekitar 1571 pasang basa yang menyandikan 523 asam amino. Analisis kesejajaran lokal nukleotida dengan CYP71AV dari beberapa spesies yang terdaftar di GeneBank
menunjukkan bahwa cDNA CYP71AV memiliki kemiripan sebesar 98% dengan
complete cds A.annua (JQ254992.1). Hasil analisis domain menunjukkan bahwa cDNA CYP71AV memiliki tiga daerah domain terkonservasi.
Kata kunci : cDNA CYP71AV, kloning, Artemisia annua.
ABSTRACT
OLIVIA SCARINTA. Cloning of CYP71AV gene from Artemisia annua into
Escherichia coli DH-5α. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and ARIS TJAHJOLEKSONO.
Infection of malaria caused 1.7-2.5 million people die each year. Artemisia annua contains artemisinin compounds effective to eradicate malaria types that are resistant to quinine and chloroquine. CYP71AV is a gene that has critical role in the biosynthesis of artemisinin by catalyzing the oxidation of intermediate products Amorpha-4,11-diene, which are highly produced in the biosynthesis of artemisinin. This study aimed to clone the CYP71AV gene through recombinant DNA technology. CYP71AV gene from total cDNA was amplified using specific primers. CYP71AV gene was inserted into pGEM-T Easy plasmid. The recombinant plasmid containing CYP71AV gene introduced into Escherichia coli
strain DH5-α.CYP71AV gene sequencing produce approximately 1571 base pairs encoding 523 amino acids. Local alignment analysis of nucleotides with CYP71AV
of several species listed in GeneBank showed that the cDNA CYP71AV have 98% similarity with complete cds A.annua (JQ254992.1). Domain analysis showed that the CYP71AV gene has three conserved domain.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB.
KLONING GEN
CYP71AV
ASAL
Artemisia annua
DI DALAM
Escherichia coli
DH-
5α
OLIVIA SCARINTA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Kloning gen CYP71AV asal Artemisia annua di dalam Escherichia coli DH-5α
Nama : Olivia Scarinta NIM : G34100094 Program Studi : Biologi
Disetujui oleh
Dr Utut Widyastuti MSi Pembimbing I
Dr Ir Aris Tjahjoleksono DEA Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana MSi Ketua Departemen
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena skripsi yang berjudul “Kloning gen CYP71AV asal Artemisia annua di dalam
Escherichia coli DH-5α” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dorongan hingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini, yaitu:
1 Dr Utut Widyastuti MSi dan Dr Ir Aris Tjahloleksono selaku dosen pembimbing yang telah memberikan dana penelitian serta pengarahan dalam penyusunan skripsi ini,
2 Dr Achmad Farajallah selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan kritik untuk perbaikan skripsi ini,
3 Dr Ir Iman Rusmana MSi selaku ketua Departemen Biologi,
4 Mbak Pepi Elvavina yang telah membantu penulis selama penelitian di Laboratorium,
5 Bernadi Tenggarahardja, Veronica Meiji, Nicholas Kevin serta seluruh keluarga yang telah memberikan motivasi kepada penulis,
6 Tommy Gantohe, Silvana Godelifa Marsiana Fofid, Theresia Farneubun, dan seluruh teman-teman Tim Pendamping.
7 Seluruh teman-teman Biologi 47 dan BIORIN.
Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang membangun dari semua pihak sangat diharapkan. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak yang memerlukannya.
Bogor, November 2014
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL xi
DAFTAR GAMBAR xii
DAFTAR LAMPIRAN xii
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 1
Ruang Lingkup Penelitian 1
BAHAN DAN METODE 2
Waktu dan Tempat Penelitian 2
Bahan 2
Alat 2
Prosedur Penelitian 2
Perbanyakan cDNA 2
Penyisipan fragmen DNA pada vektor pengklonan 2
Transformasi 3
Identifikasi hasil transformasi dan sekuensing 3
HASIL DAN PEMBAHASAN 4 Perbanyakan cDNA 4 Ligasi dan Transformasi 4 Identifikasi koloni rekombinan 5 Analisis urutan nukleotida gen CYP71AV 7
SIMPULAN DAN SARAN 8
Simpulan 8
Saran 8
DAFTAR PUSTAKA 8
LAMPIRAN 10
DAFTAR TABEL
1 Rasio molaritas sisipan dan vektor pada proses ligasiError! Bookmark not defined.
2 Rasio molaritas ligasi dan hasil transformasi 5
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil amplifikasi cDNA 4
2 Koloni yang tumbuh pada media LA+Amp+X-gal+IPTG dari hasil
transformasi 5
3 Peta plasmid pGEM-T Easy 6
4 Hasil PCR koloni dengan primer T7-SP6 6
5 Hasil PCR dengan primer kombinasi A (CYPF-SP6) dan B (T7-CYPR) 6
6 Hasil pemotongan plasmid dengan enzim NotI 7
7 Perbandingan daerah domain terkonservasi cDNA CYP71AV dengan
complete cdsArtemisia annua (JQ254992.1) 8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Perbedaan sekuen nukleotida CYP71AV dengan complete cds
Artemisia annua (JQ254992.1) 10
2 Pohon filogenetik gen CYP71AV dengan complete cds A.annua
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Adanya kemampuan Multidrug Resistance pada Plasmodium falciparum
menyebabkan malaria menjadi salah satu dari penyakit paling mematikan di dunia. Lebih dari 600 juta kasus infeksi malaria menyebabkan 1.7 – 2.5 juta orang/tahun mengalami kematian. Empat puluh persen dari jumlah tersebut terdapat di negara berkembang, antara lain India, Indonesia, negara-negara di Amerika Latin dan negara-negara di Afrika (Graz et al. 2011). Artemisia annua L. (Asteraceae) merupakan tanaman obat yang sudah lama digunakan di Cina sebagai obat antimalaria, mengandung senyawa terpenoid komplek artemisinin yang merupakan senyawa seskuiterpen lakton endoperoksidase (Ferreira & Janick 1996). Artemisinin adalah senyawa yang efektif untuk membasmi jenis-jenis malaria yang resisten terhadap kuinin dan klorokuin serta malaria serebral yang disebabkan oleh
Plasmodium falciparum (Paniego & Giuletti 1994). Introduksi A. annua dari daerah asalnya yang beriklim subtropik ke daerah tropik menyebabkan tanaman cepat berbunga sehingga produktivitas artemisinin turun. Artemisia vulgaris adalah jenis Artemisia lokal Indonesia yang dikenal dengan nama daerahnya sudamala mengandung artemisinin 2.55 ppm lebih rendah dibandingkan kandungan artemisinin A. annua (4.99 ppm) (Aryanti et al 2006) . Herba ini tersebar hampir di semua dataran tinggi di Indonesia terutama di Papua. Pembuatan senyawa artemisinin sintetik membutuhkan biaya yang besar sehingga A.annua ini masih menjadi satu-satunya sumber obat tersebut. Tanaman A.annua memiliki gen
CYP71AV yang berperan penting dalam biosintesis artemisinin dengan cara mengkatalis oksidasi dari produk intermediate amorpha-4,11-diene yaitu intermediate yang banyak dihasilkan dalam biosintesis artemisinin (Teoh et al. 2006). Ekspresi gen
CYP71AV diketahui meningkat pada perkembangan daun setengah membuka yang ditandai dengan meningkatnya kandungan artemisinin pada kelenjar trikoma (Widyastuti et al. 2012). Oleh karena itu, kloning gen CYP71AV diharapkan dapat digunakan untuk perbaikan genetik pada tanaman Artemisia annua maupun Artemisia
lokal Indonesia melalui penggunaan teknologi DNA rekombinan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning gen CYP71AV melalui teknologi DNA rekombinan dan identifikasi cDNA.
Ruang Lingkup Penelitian
2
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari 2014 sampai Juni 2014 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands (BIORIN), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Dramaga.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah cDNA yang berasal dari hasil penelitian Widyastuti et al (2012), plasmid p-GEMT Easy digunakan sebagai vektor pengklonan dan E.coli strain DH-5α sebagai inang vektor rekombinan, antibiotik ampisilin 50 mg/mL, media inkubasi dan bahan-bahan proses ligasi dan transformasi.
Alat
Alat yang digunakan adalah mesin PCR, microtube Eppendorf, pipet mikro, laminar air flow cabinet, sentrifuse, mesin elektroforesis dan UV transilluminator.
Prosedur Penelitian
Perbanyakan cDNA
cDNA penyandi protein CYP71AV diperbanyak dengan PCR menggunakan primer spesifik CYP71AV1-F (5’ CACCATGGCACTCTCACTGACCAC3’) dan
CYP71AV1-R (5’ CTAGAAACTTGGAACGAGTAACAAC3’). Untuk PCR, 100 ng cDNA dicampur dengan 0.2 µL Taq polimerase (5 ng/µ L), 1 µL dNTP 2 mM, 0.25 µL primer forward 10 mM, 0.25 µL primer reverse 10 mM, 1 µL Taq buffer 10 x dan ditambah dengan ddH2O sehingga volume akhir mencapai 10 µL. PCR
dijalankan dengan program predenaturasi 950 C selama 5 menit, denaturasi 940 C selama 30 detik, annealing 520 C selama 30 detik, dan elongasi 720 C selama 90 detik. Proses denaturasi, annealing, dan elongasi dilakukan sebanyak 30 siklus.
Penyisipan fragmen DNA pada vektor pengklonan
Sebanyak 2-15 ng cDNA yang dihasilkan dari PCR selanjutnya dicampur dengan 1 µL pGEM-T easy 10 ng/µ L, 0.2 µL DNA ligase T4 5 ng/µ L , 5 µL 2x buffer ligasi dan ditambah dengan ddH2O steril hingga volume akhir mencapai 10
µL, kemudian diinkubasikan pada suhu 40 C selama semalam (16 jam). Untuk memperoleh hasil pengklonan yang optimal, jumlah DNA sisipan (cDNA
CYP71AV) yang dibutuhkan dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
Vektor (ng) x Ukuran sisipan (kb)
3 Bila rasio molaritas sisipan dengan vektor adalah 3:1, jumlah vektor 10 ng, ukuran vektor 3000 bp dan ukuran sisipan sebesar 1500 bp maka berdasarkan rumus tersebut, jumlah sisipan yang dibutuhkan adalah 15 ng.
Ligasi dilakukan pada tiga taraf perbandingan seperti ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel 1 Rasio molaritas sisipan dan vektor pada proses ligasi
Kode Rasio molaritas sisipan
Transformasi dilakukan dengan mengikuti metode yang digunakan oleh Suharsono (2002). Untuk itu, satu koloni bakteri E. coli galur DH5-α dikulturkan dalam 2 mL media LB (Bacto Trypton, Bacto Yeast dan NaCl) cair di dalam
shaking incubator (kecepatan 250 rpm), pada suhu 37oC, selama semalam, kemudian disubkulturkan di dalam 5 mL media LB cair hingga OD600=0.4-0.5.
Bakteri diinkubasi selama 10 menit di dalam es dan diendapkan dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm pada suhu 4oC selama 5 menit. Endapan bakteri disuspensikan dalam 495 µL buffer transformasi dan diinkubasi di dalam es selama 10 menit. Setelah sentrifugasi, endapan bakteri disuspensikan dalam 125 µL TB (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2.2H2O, 250 mM KCl, 55 mM
MnCl2.4H2O, pH6.7), kemudian ditambah dengan 8.8 µL DMSO dan diinkubasi
di dalam es selama 10 menit sehingga diperoleh bakteri kompeten.
Sebanyak 50 µL dari bakteri kompeten dicampur dengan 10 µ L produk ligasi dan diinkubasi di dalam es selama 25 menit. Campuran ini kemudian diinkubasi pada suhu 42oC, selama 60 detik, kemudian dimasukkan kembali ke dalam es dan dibiarkan di dalamnya selama 5 menit. Campuran ini ditambah dengan 100 µL media 2xYT (16 g/L Bacto-tryptone, 10 g/L Bacto yeast extract, 5 g/L NaCl, pH 7.0) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Bakteri ampisilin sedangkan untuk kontrol media, sel bakteri kompeten disebar di atas media LA dengan ampisilin.
Identifikasi hasil transformasi dan sekuensing
4 dianalisis kemiripan dan homologinya dengan menggunakan program BLAST2 (Basic_Local_Alignment_Search_Tools) (http://www.ebiac.uk/blast2). Analisis daerah terkonservasi dan domain dilakukan dengan menggunakan program
conserved domain NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Perbanyakan cDNA
Perbanyakan cDNA menggunakan PCR menghasilkan pita DNA yang berukuran sekitar 1500 bp (Gambar 1). Selain untuk memastikan keberadaan gen target yang akan diklon dan dianalisis, hasil amplifikasi ini juga menunjukkan konsentrasi cDNA CYP71AV yang tersimpan dalam stok. Konsentrasi cDNA
CYP71AV diperoleh dengan cara membandingkan visualisasi kecerahan pita terhadap marker lamda ( ) pada gel elektroforesis. Hasil elektroforesis menunjukkan konsentrasi CYP71AV pada stok cDNA adalah 50 ng/µ L.
M 1
Gambar 1 Hasil amplifikasi cDNA. M : marker 1 kb, lajur 1 merupakan hasil amplifikasi cDNA.
Ligasi dan Transformasi
Gen CYP71AV yang berhasil diamplifikasi dari cDNA selanjutnya diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy kemudian diintroduksikan ke dalam
E.coli galur DH5-α. Ligasi dilakukan pada tiga taraf perlakuan (Tabel 1). Seleksi terhadap E.coli yang mengandung plasmid rekombinan pembawa sisipan fragmen cDNA CYP71AV dilakukan pada media seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin, X-gal dan IPTG. Plasmid pGEM-T easy selain sebagai vektor pembawa juga digunakan sebagai marker penyeleksi karena mengandung gen lacZ yang menyandikan β-galaktosidase (β-gal), suatu enzim yang dapat mendegradasi disakarida laktosa menjadi monosakarida glukosa dan galaktosa yang disertai dengan perubahan warna media. X-gal adalah senyawa yang memiliki struktur mirip dengan laktosa. Media akan menjadi biru ketika β-gal memotong struktur X-gal tersebut. Koloni berwarna putih jika X-gal tidak terpotong karena koloni tidak menghasilkan β-gal. Adanya sisipan pada gen lacZ menyebabkan gen lacZ
tidak diekspresikan sehingga koloni tidak menghasilkan β-gal (Sambrook 1989). 1500 bp
2000 bp
1000 bp
5 Dari 3 taraf perlakuan, hanya 2 yang menunjukkan hasil positif, hal ini ditunjukkan dengan adanya koloni biru dan putih pada cawan A dan C, sedangkan pada cawan B sama sekali tidak ada koloni yang tumbuh (Tabel 2). Keberhasilan dari ligasi sangat ditentukan oleh perbandingan antara sisipan dan vektor yang digunakan serta ukuran sisipan. Ukuran sisipan yang kecil menghasilkan peluang terjadinya ligasi dengan lebih baik. Selain itu ketidak berhasilan ligasi juga ditentukam oleh kualitas enzim ligasi.
Tabel 2 Rasio molaritas ligasi dan hasil transformasi
6 dan 5 koloni berasal dari cawan C. Identifikasi dengan PCR dilakukan sebanyak 2 kali, pertama dengan primer T7-SP6 untuk memastikan bahwa koloni tesebut telah mengandung gen target yang dibawa oleh plasmid pGEMT-Easy (Gambar 3) dan yang ke dua dengan kombinasi primer CYPF-SP6 dan T7-CYPR untuk memastikan bahwa gen target telah tersisip ke dalam vektor. PCR koloni dari cawan A dan cawan C menggunakan primer T7-SP6 menghasilkan pita yang berukuran sekitar 1500 bp (Gambar 4). Kedua koloni tersebut kemudian digunakan untuk PCR koloni menggunakan kombinasi primer CYPF-SP6 dan T7-CYPR dan hasilnya adalah pita berukuran sekitar 1500 bp (Gambar 5).
Gambar 3 Peta plasmid pGEM-T Easy
1 2 3 4 5 6 7 1 kb
Gambar 4 Hasil PCR koloni dengan primer T7-SP6. 1-2: koloni cawan A, 3-7: koloni cawan B, marker: 1 kb.
2A 2B 4A 4B 1 kb
Gambar 5 Hasil PCR dengan primer kombinasi A (CYPF-SP6) dan B (T7-CYPR). 2A & 2B: koloni 2, 4A & 4B: koloni 4.
Untuk memastikan bahwa fragmen cDNA telah tersisip ke dalam vektor maka DNA plasmid rekombinan diisolasi dari masing-masing koloni (koloni 2 & 4). Plasmid hasil isolasi ini kemudian dipotong dengan enzim restriksi NotI untuk memastikan keberadaan gen sisipan.
Pemotongan plasmid rekombinan dengan enzim NotI menghasilkan 2 pita seperti terlihat pada Gambar 6. Hal ini menunjukkan bahwa plasmid rekombinan
1000 bp 1500 bp
2000 bp
1500 bp
7 berhasil dipotong menjadi 2 bagian yaitu plasmid vektor dan fragmen sisipan (cDNA atau gen CYP71AV). Pita yang berada di bagian atas adalah vektor yang berukuran sekitar 3000 bp sedangkan pita yang berada di bawah adalah gen
CYP71AV yang berukuran sekitar 1500 bp. Posisi pita plasmid rekombinan baik yang dipotong maupun yang tidak dipotong sejajar meskipun ukurannya berbeda, hal ini disebabkan oleh plasmid rekombinan yang tidak dipotong bentuknya sirkuler sehingga tidak bisa dipastikan ukurannya. Selain posisi, pita yang dihasilkan juga sangat tipis, hal ini disebabkan oleh sedikitnya plasmid yang berhasil diisolasi.
2-NotI 2 1 kb 4 4-NotI
Gambar 6 Hasil pemotongan plasmid dengan enzim NotI. 2- NotI: plasmid rekombinan dipotong, 2: plasmid rekombinan klon 2 tidak dipotong, 1 kb: marker 1 kb, 4: plasmid rekombinan klon 4 tidak dipotong,
4-NotI: plasmid rekombinan dipotong.
Analisis Urutan Nukleotida Gen CYP71AV
Pengurutan cDNA CYP71AV menghasilkan 1571 pb yang menyandikan 523 asam amino. Analisis kesejajaran lokal (local alignment) dilakukan untuk melihat kesamaan dan kekerabatan dengan berbagai spesies yang tersedia di GeneBank. Hasil analisis menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) menunjukkan bahwa fragmen cDNA CYP71AV memiliki nilai kemiripan yang tinggi dengan complete cds Artemisia annua (JQ254992.1), yaitu sebesar 98% dan nilai E-value sebesar nol. Nilai E-value merupakan nilai yang menunjukkan signifikasi kemiripan sekuen. Jika suatu sekuen memiliki nilai E-value semakin mendekati nilai 0 (nol) maka semakin dapat disimpulkan bahwa sekuen tersebut mirip terhadap pasangan pengurutannya. Sebaliknya, jika suatu sekuen memiliki nilai E-value lebih besar dari 0.001 maka sekuen tersebut sulit untuk disimpulkan kemiripannya dengan data yang diambil dari GeneBank
(Claverie & Notredame 2003). Perbedaan nukleotida antara sekuen cDNA
CYP71AV dengan complete cds Artemisia annua dapat dilihat pada Lampiran 1. Hasil filogenetik menunjukkan bahwa fragmen cDNA CYP71AV memiliki kekerabatan paling dekat dengan Artemisia annua (Lampiran 2).
Selain terdapat perbedaan sebanyak 19 basa nukleotida, kedua sekuen ini juga memiliki perbedaan pada domain yang terkonservasi. cDNA CYP71AV
memiliki tiga daerah domain terkonservasi yang berada pada interval 10-453, 497-1500 bp
CYP71AV
T-8 1078 dan 376-1478, sementara daerah domain terkonservasi pada complete cds Artemisia annua (JQ254992.1) berada pada keseluruhan sekuen. Perbandingan daerah domain terkonservasi kedua sekuen tersebut disajikan pada Gambar 7. Hasil analisis domain menunjukkan bahwa urutan asam amino CYP71AV diduga termasuk ke dalam tipe cytochrome P450 (Gambar 7). Cytochrome P450 adalah kelompok protein heme-tiolase yang terlibat dalam degradasi oksidatif berbagai senyawa, terutama racun lingkungan dan mutagen. Protein ini dibagi menjadi empat kelas berdasarkan cara elektron dari NAD(P)H dikirim ke situs katalitik. Konservasi sekuen cenderung rendah dalam famili ini dan hanya ada tiga residu yang terkonservasi. Cytochrome P450 pada eukariot memiliki fungsi enzimatis untuk mengkatalis hidrokarbon non aktif pada suhu fisiologis (NCBI 2010).
Gambar 7 Perbandingan daerah domain terkonservasi cDNA CYP71AV dengan
complete cdsArtemisia annua (JQ254992.1)
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Kloning gen CYP71AV telah berhasil dilakukan. Analisis kesejajaran lokal urutan nukleotida menunjukkan bahwa cDNA CYP71AV memiliki nilai kemiripan yang tinggi terhadap complete cdsArtemisia annua (JQ2549922.1).
Saran
9
DAFTAR PUSTAKA
Aryanti, Ermayanti TM, Prinadi KI, Dewi RM. 2006. Uji daya antimalaria
Artemisia spp. Terhadap Plasmodium falcifarum. Majalah Farmasi Indonesia 17 (2): 81-84
Claverie JM, Notredame C. 2003. Bioinformatics for Dummies. Willey Publishing Inc. New York.
Ferreira JFS, J Janick. 1995. Floral morphology of Artemisia annua with special reference to trichomes. Int J Plant Sci 156 : 807-815.
Graz B, Kitua A, Malebo HM. 2011. To what extent can traditional medicine contribute a complementary or alternative solution to malaria control programmes? Malaria Journal 10: 1-6.
[NCBI] National Center for Biotechnology Information. 2010. Cytochrome P450 [internet]. [diacu 17 Oktober 2014] Tersedia dari: http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Paniego NB, AM Giuletti. 1994. Artemisia annua L. : dedifferentiated and differentiated cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 36 : 163-168. Sambrook J, Fritsch EJ, Maniatis T. 1989. Molecular cloning : A Laboratory
Manual. Second edition. Cold Spring Harbour : Laboratory Press.
Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Hayati 3:67-70
Teoh. KH, Polichuk DR, Reed DW, Nowak G, Covello PS. 2006. Artemisia annua L. (Asteraceae) trichome-specific cDNAs reveal CYP71AV1, a cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the antimalarial sesquiterpene lactone artemisinin. FEBS Letters 580: 1411-1416
10
LAMPIRAN
Lampiran 1. Perbedaan sekuen nukleotida CYP71AV dengan complete cds Artemisia annua
(JQ254992.1)
CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl ATGGCACTCTCACTGACCACCTCCATTGCTCTTGCCACGATCCTTTTCTT 50 gi|398708925|gb|JQ254992.1| ATGGCACTCTCACTGACCACTTCCATTGCTCTTGCAACGATCCTTTTGTT 50 ******************** ************** *********** **
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl CGTAATCTACAAGTTCGCTACTCGTTCCAAATCCACAAAAAACAGCCTTC 100 gi|398708925|gb|JQ254992.1| CGT---TTACAAGTTCGCTACTCGTTCCAAATCCACCAAAAAAAGCCTTC 97 *** ***************************** ***** *******
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl CTGAGCCATGGCGACTTCCCATTATTGGTCACATGCATCACTTGATTGGT 150 gi|398708925|gb|JQ254992.1| CTGAGCCATGGCGACTTCCCATTATTGGTCACATGCATCACTTGATTGGT 147 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl ACAATACCACATCGTGGGCTTATGGATTTAGCCAGAAAGTATGGATCTTT 200 gi|398708925|gb|JQ254992.1| ACAACGCCACATCGTGGGGTTAGGGATTTAGCCAGAAAGTATGGATCTTT 197 **** ************ *** ***************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl AATGCATTTACAGCTTGGTGAAGTTTCAACAATCGTGGTGTCATCTCCGA 250 gi|398708925|gb|JQ254992.1| GATGCATTTACAGCTTGGTGAGGTTCCAACAATCGTGGTGTCATCTCCGA 247 ******************** *** ************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl AATGGGCTAAAGAGATTTTGACAACGTACGACATTTCCTTTGCTAACAGG 300 gi|398708925|gb|JQ254992.1| AATGGGCTAAAGAGATTTTGACAACGTACGACATTACCTTTGCTAACAGG 297 *********************************** **************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl CCCGAGACTTTAACTGGTGAGATTGTTTTATATCACAATACGGATGTTGT 350 gi|398708925|gb|JQ254992.1| CCCGAGACTTTAACTGGTGAGATTGTTTTATATCACAATACGGATGTTGT 347 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl TCTTGCACCTTATGGTGAATACTGGAGGCAATTACGTAAAATTTGCACAT 400 gi|398708925|gb|JQ254992.1| TCTTGCACCTTATGGTGAATACTGGAGGCAATTACGTAAAATTTGCACAT 397 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl TGGAGCTTTTGAGTGTTAAGAAAGTAAAGTCATTTCAGTCGCTTCGTGAA 450 gi|398708925|gb|JQ254992.1| TGGAGCTTTTGAGTGTTAAGAAAGTAAAGTCATTTCAGTCGCTTCGTGAA 447 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl GAGGAGTGTTGGAATTTGGTTCAAGAGATTAAAGCTTCAGGTTCAGGGAG 500 gi|398708925|gb|JQ254992.1| GAGGAGTGTTGGAATTTGGTTCAAGAGATTAAAGCTTCAGGTTCAGGGAG 497 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl ACCCGGTTAACCTTTCAGAGAATGTTTTCAAGTTGATTGCAACGATACTT 550 gi|398708925|gb|JQ254992.1| ACC-GGTTAACCTTTCAGAGAATGTTTTCAAGTTGATTGCAACGATACTT 546 *** **********************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl AGTAGAGCCGCATTTGGGAAAGGGATCAAGGACCAGAAAGAGTTAACGGA 600 gi|398708925|gb|JQ254992.1| AGTAGAGCCGCATTTGGGAAAGGGATCAAGGACCAGAAAGAGTTAACGGA 596 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl GATTGTGAAAGAGATACTGAGGCAAACTGGTGGTTTTGATGTGGCAGATA 650 gi|398708925|gb|JQ254992.1| GATTGTGAAAGAGATACTGAGGCAAACTGGTGGTTTTGATGTGGCAGATA 646 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl TCTTTCCTTCAAAGAAATTTCTTCATCATCTTTCGGGCAAGAGAGCTCGG 700 gi|398708925|gb|JQ254992.1| TCTTTCCTTCAAAGAAATTTCTTCATCATCTTTCGGGCAAGAGAGCTCGG 696 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl TTAACTAGCCTTCGCAAAAAGATCGATAGTTTAATCGATAACCTTGTAGC 750 gi|398708925|gb|JQ254992.1| TTAACTAGCCTTCGCAAAAAGATCGATAATTTAATCGATAACCTTGTAGC 746 **************************** *********************
11
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl TTCTTTTAAGGCTCAAAGACAGTGCTGAATTCCCATTAACATCTGATAAC 850 gi|398708925|gb|JQ254992.1| TTCTTTTAAGGCTCAAAGACAGTGCTGAATTCCCATTAACATCTGATAAC 846 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl ATTAAAGCCATCATTTTGGATATGTTTTGGAGCAGGCACAGACACTTCCT 900 gi|398708925|gb|JQ254992.1| ATTAAAGCCATCATTTTGGATATGTTT-GGAGCAGGCACAGACACTTCCT 895 *************************** **********************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl CATCCACAATCGAATGGGGCGATTTCGGAACTCATAAAGTGTCCGAAAGC 950 gi|398708925|gb|JQ254992.1| CATCCACAATCGAATGGG-CGATTTCGGAACTCATAAAGTGTCCGAAAGC 944 ****************** *******************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl AATGGGAGAAAGTACAAGCGGGAATTGAGGAAAGCATTGAACGGGAAAAG 1000 gi|398708925|gb|JQ254992.1| AATGG-AGAAAGTACAAGCGG-AATTGAGGAAAGCATTGAACGG-AAAAG 991 ***** *************** ********************** *****
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl AAAAGATCCCATGAGGAAGACATTCAAGAACTAAGCTACTTGAACATGGT 1050 gi|398708925|gb|JQ254992.1| AAAAGATCC-ATGAGGAAGACATTCAAGAACTAAGCTACTTGAACATGGT 1040 ********* ****************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl AATCAAAGAAACATTGGAGGTTGCACCCTCCACTACCCCTTGGTTCTTGC 1100 gi|398708925|gb|JQ254992.1| AATCAAAGAAACATTG-AGGTTGCACCCTCCACTACCC-TTGGTTCT-GC 1087 **************** ********************* ******** **
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl CAAGAGAAGTGCCGCCCAACCAAGTCAATTTTGGCTGGGATACAAACATA 1150 gi|398708925|gb|JQ254992.1| CAAGAGA-GTGCCGCC-AACCA-GTCAATTT-GGCTGG-ATACAA-CATA 1131 ******* ******** ***** ******** ****** ****** ****
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl CCCCAATAAGACCAAACTTATTGTCAACGTCTTTGCGATAAATAGGGACC 1200 gi|398708925|gb|JQ254992.1| CCC-AATAAGACCAAACTTATTGTCAACGTCTTTGCGATAAATAGGGACC 1180 *** **********************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl CTGAATATTGGAAAGACGCTGAAGCTTTCATCCCTGAACGATTTGAAAAT 1250 gi|398708925|gb|JQ254992.1| CTGAATATTGGAAAGACGCTGAAGCTTTCATCCCTGAACGATTTGAAAAT 1230 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl AGTTCTGCAACTGTCATGGGTGCAGAATACGAGTATCTTCCGTTTGGAGC 1300 gi|398708925|gb|JQ254992.1| AGTTCTGCAACTGTCATGGGTGCAGAATACGAGTATCTTCCGTTTGGAGC 1280 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl TGGGAGAAGGATGTGTCCTGGAGCCGCACTTGGTTTAGCTAACGTGCAGC 1350 gi|398708925|gb|JQ254992.1| TGGGAGAAGGATGTGTCCTGGAGCCGCACTTGGTTTAGCTAACGTGCAGC 1330 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl TCCCGCTCGCTAATATACTATATCATTTCAACTGGAAACTCCCCAATGGT 1400 gi|398708925|gb|JQ254992.1| TCCCGCTCGCTAATATACTATATCATTTCAACTGGAAACTCCCCAATGGT 1380 **************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl GTGAGCTATGACCAGATCGACATGACCGAGAGCTCTGGAGCCACGATGCA 1450 gi|398708925|gb|JQ254992.1| GTGAGCTATGACCAGATCGACATGACCGAGAGCTCTGGAGCCACGATGCA 1430 **************************************************
12
