Viabilitas Demi Embrio Sapi In Vitro Hasil Splitting Embrio Segar dan Beku

Viabilitas Demi

Em

brio

Sapi

I n

Vitro

Hasil Splitting

Em

brio

Segar dan

Beku

M.

~ M R O N ' , A. ROEDIONO~ dan

1.

SUPRUTNA'~

'8ala1 Ernhrio Ternak C~pelang. PO Box dB5 Bogor 16004 Email: mrnron@deptun.gcl.id

'~oXu11as Kedolaernn ifcwan, lmrrrut Per~onian Bogor

(Dltcr~ma dewan r c d a h ~ 1 I Maret ZDO7)

ABSTRACT

IM R O N. M.. A B~)~!I)IoNo and I . SUPRIA'I-NA. 2007. Viahilily of bovir~c dcnli crnbryo aftcr splittlng of fresh and frozcn thawed emhryu derived from in vrrco c m h y n produr\\nr~ Jl7'1J 132). 1 18-123.

In vivn c m h ~ o productiun was limited by n u m k r of donor. widc variabil~ty respond due lo supctovularion program and also ~ r n m u n o a c r ~ l i ~ y of suprrovulation hormcne (FSH) Splilting technoluky could bbr an alternative to increase the numher of

rransferrahlc c n h n o l ; i n ~ r ~ rcr lplsn cows. Spiit~ing is done W I th cutting embryo hecoming nvo equal p~cces (called dcmi embrio) base un ICM o r i c n ~ a i i o n . The ob~ecrive of this rtsearch was to dcrcrmine rhc viability of demi crnbryo ohta~ned from embryo s p l i t ~ ~ n g o:'lir.\h and f r w t n thawcd embryo 'The results showed [hat dcmi crnhryos which perrormed bl=~ococl recxpansiun 3 hours afler e1tthn.o sp11rti11g using t'rcsh and frozen !hawed embryos ucre 76.9 a n d 76 2% respccl!vely. Base on cxistenlion of inncr ccll mars {\Chi), thc number of demi entbpos dcvclopcd with ICM from fresh and frozen thawed cmbryos wcrc not significm~ly din-crtnt (90.6 and 85.7% rcspcctivcly. The cell number of dcmi embryo from fresh embryos splitting was not dilfercnt ctrmparcd u tth ~ h u w from Iroztn thawed ernbqos ( 3 6 . t and 35.9 I C S ~ C C L ~ V ~ ~ ~ ) . These finding indica~cd that embryo s p l ~ i t ~ n g can br appllrd 10 Iro7.m hawed embryos with certain condition as wcll as frcsh embryos.

Kcy Words In f r ~ t r c I:mhryo, Spl~ning, Demi Embryo, Cell Number

ARSTRAK

I m O N , M., A ROEDIONO dan I. S U P R I A ~ A . 2007. Viabilitas demi c m Q r ~ o sapi in vrrro basil splitling embrio s e g u dan bcku. JITVlZ(2). 118-123

Produlsi embrio in vivo temak sapi dipenemhi antara lain 01th respon sapi donor tethadap program supeerovulasi yang

sangat bervariasi. immunod~ifitas horrnon superovulasi (FSH) serm ktlerbaman jumlah sapi donor. Teknologi syiltting embrio d~barapkan dapat menjadi allematif untuk optimalisasi penambahan jumlah embrio ymg dapat ditransfcr ke resipien per embrio uiuh. Tujuan penelilnn ini adalah untuk meneotukan vrabilita? demi embrio yang dlhasilkan setelah proscs spl~tting mcnggunakan embrio in ripe segar dm beku. Spl~ning embrio dilakukan dengan membelah embrro menjadi dua bagian yang sama (derni emhr~o) dengan mempert~mbangkan kcberadmn ICM. Setelah dilakukan splitting embri? diperolth hasil bahwa

d e m ~ clnbrio yang menunjukkan adanya reekspansi blastosoel tiga jam setelah xplittrng menggunakan cmbrio segar dm beku tidak herhcda nyab (76,9 dan 76,2%) Berdasarkan keberadaan inner cell mass

(ICM),

lumfah demi embrio yang positif

mcmiliki ICM untuk crnbrio scgar dan beku tidak k r b e d a nyata (90.6 dm 85,7%). Demikian juga dtngan r a m jumlah sel denti embrio segar dan beku (36,I dan 35,9) tidak

berbeda

nyala. I l a s i l ini m c n g i n d i k u i h n ballva spitning embrio dapat

dilakukan pada em bna beku yang m e n i l i k ~ hireria tertentd dengan kualitas hasi! setara dengan emhrio szgx

U a t a Kunci: Ernbrio In Viho. Splitring Embrio, Demi Fmbrio, Jurnlah Sel

Aplikasi

bioteknolagi ttproduksi pada

tern& sapj di

Inddnesia

dalarn

beberapa

dekade

terakhir

telah

mcnunjukkati

petkcm

bangan yang cuLup pcsat. 1

Ial

ini

ditnulai

dengan

pcnerapan tehologi

inserninasi

buatan

(IB)

sekitar tahun

1970-an yang

ditandai

dengan

didirikannya

Baiai lnscrninasi

Buatan

(BTB)

Lembang.

Apl~kasi

transfer

embrio

(TE)

pada

sapi

mulai

dilaksanakarl diawal dekade 90-an

yang

ditandai dengan didirikannya Balai Embrio

Ternak (BET)

di

Desa

Cipelang, Bogor. T e k n o l o g i

TE

memberikan

keunggulan

lebih dibandingkan

denean

IB

karena

peningkatan

kualilas

genetik

dapat

didckati

baik

dari

sisi

pejantan

riaupun

dari

sisi

betinanya

sehingga

percepatan

mutu

gcnetis ternak dapat

dllakukan

secar3

k h i h

e f i s ~ e n .

Produksi

embrio sapi

secara

in

vivo

banyak

menemuf kendala

antara

lain

karena respon sapi

donor

tcrhadap program

superovulasi

sangat

ben'ariasi,

keterbatasan jumlali

sapi

donor

dan immunoaktifitas

hormon superovulasi

VSH) yang

tidak

stabil

sehingga

jumlah

produksi

err,brio

irr v i v ~

sulit

dibuat

target

yang

pasti (ANUNIMOIIS, 7,006; GONG el a/ ,

1993;

KELLEK

dan

TEEPKER,

1990; K n ~ r T z

et

al.,

2003).

Altematif lain

untuk

produlsi

embric?

yang

dapat dilakukan

yaitu

dengan memproduksi

en1

brio

in vitro

(1VF). Tetapi

Rumah Pemotongan

Hewan

yang tidak jelas tetuanya. mulu genelik

cmbrio

in vilrr?

tidak

dapat

dipertanggungjawahkan

sehingga

pcdet

yang

dlhasilkan dari

embrio

in

virro

tldak

dapat

digunakan

sebagai

bib11 dasar.

Teknologi

lain

yang

dapat digunakan unluk

optimalisasi

produksi enibrio

adalah

dengan

teknik

sp/irring yaitu memotong

e m b r ~ o

menjadi d u a bagian yang sama. Potongan embrio

yang

dihasilkm dalam

proses spliffing selanjutnya

disebut

"derni embrio".

Teknik

splitring

ernbrio

dilaporkan telah dilakukan

pada

ternak

domha (WILLADSISN, 19791,

Lambing

(Srov,

1987;

NOWSII,<RI

dan 1101.~7., 1993;

BOEDIONO

el ul..

2005)

dan

ternak sapi (UTS~IMI dan I M ' M N ~ , 1990;

LUPU

el u!, 2001,

HOZUMI.

2001.

N

ORMAN el 01.. 2002)

Dcngan

nielakukan spl~lfing- pada embrio,

diharapkan

akan

rnampu nicn ingkatkan jumlah embrio yaig

dapat

ditransfcr kcpada sapi resjpirn schingga

pada

akhirnya

a k a n

meningkatkan

persenlase kebuntingan pcr e ~ n b r i o lrtuh

yang

dihasilkan. Namun ka:cna un~hb efib~cnsi trknis sebagian

besar

ernbriu

yang

diproduksi

disimpan

dalanl bentuk

embrio

bcku

(AKONIHOUS.

2006),

perlu

dikaji

apakah

embrio beku

masih

mernungkinkan

untuk dildukan

splirring.

Tujuan

dari

penelltian

~ni

adalah

untuk

menentukan

viabilrtas demi embrio

hasil

splitting

menggunakan

emhrio

in

virro

segar

dan beku.

MATERI

DAN

METODE

Produksi

ernbrio

In

vifro

Ovarium

yang

digunakan

dalam

penelitian

ini diperoleh dari

Rumah

Pemotongan Hewan (RPH)

terdekat.

Ovarium

dibawa ke laboratorium dalam

media

NaCl fisioiogis

y

ang

disuplementasi

antibiotlk pada

suhu

kamar. AsFirasi dilakukan

pada

folikel aRtral

yang

berdiamcrcr

2-5

rnrn

rnenggunakan

jarum

suntik

18

G.

Oosil diurnpung

3alam

cawan

petri

yang

berisi

mPBS

dm kemudian

dimaturasi

menggunakan

medium

TCM

199 dalarn

inkuba~nr

C 0 2

5%

selama 20-22

jam.

Sperma

yang

digunakan

untuk

fertilisasi

adalah

sperma beku yang

dicairka~

daldm

air

yang

bersuhu

30-

35°C..

Spema

dicuci

dengan

medium

BO

dan

disenrr~hisc

dcngan

kecepatan

500 G

selama

5

menit.

Kcpadamn

populasi sperma

diatur

pada

konsentrasi 5 x

1 ~ \ ~ e m a l r n l .

Fertilisas

i

dilaLukan

dengan

mentransfer

oosit

yang

telah

dimaturasi

kedalam

drop

sperma

(50 pl)

sebanyak

I0

oosit

per

drop.

Setelah

campuran

spema-oosit

diinkubasi sekitar

5

jam dalam inkubator

C 0 2

5%,

oosit

dicuci dan dikultur

lebih

lanjut rnenggunakan

medium CRlaa

(1

0

ernbrio

per 50 pL

drop)

&lam

inkubaror

C 0 1 pada suhu

38,5"C.

Ernbrio

yang digunakan lebih

Ianjut dalam

penelitian mi adalah

embria

yang mencapai

tahap

blastosis lanjut pada

hari

ke-

7,

8

ahu

9,

d m

mempunyai bentuk morfologi

yang baik dengan

ciri-

c ~ r ~ : 1). Bentuk bulat

oval

(spherical); 2).

Rongga

blsstosoel

tcrbentuli

dengan

baik, jclas

dan

menempati Icbil~ dwi 60% volume total blastosis;

3).

Sel-sel blastosis bcrketnbang baik dcngan

jurnlah

sel

degenerasi

rrlaksimal

10%;

4).

Rentuk

dan

posisi inner cell n1a.u

(ICM)

jelas, normal dan betkernbang

baik

(LINARES

d a n

K I N G , 1980).

Pcm

bckuan

d a n penrairan

em

brio

Pembekuan

em

brio

dilakukan dengan

rnenggunakan

prosedur

vitrifikasi

standar Balai

Embrio

Ternak.

Embrio diequilibrasi

dalam

3

macam

media

vitrifikasi

(Tabel

1).

Equilibtxi

dilakukan pada

suhu

mang (22'IC)

masing-masing

selama

lima

rnenit

daIarn

media

pernbekuan

VS

1

dan

VS

2. Setelah

itu

embrio

diehilibrasi

dalam

VS

3

dm

dimzukkan

dalam straw

yang

sebclumnya

telah

diisi

dengan

media

mPBS

yang mengandung

suhose

0,5

M.

Proses

equilibrasi

dalarn

VS

3

sanlpai

ke

h h a p

pencelupan

sfraw

kedalam

nitrogen

cair

ditakukan dalarn

waktu h a n g

dari

satu

menit.

Pencairan (n~arm

ing)

embrio dilakukan dengan

cara

mengeluarkan

straw dari dalam

nitrogen

cair,

dibiarkan

dalam

udara

terbuka

selama

5 6

detik

dan kemudian

dicelupkan

kedalam air

pada suhu mang

(22°C).

Isi straw ditarnpung dalarn

cawan

petri, kemudian

dilakukan

pencarian

em

brio dibawah mikroskop.

Embrio

segera

dir>indahkm

ke media

mPBS

yang rnengandung b e r h m t - m t 0,5

M

dan

0,25

M

sukrose masing-masing

selanla

5

menit.

Setelail

itu

embrio

dicuci

rnenggui~akan

mPBS

dan media

kultur CRlaa. [image:2.843.15.497.662.732.2]

Akl-irnya

embrio di kcltur

lebih lanjut

dan

diinkubasi

selama 24

jam

dalam

inkubator

COz

5%

pada

suhu

38-5OC.

Tabel 1. Komposisi media v i t r i t i h i yang digunakan untik pernbckuan ernbrio

cueuilp u ~ r ~ q e ~ ~ a d

ueepaq~ad yaio

ueqleq!ye!p

ueu!y3unway !u! 11st:y

umpaqlad

nyaq olAquIa rruap uc3usp r~eqSu!puuqrp !Z;7u!l q!qal ~1e.h Su!qureq

rq~ed ~ehs U I J ~ U I ~ !w3p sel![!qv!r, e.nqeq ueqeieiuaru ZUPX I c h ~ I) ~~lo11

uep

I ~ V I ls.niq

qa[o

ueqllqeI!p

2uv.i UI~II [auld u~3uap vpaqlaq I U I I !seI 1

~eSas

o!Jqrua 111:5uap

~ i x y d u ~ p u v q ! p

mues

J I ~ U I E ~ I~BIB~~: nyaq O l J q U a ~I~I!u~I?~~LI~I S'IJI~II~JS uq!wqlJqay E

i ~ y q

wq!

p a l (: IqIi.) (%9'06) bZ urrp

(~~'58)

OE qqepe wnl-ln~nuaq rdas O!J~LU~ UCP

f l y ~ q

0!~qu13 ~qeunli5izaill ! J E ~ ~ I S ! ~ D !eSeqas

~ 3 1

JC~U~ O!J~LU~ 3u!l~rlds uel!ssylaqaX

uayepaqlp iedvp sqa( wessc ?UP,{ selqodn~l

u~p

h.1~

Guynjugq~~1

ueqynrunuaur wsf p z - c ~~~13s Jnl[n y q q n l a s Jrr!qwey n!Jq 1~1; eped Yrt!~i~lils delep

u~y~!scylp

a ' u v i

o!JquIa !wap v:.\qrq ueyndrr[aw (500~) oxolagoa ,ua!disal !des a y ~ajsut?~l!p

qnlun

dels uep

]S~D!A 'lewou

amas

Suequ~ayraq

yela1

o!lqlua

! u a p

eMyeq ueyl~seuraur

qmun

dnyn:, d ~ H u e ! p

ur~f E surelas lnllnq

efiqeq

uc~uwskuaur t u ~

Itset1 'o!Jqua

y a p

ucqrpr~!urad sasold wqep ue>tl![n.Ctraur vSSu!qas lni[nq

c!paiu m q e p lnynyoy !e4cqns ueq~un3!p

SueL

sn[nurny -.

[as-[as

ues!del

u ~ % u a p

r u ~ A u a u r

uep

IrrlIny

!nad

UEMW

lescp

eped [adruauatu r r a v

o!Jqrua

!w2p 13s-13s .ue[

'02'

E

1

asea[aa q~~!u!~y

eq!isrlefi

alehyos ueyaun88uaur

L

(866 I

'a~vn~so~)

~!id!l?jsap

olesas

t!n~p

ueny

q ~ a d

lelue I!sz?r[

ueepaqlad

,(JVH) deq2us1 qe3e UEZUE~UPJ

lesep

ue~eun32uaur ue2uap es!leue!p elen

Zu111lds viala.; ~ m s a s o!rqrua !rrraa ( 3 ,nlrqtuJ Xu'vlr~~ll.IS (q :(11euud epucl) y a d w.wa msep cped

1tq mm:s;llrv) (r! -ouqma X~rr~r~ltls saso~d r n , i ~ [ l e . [ - _{1 l e q l u e 3}

qnitlatl~usiu uoSrrnp I !srirdsy.>ar !pcr~ai nl1e.i ~ I ~ O [ O J J O U I wesac llrl~li~qlll.3~~3d I L I I ~ : I P ~ U J U I L I V I ~ I o!Jqiua I U I J ~ Lh'!tt~;~+!l >.3\0.1~! t~i>l.>i~s LUVC E ~ I 1, :z ur?!3eq

z

~cqulcg) o!lqu!n du~~louraur lpes epd rJ d y r r r r

trvs!d iIcuey31 qnrr?5rlnd I ? u a m j ;uolunl e<uyr~~uaq

~u,IJJ!I~>~ I I F ? ~ ~ A S lwsx o!lqu13 !uI.>(~

;

JL?CJLUF!) eyed

lcr[!lrp ledep Strtjlt/rlc tlcjlras ~uel

c

uap ;i~r!,,i/ds qplalas

kccsas

otJqula !li~~p s!Sn[tq~tllu rrcdu~ptreq~n,~

-(z

1"qe.L)

qenq

(~2'9~)

2:

qe.iurqas

o!lquIa

!Map

ueql!seqSuscu

3ueL r&as

o!iqura

u~yeu1133usur

Xu?n?ydr

eq!

r

uc%uap

u e q 3 ~ 1 p u ~ y 1 p

eues ~!d~ucq

Xurtt!/ds I!\EH ' ( ~ 1 ' 9 ~ ) qenq S E

yslrpe

3u!n!lris q q n a s ruef eS11 lausolselq

!suedryaal !urel~%uxu uep

Sueqw~ylaq

3ue.i

nyaq

o!Jqrua !uap

qeIWnC -(%SLZb) 65 U R P ( % s ' c ~ ) EP P ' l V P C

~runl-jnm~aq

u~y~~svq~p

3ue.i ollqlua ! M a p

qel

wnC

'Su!ll~lds-!p

ZueL

~t.92~ o!~quus

I

uep nqsq

o!Jqiua

E Z

1-18a-2 [3qPL ~ p e d

ueq!fcs!p nqaq

u ~ p

1e3rrs u!Jqula

uey~un53uaw

uciuap

otlqura

Xu:u!t~!lds U U C I I S I ? ~ J J ~ ~ ~

NVSVHVUNIrj NVCJ I I S V C I

-5tr111tjOi sahod Llr:I>I>\ iuri erue(as: dnpiy

[as

i(r?lu11-1!'

uep Ix>~t~~sr:ILl !si~eclc.+a.>l inlqojorl

'~q31

U\!I:I~:JJ~.IY .o!lqura ylr)u>q niru.i u!lqwa

!wap

I-~O~OJJOLIJ dl'pc~~~l

u~y1iyq!p riel~:u~cdund --J,S'YC nyrls eppd o i l ;

'02

~ r > l c q ~ ~ q u ! I(IUIF?P rs~q~i~u!!p I I U P ucl ~ru~ny ~ ! p s u ~

uv;-iunp !~n.~!p Xur~~!jrls [ ! s v q uuqlua

luau

'(1 ~eqru~:))

isor);)

ON~IU.IOH ~ J I U uey~udr:l~p qel-71 Zuei apoiaul i~eduap !arlsas ue.jllyellp n!Jqrua &i!~rrlds

. U E ~ ~ I [ J U . I L I

!nietu !~3erlac uvljeunS!p

SUE,<

a[qe!.i o!~quta-ot~qura

e,Crrcq uep

ue[

p z

eiuelas

Jnilnq!p 'ueyl!emp

qeial

SueL nyaq o~tr.~ ur o!lqiua

(l

IleSas 0 q . t u!

ides o!lqtua

( 1 :nl!eiC Srirrttjds ynlun

uoqeun9!p

%ucX

o!~qurg

'=[qoydon uap

~ 3 1

!1vqwaq ~iuyn11tsq~31 ( E

tlaosolselq

rsuedsyaar

! p ~ f ~ a i (2 lo!~qu~a J~I~UPI~ ueJnqn

ueyequrrrusd

~ e d e p ~ a i ( 1 :inylJaq 11r3eqns !I!n-!r!3 !y![!maru

4ueA

o!Jqura yqEpe

sexing under field mndi;ions. Theriogenology 56: 1383- SUZUKI. T., C. S U M A ~ I , KHAN NHA,

M.

MURAKAM~ and S .

1392. SAIIA. 1999. Develonrnent of simale protable carbon

.

-

dioxide incubalor for in vitro production of bovine MCEVOY, T.G.. I. JOHFI, ROBINSON and D.S. UvrN. 2001.

embryos. Anim. Reprod. Sci. 54: 149- 157. D e v e l o ~ n i e n i i ~ l consequences o f

embwo

and cell

rnanipuiation in micz farm animals. - ~ e ~ r o d u c t i o n

UDY,

G.B. 1987. Commercial splininp of goat embryos

122: 507-5 18. Theriogenology 28: 837-842.

NC)FMAN, H . D . , T.1. LAWLOR and J.R. WRIGHT. 2002. UTSUMI,

K.

clan A. IRITAM. 1990. Pn,duction o r cartlc

Perromance of holskin clones in the United States. identical twins by splitting b!asl~cysls using a metal

R o d on Agriculture and Natural Resources. National microblade. Theriogenology 33: 341.

Rcscarc h Counc~l Online: http://www.

nationaIacademies.org/banr/Animal hiatechnology. WILLADSEN, S.M. 1979. A m e h d fur culture of

html. (5 l u n i 7004) micrornanipula~ed shccp embryos and its use to producc

monoxygotic twins h'arvre 277 298-300 NOWSIIAW, M.A. and W. HOLTZ. 1993. Transfer uf split goat

...

!8olio~cins

-p. uwp !)u,wu/n~ '!pn!jas ' y~

3 0 ~

nqns

aped

ueuadlu!iCuad

a w l a s

%u![up s!~u!p!p!d3 eazoleurrad~ sn)![enx

...

9!1"YJ

_"Y

PUD !,DM!

P!A

'A