UJI EFEK ANTIFERTILITAS SERBUK UMBI LAPIS
BAWANG PUTIH (Allium sativum L.) PADA TIKUS
JANTAN (Rattus novergicus) GALUR Sprague Dawley
SECARA IN VIVO DAN IN VITRO
SKRIPSI
MAHARANI PRATIWI
NIM : 1111102000062
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
UJI EFEK ANTIFERTILITAS SERBUK UMBI LAPIS
BAWANG PUTIH (Allium sativum L.) PADA TIKUS
JANTAN (Rattus novergicus) GALUR Sprague Dawley
SECARA IN VIVO DAN IN VITRO
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi
MAHARANI PRATIWI
NIM : 1111102000062
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
Judul : Uji Efek Antifertilitas Serbuk Bawang
Putih (Allium Sativum L.) Pada Tikus Jantan (Rattus Novergicus) Galur Sprague Dawley Secara In Vivo Dan
In Vitro
Bawang putih (Allium sativum L.) merupakan salah satu tanaman yang dapat mengganggu steroidogenesis. Steroidogenesis adalah pembentukan hormon steroid, salah satunya hormon testosteron. Gangguan yang terjadi pada steroidogenesis dapat menyebabkan infertilitas. Penelitan ini bersifat eksperimental. Hewan uji tikus Sprague Dawley jantan dibagi menjadi lima kelompok yaitu kelompok kontrol, dosis 50 mg/kgBB, dosis 100 mg/kgBB, dosis 150 mg/.kgBB dan uji spermisidal. Serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) diberikan selama 30 hari. Parameter antifertilitas yang dilakukan adalah konsentrasi testosteron, konsentrasi spermatozoa dan uji aktivitas spermisidal. Analisa data paired t-test sample menunjukkan terdapat penurunan
secara tidak signifikan (p≥0,05) pada dosis 50 mg/kgBB dan dosis 150 mg/kgBB
dan terjadi peningkatan konsentrasi testosteron dosis 100 mg/kgBB secara tidak
signifikan (p≥0,05) pada hari ke-31 dibandingkan hari ke-0. Penurunan dan peningkatan konsentrasi testosteron masih dalam rentang normal. Hasil analisa menggunakan ANOVA menunjukkan konsentrasi spermatozoa pemberian serbuk umbi lapis bawang putih pada ketiga dosis meningkat secara signifikan (p≤0,05) terhadap kontrol. Aktivitas spermisidal serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) memiliki konsentrasi minimum spermisidal (MEC) 250 mg/ml. Berdasarkan data diatas pemberian serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) selama 30 hari tidak menyebabkan infertilitas.
Major : Pharmacy
Title : Study of Antifertility Effect of Bulbs Garlic Powder (Allium sativum L.) in Male Sprague Dawley Rats
(Rattus novergicus) In Vivo and In Vitro
Garlic (Allium sativum L.) is a plant which can disrupt the steroidogenic process. Steroidogenic was steroid hormone formed, one of example is testosterone hormone. The disrupted of steroidogenic could result the infertility. This is an experimental research. Sprague Dawley rats divided into five groups include to control groups, dose 50 mg/kgBB, dose 100 mg/kgBB, dose 150 mg/kgBB and spermicidal test. Bulbs Garlic (Allium sativum L.) powder was given for 30 days. The antifertility parameters are testosterone concentration, sperm concentration and spermicidal activity. Paired t-test sample analysis show a no significant
(p≥0,05) decreased at dose 50 mg/kgBB and dose 150 mg/kgBB and no significant increased (p≥0,05) at dose 100 mg/kgBB on the 31th day compared to 0 day. Those decreasing and increasing of testosterone hormone still in normal range. ANOVA analysis result the sperm concentration of bulbs garlic (Allium sativum L) powder increase significantly (p≤0,05) against control group. Spermicide avtivity of garlic (Allium sativum L.) has the minimum effect concentration (MEC) of spermicide at 250 mg/mL. According to the result above, garlic (Allium sativum L.) given along 30 days hasn’t affect the infertility.
Alhamdulillahirabbil’alamin, segala puji bagi Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat, taufik dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan penelitian dan menyusun skripsi dengan judul “Uji Efek Antifertilitas Serbuk Umbi Lapis Bawang Putih (Allium sativum L.) pada
Tikus Jantan (Rattus novergicus) Galur Sprague Dawley secara In Vivo dan
In Vitro”. Shalawat serta salam penulis curahkan kepada junjungan kita Nabi Muhammad SAW beserta keluarga, para sahabat serta kita sebagai umatnya.
Penulis menyadari bahwa dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak akan terwujud tanpa adanya bantuan, bimbingan, dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis mengucapkan terimakasih kepada :
1. Drs. Arif Sumantri, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Drs. Umar Mansur, M.Sc selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Imu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta periode 2012/2015.
3. Yardi, Ph.D., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
4. Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Sc., Apt dan Dr. Azrifitria, M.Si., Apt sebagai dosem pembimbing yang dengan sabar telah memberikan banyak masukan, bimbingan dan dukungan kepada penulis.
5. Ayahanda tercinta Triyatmanto dan ibunda tercinta Sudaryati yang selalu memberikan kasih sayang, semangat, dukungan baik moril maupun materi serta doa yang tak terhingga di setiap langkah penulis.
6. Adikku tersayang Aditya Permana Putra yang telah menyemangati dan membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
Noviany dan Tia Monica atas kebersamaan, bantuan dan motivasi sejak awal hingga terselesaikannya skripsi ini.
9. Teman-teman yang sudah membantu selama proses penelitan dan skripsi Brasti Eka P., Sry Wardiyah, Puspita, Rhesa Ramadhan, Sutar, M. Syahid Ali, M. Haidar, Evi Nurul. H, Athiyah, Sheila, Fathiyah, Iches dan teman-teman di laboratorium PBB.
10.Teman-teman Farmasi 2011 ABCD atas persaudaraan, kebersamaan telah membantu penulis baik selama pengerjaan skripsi ini maupun dibangku perkuliahan.
11. Kak Eris, Kak Tiwi, Kak Lisna dan Mbak Rani sebagai laboran Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah membantu mempersiapkan alat dan bahan selama penelitian.
12.Semua pihak yang telah membantu selama penelitian dan penyelesaian skripsi baik secara langsung maupun tidak langsung yang namanya tidak dapat penulis sebutkan satu per satu.
Semoga Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas semua bantuan dan dukungan yang diberikan. Akhir kata, penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna dan banyak kekurangan. Oleh karena itu, saran serta kritik yang membangun sangat diharapkan. Semoga skripsi
ini bermanfaat bagi penulis dan pembaca. Amin Ya Rabbal’alamiin.
Ciputat, Juni 2015
Halaman
HALAMAN JUDUL ... ii
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ... iii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iv
HALAMAN PENGESAHAN ...v
1.5 Manfaat Penelitian ...5
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ...6
2.1 Bawang Putih (Allium sativum) ...6
2.1.1 Sejarah dan Sinonim ...6
2.1.2 Klasifikasi ...7
2.1.3 Morfologi dan Ekologi...8
2.1.4 Varietas ... 10
2.1.5 Kandungan Bahan Aktif ... 10
2.1.6 Kegunaan dan Khasiat ... 12
2.2 Klasifikasi Tikus Putih ... 12
2.2.1 Karakterisitik Tikus Putih Galur Sprague Dawley ... 13
2.3 Sistem Reproduksi Tikus Jantan ... 15
2.3.1 Spermatogenesis ... 17
2.3.2 Spermatozoa ... 19
2.3.3 Pengaturan Spermatogenesis ... 20
2.4.3 Sandwich Assay ... 25
2.4.4 Kit ELISA ... 25
2.5 Preparasi Bawang Putih ... 26
2.5.1 Homogenat Bawang Putih Kasar ... 26
2.5.2 Serbuk bawang putih ... 26
2.5.3 Aged Garlic Extract ... 26
2.5.4 Minyak Bawang Putih... 26
BAB 3 METODE PENELITIAN ... 28
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 28
3.2 Alat dan Bahan ... 28
3.2.1 Alat Penelitian ... 28
3.2.2 Bahan Penelitian ... 28
3.2.3 Hewan Uji ... 29
3.3 Rancangan Penelitian ... 29
3.3.1 Besar Sempel ... 29
3.3.2 Dosis Perlakuan ... 29
3.4 Prosedur Kerja ... 31
3.4.1 Penyiapan Serbuk umbi lapis bawang putih ... 31
3.4.2 Penapisan fitokimia ... 31
3.4.3 Pengukuran Parameter Spesifik dan Nonspesifik... 33
3.4.4 Penyiapan Hewan Coba ... 35
3.4.5 Pengukuran Parameter ... 35
3.5 Analisis Data ... 38
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 40
4.1 Hasil Penelitian ... 40
4.1.1 Determinasi Tanaman ... 40
4.1.2 Pembuatan Serbuk umbi lapis bawang putih ... 40
4.1.3 Penapisan Fitokimia Serbuk ... 40
4.1.4 Pengujian Parameter Serbuk ... 41
4.1.5 Pengukuran Konsentrasi Testosteron ... 42
4.1.6 Perhitungan Konsentrasi Spermatozoa ... 44
4.1.7 Uji Aktivitas Spermisidal ... 45
Tabel 1 Komposisi utama bawang putih ... 11
Tabel 2 Komposisi Bawang Putih pada masing-masing sediaan ... 12
Tabel 3 Data biologis tikus ... 14
Tabel 4 Rancangan Penelitian ... 30
Tabel 5 Pengenceran yang dilakukan dan kotak yang dihitung ... 35
Tabel 6 Cara Pengenceran ... 36
Tabel 7 Rumus Konsentrasi Spermatozoa ... 37
Tabel 8 Hasil Penapisan Fitokimia Serbuk umbi lapis bawang putih ... 41
Tabel 9 Hasil Pengujian Parameter Spesifik dan Non Spesifik ... 42
Tabel 10 Hasil Perhitungan Konsentrasi Testosteron ... 43
Tabel 11 Hasil Perhitungan Konsentrasi Spermatozoa ... 44
Gambar 2.1 Daun, Bunga, dan Umbi Alium sativum ...9
Gambar 2.2 Sistem Urogenital Tikus Jantan tampak Ventral ... 16
Gambar 2.3 Siklus Spermatogenesis pada Tikus ... 19
Gambar 2.4 Gambar Spermatozoa perbesaran 400x ... 19
Gambar 2.5 Foto Mikrograf Sperma Normal ... 20
Gambar 2.6 Konversi Hormon Testosteron ... 22
Gambar 2.7 Competitive assay format ... 23
Gambar 2.8 Keterangan-keterangan bagian-bagian gambar... 23
Gambar 2.9 Non competitive assay format ... 24
Gambar 2.10 Capture/ sandwich assay ... 25
Gambar 4.1 Kurva rerata konsentrasi testosteron ... 43
Gambar 4.2 Kurva rerata konsentrasi spermatozoa ... 44
Gambar 4.3 Grafik persentase motilitas ... 46
Gambar 4.4 Reaksi pembentukan pigmen biru pada bawang putih kasar ... 49
Gambar 5.1 Bawang putih (Allium sativum L.) ... 75
Gambar 5.2 Penimbangan umbi lapis bawang putih ... 75
Gambar 5.3 Penghancuran umbi lapis bawang putih ... 75
Gambar 5.4 Proses freeze dry ... 75
Gambar 5.5 Penggerusan bawang putih dengan mortar dan alu ... 75
Gambar 5.6 Serbuk umbi lapis bawang putih ... 75
Gambar 5.7 Serbuk umbi lapis bawang putih di dalam wadah penyimpanan 75 Gambar 5.8 Penimbangan serbuk umbi lapis bawang putih ... 75
Gambar 5.9 Suspensi serbuk umbli lapis bawang putih ... 75
Gambar 5.10 Pemeliharaan tikus ... 76
Gambar 5.11 penimbangan tikus ... 76
Gambar 5.12 Penyondeaan pada tikus kelompok uji ... 76
Gambar 5.13 Hewan uji dikorbankan... 76
Gambar 5.14 Pembedahan hewan uji ... 76
Gamabr 5.15 Kauda epididimis ... 76
Gambar 5.16 Pengambilan darah dari vena lateral ekor... 77
Gambar 5.17 Pengambilan darah secara cardiac puncture ... 77
Gambar 5.18 Serum darah yang belum dipisahkan ... 77
Gambar 5.19 Pengambilan serum dengan mikropipet ... 77
Gambar 5.24 Proses pembuangan isi well ... 77
Gambar 5.25 Penambahan wash solution ... 78
Gambar 5.26 Penambahan substrate solutin pada masing-masing well ... 78
Gambar 5.27 Penambahan stop solution pada masing-masing well ... 78
Gambar 5.28 Pembacaan ELISA dengan ELISA reader ... 78
Gambar 5.29 Spermatozoa dikeluarkan dari kauda ... 78
Gambar 5.30 Spermatozoa diambil dan diletakan di kamar hitung neubauer . 78 Gambar 5.31 Pengamatan spermatozoa untuk menentukan pengenceran ... 78
Gambar 5.32 pengenceran spermatozoa dengan larutan George ... 79
Gambar 5.33 Spermatozoa yang telah diencerkan di masukan ke neubauer ... 79
Gambar 5.34 Perhitungan spermatozoa di dalam kotak sesuai pengenceran ... 79
Gambar 5.35 Spermatozoa dikeluarkan dari kauda tikus ... 79
Gambar 5.36 Seri konsentrasi serbuk umbi lapis bawang putih ... 79
Gambar 5.37 Pengamatan motilitas dibawah mikroskop ... 79
Lampiran 1. Surat Determinasi Bawang Putih (Allium sativum L.). ... 70
Lampiran 2. Surat Keterangan Sehat Hewan Uji ... 71
Lampiran 3. Alur Penelitian ... 72
Lampiran 4. Alur Kerja Uji Antifertilitas ... 73
Lampiran 5. Perhitungan Dosis Serbuk umbi lapis bawang putih... 74
Lampiran 6. Gambar Kegiatan Penelitian ... 75
Lampiran 7. Penapisan Fitokimia Serbuk umbi lapis bawang putih ... 80
Lampiran 8. Parameter Susut Pengeringan, Kadar Abu, dan Kadar Air... 82
Lampiran 9. Hasil Pengukuran Berat Badan Tikus ... 83
Lampiran 10. Pengukuran Konsentrasi Testosteron ... 85
Lampiran 11. Analisa Statistik Data Konsentrasi Testosteron ... 87
Lampiran 12. Hasil Perhitungan Konsentrasi Spermatozoa ... 94
Lampiran 13. Analisa Statistik Data Konsentrasi Spematozoa ... 95
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan RI mengestimasi jumlah penduduk Indonesia tahun 2013 sejumlah 248,4 juta orang yang terdiri atas jumlah penduduk laki-laki 125.058.484 jiwa dan penduduk perempuan 123.364.472 jiwa. Diperlukan kebijakan untuk mengatur atau membatasi jumlah kelahiran agar kelahiran dapat dikendalikan dan kesejahteraan penduduk makin meningkat (Kemenkes RI, 2014). Kebijakan untuk mengatur kelahiran anak disebut keluarga berencana (KB).
Satu misi program KB nasional yaitu meningkatkan upaya pemberdayaan perempuan dalam mewujudkan kesetaraan dan keadilan gender dalam program KB (Badan Perencanaan Pembangunan Nasional (BAPPENAS, 2002)). Program yang mendorong partisipasi pria untuk ber-KB telah dilakukan selama beberapa tahun, namun penggunaan metode kontrasepsi ini masih rendah yang terdiri dari kondom pria dan senggama terputus (2%), dan 1% menggunakan pantang berkala. Tingkat penggunaan sterilisasi pria masih kurang dari 1% ((Badan Kependudukan Dan Keluarga Berencana Nasional) BKKBN, 2013). Metode kontrasepsi untuk pria kurang diminati masyarakat karena dianggap kurang praktis, harganya cukup mahal, mengurangi sensasi dan pilihan alat kontrasepsi pria yang tersedia saat ini tidak banyak (Anggraeni, 2007).
Obat Tradisional (OT) merupakan salah satu warisan budaya bangsa Indonesia yang telah digunakan selama berabad-abad untuk pemeliharaan dan peningkatan kesehatan serta pencegahan dan pengobatan penyakit (Menkes RI, 2009). Kecenderungan pola hidup kembali ke alam (back to nature) menyebabkan masyarakat lebih memilih menggunakan obat alami yang diyakini tidak memiliki efek samping seperti obat kimia, dan harga lebih terjangkau daripada obat sintetik (Hernani, 2011).
didominasi oleh komponen organosulfur dan komponen non-sulfur yang memberikan karakteristik pada rasa dan berkontribusi pada berbagai kesehatan (Amagase, 2006; Butt et al, 2009). Umbi bawang putih di Indonesia digunakan sebagai bumbu masakan, mengobati tekanan darah tinggi, gangguan pernafasan, sakit kepala, ambeien, sembelit, insomnia, kolesterol, flu, dan gangguan saluran kencing (Thomas, 2000; Rukmana, 1995). Penelitian mengenai aktivitas bawang putih pada sistem reproduksi memiliki hasil yang beragam. Beberapa peneliti mengatakan bawang putih (Allium sativum L.) memiliki aktivitas antifertilitas dan sebagian peneliti mengatakan bawang putih (Allium sativum L.) dapat memperbaiki kemampuan fertilitas pada pria.
Penelitian yang memiliki hasil berlawanan dengan pernyataan diatas adalah penelitian Al-Bekairi (1990) dengan pemberian ekstrak air bawang putih (Allium sativum L.) 100 mg-1 kg-1 hari-1 selama 3 bulan meningkatkan berat vesika seminalis, berat epididimis dan konsentrasi spermatozoa. Penelitian yang dilakukan oleh Oi (2001) menggunakan serbuk bawang putih sebanyak 0,8g/100 g pada makanan tikus selama 28 hari meningkatkan testosteron di dalam testis secara signifikan.
Sistem reproduksi pria, terutama testis melakukan dua fungsi dan pengaturan yang sangat penting bagi kelangsungan hidup yaitu spermatogenesis dan steroidogenesis. Bawang putih (Allium sativum L.) merupakan salah satu tanaman yang dapat menggangu steroidogenesis. Steroidogenesis merupakan proses biologis dimana steroid dihasilkan dari kolesterol dan ditransformasi menjadi steroid lain, seperti hormon testosteron. (Ogbuewu, 2011). Dalam kutipan Hammami (2012), penelitian yang dilakukan oleh Dixit & Joshi (1982) juga menunjukkan adanya reduksi kolesterol yang merupakan prekursor hormon testosteron. Pemberian serbuk bawang putih (Allium sativum L.) tersebut diasumsikan dapat mempengaruhi steroidogenesis.
Berdasarkan pemaparan di atas penulis tertarik untuk meneliti lebih lanjut serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) terhadap aktivitas antifertilitas karena bentuk serbuk merupakan salah satu sediaan bawang putih yang banyak digunakan dan adanya hasil yang beragam pada penelitian sebelumnya. Penelitian yang dilakukan menggunakan bawang putih lokal untuk meneliti potensinya terhadap sistem reproduksi pria, sehingga dilakukan penelitian “Uji Efek Antifertilitas Serbuk Umbi Lapis Bawang Putih (Allium sativum L.) pada Tikus jantan Galur Sprague Dawley secara In Vivo dan In Vitro” dengan parameter penelitian konsentrasi testosteron,
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan diatas maka rumusan masalah penelitian uji efek antifertilitas serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) pada tikus jantan (Rattus novergicus) galur Sprague Dawley secara in vivo dan in vitro sebagai berikut :
1.2.1 Apakah pemberian serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum
L.) mempengaruhi sistem hormon testosteron tikus jantan?
1.2.2 Apakah pemberian serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum
L.) memberikan aktivitas antifertilitas dilihat dari penurunan konsentrasi spermatozoa?
1.2.3 Apakah serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) memiliki aktivitas spermisidal secara in vitro?
1.3 Tujuan Penelitian
Penelitian uji efek antifertilitas serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) pada tikus jantan (Rattus novergicus) galur Sprague Dawley secara in vivo dan in vitro bertujuan untuk :
1.3.1 Mengukur pengaruh pemberian serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) terhadap kadar konsentrasi testosteron tikus jantan.
1.3.2 Menguji efek antifertilitas pemberian serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) terhadap konsentrasi spermatozoa tikus jantan. 1.3.3 Menentukan Minimum Effect Concentration (MEC) aktivitas
spermisidal sebuk bawang putih (Allium sativum L.) secara in vitro.
1.4 Hipotesis
Hipotesis dari uji efek antifertilitas serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) pada tikus jantan (Rattus novergicus) galur Sprague Dawley secara in vivodan in vitro sebagai berikut :
1.4.2. Pemberian serbuk umbi lapis bawang putih (Allium sativum L.) pada tikus jantan galur Sprague Dawley secara in vivo dapat menurunkan konsentrasi spermatozoa.
1.4.3. Pemberian bawang putih lokal (Allium sativum L.) pada tikus jantan galur Sprague Dawley memiliki aktivitas spermisidal secara in vitro.
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat penelitan “Uji Efek Antifertilitas Serbuk Umbi Lapis Bawang Putih (Allium sativum L.) pada Tikus Jantan (Rattus novergicus)
Galur Sprague Dawley secara In Vivo dan In Vitro” memberikan sajian
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Bawang Putih (Allium sativum)
2.1.1 Sejarah dan Sinonim
Bawang putih, Allium sativum L. adalah anggota dari famili Liliaceae/Alliaceae/Amaryllidaceae (Tyagi, 2013), yang diterima sebagai salah satu bumbu masakan yang sangat berharga dan obat yang populer untuk berbagai penyakit dan gangguan fisiologi. Nama bawang putih berasal dari bahasa Skotlandia (Celtis) “all” yang artinya tajam (Londhe et al., 2011). Secara praktik pembudidayaan dilakukan di seluruh dunia, bawang putih tampaknya berasal dari Asia Tengah kemudian menyebar ke China, ke daerah timur dan daerah Mediterania sebelum berpindah ke arah barat menuju Eropa Tengah dan Eropa Selatan, Afrika Utara (Mesir) dan Meksiko (Vinay et al., 2008).
Bawang putih telah digunakan selama ribuan tahun untuk tujuan pengobatan. Kitab Sanskrit menunjukkan kegunaan dalam pengobatan sekitar 5.000 tahun yang lalu dan telah digunakan untuk setidaknya selama 3.000 tahun dalam pengobatan China. Mesir, Babylonia, Yunani dan Roma menggunakan bawang putih untuk tujuan penyembuhan. Pada tahun 1858, Pasteur menemukan aktivitas antibakterial dan hal ini digunakan sebagai antiseptik untuk mencegah terjadinya gangren selama Perang Dunia I dan Perang Dunia II (Londhe et al., 2011).
terutama, para tentara dan budak. Penduduk Cina dan Korea sudah biasa memanfaatkan bawang putih sebagai obat dan pengusir roh jahat (Banerjee dan Maulik, 2002; Yarnell, 1999; Hernawan, 2003)
Masuknya tanaman bawang putih ke wilayah Indoensia belum ditemukan data atau keterangan yang rinci dan pasti, namun diduga terjadi pada abad 10 bersamaan dengan arus lalu lintas perdagangan antar-negara ke Indonesia, terutama para pendatang atau pedagang dari India dan Cina (Rukmana, 2009). Sehingga bagi bangsa Indonesia bawang putih merupakan tanaman introduksi (Santoso, 2000).
2.1.2 Klasifikasi
Tanaman bawang putih mempunyai nama lain Allium sativum. Dalam sistematika (taksonomi) tumbuhan, kedudukan tanaman bawang putih diklasifikasikan sebagai berikut :
Kingdom : Plantae (tumbuh-tumbuhan) Divisi : Spermatophyta (tumbuhan berbiji) Sub-divisi : Angiospermae (berbiji tertutup)
Kelas : Monocotyledonae (biji berkeping satu) Ordo : Liliales (Liliflorae)
Famili : Liliaceae/Alliaceae/Amaryllidaceae
Genus : Allium
Spesies : Allium sativum L. (Rukmana,2009; Tyagi, 2013)
Pada awal klasifikasi angiosperma, Allium diletakan pada famili Liliaceae. Kemudian, mereka lebih sering termasuk ke dalam
Amaryllidaceae karena dasar struktur inflorosens. Pada hampir kebanyakan taksonomik terkini dan kompeten dari monokotiledon,
Allium relatif dekat dikenali sebagai famili Alliaceae, dekat dengan
2.1.3 Morfologi dan Ekologi
Tanaman ini memiliki beberapa nama lokal, yaitu Dason putih (Minangkabau), bawang bodas (Sunda), bawang (Jawa Tengah), bhabang poote (Madura), kasuna (Bali), lasuna mawura (Minahasa), bawa badudo (Ternate), dan bawa fiufer (Irian Jaya) (Santoso, 2000; Heyne, 1987; dalam Hernawan, 2003). Bawang putih merupakan tanaman herba parenial yang membentuk umbi lapis. Tanaman ini tumbuh secara berumpun dan berdiri tegak sampai setinggi 30-75 cm. Batang yang nampak di atas permukaan tanah adalah batang semu yang terdiri dari pelepah-pelepah daun. Sedangkan batang yang sebenarnya berada di dalam tanah. Dari pangkal batang tumbuh akar berbentuk serabut kecil yang banyak dengan panjang kurang dari 10 cm. Akar yang rumbuh pada batang pokok bersifat rudimenter, berfungsi sebagai alat penghisap makanan (Santoso, 2000)
Bawang putih membentuk umbi lapis berwarna putih. Sebuah umbi terdiri dari 8-20 siung (anak bawang). Antara siung satu dengan yang lainnya dipisahkan oleh kulit tipis dan liat, serta membentuk satu kesatuan yang kuat dan rapat. Di dalam siung terdapat lembaga yang dapat tumbuh menerobos pucuk siung menjadi tunas baru, serta daging pembungkus lembaga yang berfungsi sebagai pelindung sekaligus gudang persediaan makanan. Bagian dasar umbi pada hakikatnya adalah batang yang mengalami rudimentasi (Hernawan, 2003).
tersusun atas 3 ruangan, buah kecil berbentuk kapsul loculicidal (Hernawan, 2003).
Bawang putih yang semula merupakan tumbuhan daerah dataran tinggi, sekarang di Indonesia, jenis tertentu dibudidayakan di dataran rendah. Bawang putih berkembang baik pada ketinggian tanah berkisar 200-250 meter di atas permukaan laut.Syarat tumbuh :
Iklim
o Ketinggian tempat : 600 m – 1.200 m
o Curah hujan tahunan :800 mm- 2.000 mm/tahun o Bulan basah (diatas 100 mm/bulan) : 5 bulan – 7 bulan o Bulan kering (di bawah 60 mm/bulan) : 4 bulan – 6 bulan o Suhu udara : 150 0C – 2000C
o Kelembapan : tinggi
o Penyinaran „: sedang Tanah
o Jenis tanah : gromiosol (ultisol)
o Tekstur : lempung berpasir (gembur)
o Drainase : baik
o Kedalaman air tanah : 50 cm -150 cm dari permukaan tanah o Kedalaman perakaran: diatas 15 cm dari permukaan tanah o Kemasaman (PH) : 6-6,8
o Kesuburan :tinggi (UPT-Balai Informasi Teknologi
LIPI, 2009).
2.1.4 Varietas
Varietas adalah berbagai jenis bawang putih yang mempunyai perbedaan sifat atau ciri yang permanen atau tidak berubah, seperti tinggi-rendahnya tanaman, besar kecilnya umbi, umur panen, jumlah dan ukuran siung, kandungan dalam umbi, daya tahan terhadap penyakit, serta iklim pertumbuhannya.
Secara garis besar, berdasarkan iklim yang dibutuhkan tanaman untuk bisa tumbuh dengan baik, bawang putih dikelompokkan menjadi dua varietas sebagai berikut :
1. Varietas yang bisa tumbuh di dataran tinggi dengan iklim subtropis
2. Varietas-varietas yang mampu beradaptasi atau mampu tumbuh di daerah dataran rendah.
Jenis bawang putih yang banyak ditanam di Indonesia ada tiga varietas yang telah dikenal unggul, yaitu lumbu hijau dan lumbu kuning untuk lahan dataran tinggi serta lumbu putih untuk dataran rendah. Varietas lain yang ada merupakan modifikasi dari ketika varietas tersebut dan diberi nama sesuai dengan daerah asal penanamannya. Diantaranya varietas bawang Cirebon, bawang Tawangmangu, Iiocos dan Filipina, Santong, Sumbawa, Jatibarang, Bogor, obleg, dan varietas lanang (Purwaningsih, 2007).
2.1.5 Kandungan Bahan Aktif (Hammami et al., 2012)
Allisin (Alil 2-propena thiosulfinat atau diallyl thiosulfinat) merupakan bioaktif utama yang ada di dalam ekstrak air atau homogenat bawang putih kasar. Ketika bawang putih dipotong atau dihancurkan, enzim alinase yang terdapat di dalam bawang putih teraktivasi dan bereaksi pada alliin (yang terdapat diseluruh bawang putih) untuk menghasilkan allisin. Komponen sulfur penting lainnya yang terdapat di dalam homogenat bawang putih adalah allyl metil thiosulfonat, 1-propenyl allyl thiosulfonat dan L-glutamyl-S-alkil-L-sistein (Hammami et al., 2012). Komposisi pada masing-masing sediaan bawang putih di tampilkan pada tabel 2.
Beberapa penelitian menyebutkan apabila kandungan dalam bawang putih dapat mengganggu sistem reproduksi pada pria. Fitoestrogen merupakan konstituen yang memiliki efek estrogenik. Salah satu fitoestrogen adalah Allium sativum (Dixon, 2004). Bawang putih telah dilaporkan mengandung dua fitoestrogen; lignan dan quersetin. Substansi yang mirip estrogen menginduksi gangguan secara langsung terhadap sel testis (Hammami et al., 2012). Hal ini dapat diasumsikan bila Allium sativum memiliki kerja mirip estrogen
Komponen Jumlah ( Bawang Putih Segar 1%)
Air 62-68
Karbohidrat (utama fruktosa) 26-30
Protein 1,5-2,1
Asam Amino :umum 1-1,5
Asam Amino ; sistein sulphoxida
0,6-1,9
Γ-Glutamylsistein 0,5-1,6
Lipid 0,1-0,2
Serat 1,5
Senyawa Sulfur total 1,1-3,5
Senyawa larut lemak total 0,15
Senyawa larut ait total 97
pada tikus jantan dewasa yang menginduksi gangguan spermatogenesis (Abdelmalik, 2010). Metabolit bawang putih seperti diallyl sulfida telah dilaporkan memiliki efek spermisidal (Chakrabarti
et al., 2003) serta Allisin yang merupakan komponen bioaktif dari bawang putih menginduksi aktivasi CASP3, CASP8 dan CASP9 dan pembelahan poli (ADP-ribosa) polimerasi pada beberapa sel kanker (Hammami, 2009).
Jus bawang putih kasar Serbuk Bawang
putih
Aged garlic extract Minyak bawang putih
Allisin
2.1.6 Kegunaan dan Khasiat
Berbagai penelitian yang telah dikembangkan untuk mengeksplorasi aktivitas biologi umbi bawang putih yang terkait dengan farmakologi, antara lain sebagai anti-diabetes, anti-hipertensi, anti-kolesterol, anti-atherosklerosis, anti-oksidan, anti-agregasi sel platelet, pemacu fibrinolisis, anti-virus, anti-mikrobia, anti-kanker (Hernawan, 2003).
2.2 Klasifikasi Tikus Putih (Rattus novergicus)
Tikus merupakan nama umum untuk sejumlah anggota dari famili rodentia. (Krinke, 2000). Menurut Krinke, klasifikasi tikus putih (Rattus novergicus) adalah :
Filum : Chordata Kelas : Mammalia Order : Rodentia Suborder : Myomorpha
Famili : Muridae Subfamili : Murinae Genus : Rattus Spesies : R. novergicus
2.2.1 Karakterisitik Tikus Putih Galur Sprague Dawley
Tikus putih memiliki beberapa sifat yang menguntungkan sebagai hewan uji penelitian di antaranya perkembangbiakan cepat, mempunyai ukuran yang lebih besar dari mencit, mudah dipelihara dalam jumlah banyak, tikus putih juga memiliki ciri-ciri morfologis seperti albino, kepala kecil, dan ekor yang lebih panjang dibandingkan badannya, pertumbuhannya cepat, temperamennya baik, kemampuan laktasi tinggi, dan tahan terhadap arsenik tiroksid (Akbar, 2010).
Tikus putih (Rattus novergicus) banyak digunakan sebagai hewan percobaan pada berbagai penelitian. Terdapat tiga galur tikus putih yang memiliki kekhususan untuk digunakan sebagai hewan percobaan antara lain Wistar, long evan dan Sprague-Dawley (Malole dan Pramono, 1989).
Penelitian reproduksi secara umum menggunakan tikus galur
Sprague Dawley dan Wistar. Kedua strain ini merupakan hasil turunan hubungan jauh (outbreed) yang memiliki fertilisasi yang tinggi dan sifat perkawinan yang konsisten (Wilkinson et al., 2000).
Lama hidup 2-3 tahun, dapat sampai 4 tahun
Lama produksi ekonomis 1 tahun
Lama bunting 20-22 hari
Umur dewasa 40-60 hari
Umur dikawinkan 8-10 minggu (jantan dan betina)
Siklus kelamin Poliestrus
Siklus estrus (berahi) 4-5 hari
Lama estrus 9-20 jam
Perkawinan Pada waktu estrus
Ovulasi 8-11 jam sesudah timbul estrus, spontan
Fertilisasi 7-10 jam sesudah kawin
Implantasi 5-6 hari sesudah fertilisasi
Berat dewasa 300-400 g jantan;250-300 g betina
Suhu (rektal) 36-39 C (rata-rat 37,5 C)
Pernapasan 65-115/menit, turun menjadi 50 dengan
anestesi, naik sampai 150 dalam stres
Denyut jantung 330-480/menit, turun menjadi 250
dengan anestesi, naik sampai 550 dalam
stres
Tekanan darah 90-180 sistol, 60-145 diastol, turun
menjadi 80 sistol, 55 diastol dengan
anestesi.
Konsumsi oksigen 1,29-2,60 ml/g/jam
Sel darah merah 7,2-9,6 x 106/mm3
Sel darah putih 5,0-130 x 103/mm3
SGPT 17,5-30,2 IU/liter
SGOT 45,7-80,8 IU/liter
Kromosom 2n-=42
Aktivitas Nokturnal (malam)
Konsumsi makanan 15-30 g/hari (dewasa)
Konsumsi minuman 20-45l/hari (dewasa)
2.3 Sistem Reproduksi Tikus Jantan
Tikus merupakan salah satu hewan yang digunakan untuk penelitian terbanyak pada fisiologi reproduksi. Tikus juga bermanfaat pada penilaian toksikologi yang merusak saluran pencernaan. Testis pada jantan menggantung terpisah di dalam kantung sktorum yang berdinding tipis yang letaknya diantara anus dan preputium. Testis kemudian turun antara hari ke-10 dan ke-40 masa hidupnya dari rongga perut ke kantung skrotum melalui kanalis inguinal terbuka. Jarak dubur kelamin pada tikus jantan lebih jauh daripada betina (Suckow, 2006).
Testis terdiri dari tubulus seminiferus yang panjang dan berkelok-kelok, yang pada epitelnya merupakan tempat berlangsungnya spermatogenesis. Ujung dari tubulus seminiferus ini kemudian bermuara menuju epididimis. Arteri testikular dan pampiniferom venus plexus dikelilingi saat mereka memasuki kanal inguinal. (Fawcett, 2002). Duktus deferen disuplai pembuluh darah yang berbeda dan mengalir secara proksimal melalui kanal inguinal dan melewati ureter untuk memasuki urethra (Fawcett, 2002).
Epididimis mengandung tiga bagian: kaput epididimis yang membesar pada ujung proksimal pada testis, yang hampir seluruhnya terbenam ke dalam lemak; korpus epididimis yang terdapat disekitar dorsomedial testis serta kauda epididimis pada ujung distal testis, merupakan tempat pematangan spermatozoa, yang kemudian bermuara ke vas deferens (Suckow, 2006).
Pada hewan yang melakukan fertilisasi secara interna organ reproduksiya dilengkapi dengan adanya organ kopulatori, yaitu suatu organ yang berfungsi menyalurkan spermatozoa dari organisme jantan ke betina. Peranan hewan jantan dalam hal reproduksi terutama adalah memproduksi spermatozoa dan sejumlah kecil cairan untuk memungkinkan sel spermatozoa masuk menuju rahim (William, 2005). Penis menggantung di dalam preputium yang longgar dengan tulang kartilago tunggal (Suckow, 2000).
2.3.1 Spermatogenesis
Istilah spermatogenesis meliputi seluruh urutan kejadian proliferatif dan perubahan sitologis dari sel germinal awal pria, spermatogonia, menjadi spermatozoa matang (Fawcett, 2002). Spermatogenesis memerlukan suatu seri kelompok dimana spermatozoa dihasilkan melalui tahap mitosis, meiosis, dan diferensiasi sel untuk menjadi spermatozoa matang. Perubahan morfologi dari spermatid menjadi spermatozoa disebut dengan spermiogenesis. Selanjutnya spermatozoa dilepaskan ke dalam lumen tubulus. Proses pelepasan tersebut dikenal dengan proses spermiasi (Ilyas, 2007).
Sel germinal primodial telah berhenti bermigrasi dikelilingi oleh sel Sertoli dan membran basal yang menonjol di dalam tubulus seminiferus pada saluran seksual jantan. Sel kelamin jantan tetap tidak aktif sampai sebelum masa pubertas, yaitu dimana sekitar 50 hari setelah kelahiran. Pada tahap itu terjadi pembelah dan menjadi spermatogonium, dan kemudian membelah sampai hewan kehilangan kemampuan untuk memproduksi sperma (Krinke, 2000).
akrosom, selama akrosom berkembang. Kondensasi inti dan perpanjangan terjadi berikutnya, diikuti oleh fase eliminasi dan pelepasan sitoplasma (Krinke, 2000).
Pada tikus, 14 tahap siklus spermatogenik terjadi di dalam tubulus seminiferus. Tubulus memiliki susunan ruas, dan setiap potongan melintang tubula menunjukkan tahapan yang seragam yang melibatkan empat atau lima generasi di sel germinal dengan sesuai. Tubulus seminiferus di tikus dikarakterisasi oleh struktur ruas, sedangkan pada manusia dan hewan domestik lainnya biasanya menunjukkan pola mosaik di beberapa tahap. Pada tikus, dibutuhkan 12 hari untuk menyelesaikan satu siklus yang terdiri dari 14 tahap. Spermatogonium tikus membutuhkan empat siklus sampai akhirnya membentuk spermatozoa, sehingga diperlukan 48 hari untuk menyelesaikan seluruh tahap spermatogenesis (Krinke, 2000).
2.3.2 Spermatozoa
Proses pembentukkan sperma di dalam testis disebut spermatogenesis. Spermatozoa di tikus lebih lama daripada jenis mamalia lainnya, termasuk manusia dan hewan dosmetik lainnya (Setchell, 1984), dan rata-rata memiliki panjang 150-200 mm pada tikus. Bentuk kepala sperma tikus terlihat seperti bentuk kail, seperti pada tikus lainnya (Krinke, 2000)
Gambar 2.4 Gambar spermatozoa perbesaran x 400
(Rat Sperm Morphological Assesment, Guideline Document Ed. 1. Oktober, 2000)
Gambar 2.3 Siklus spermatogenesis pada tikus
Tahap siklus sel dalam spermatogenesis tikus dimulai se arah jarum jam dari kiri bawah A,spermatogonium tipe A; In, spermatogonium tipe intermediate, B, spermatogonium tipe B; R, resting spermatosit primer; L, Leptotene spermatosit; Z, zygotene spermatosit; P (I), P (VII), P(XII), awal, pertengahan dan akhir spermatosit pakiten. Angka romawi menunjukkan tahap siklus dimana mereka ditemukan; DI, diplotene; II, spermatosit sekunder; 1 – 19, langkah-langkah spermiogenesis. Tabel di tengah memberikan komposisi cellular tahapan siklus epitel seminiferus(I – XIV). M superscript
2.3.3 Pengaturan Spermatogenesis
Proses spermatogenesis di dalam tubulus seminiferus diatur dengan berbagai pengaruh internal dan eksternal (Holstein, 2003). Proliferasi dan diferensisasi sel germinal pria dan pengaturan mekanisme spermatogenesis secara intratestikular dan ekstratestikular dapat diganggu pada setiap tahapnya (Holstein AF, 1988). Hal ini dapat terjadi akibat pengaruh lingkungan atau penyakit yang secara langsung atau tidak langsung mempengaruhi spermatogenesis (Nieschlag, 2001; Holstein AF, 1994). Perbedaan senyawa nutrisi, terapi, obat, hormon dan metabolitnya, senyawa toksik atau radiasi sinar-x dapat mengurangi atau mengganggu spermatogenesis (Holstein, 2003).
a. Pengaturan Intrinsik
Sel Leydig di dalam celah intratubular mensekresikan testosteron dan senyawa tambahan neuroendokrin dan faktor pertumbuhan. Hormon-hormon, transmitter dan faktor pertumbuhan tersebut diarahkan menuju sel Leydig, pembuluh darah dan lamina propia tubulus seminiferus dan sel Sertoli. Mereka terlibat dalam menjaga trofik sel Sertoli dan jaringan sel peritubular, mempengaruhi kontraktilitas dari miofibroblas
dan dalam mengatur pergerakan peristaltik tubulus seminiferus dan transportasi spermatozoa (Holstein, 2003).
b. Pengaruh Ekstrinsik
Pengaturan spermatogenesis secara setempat di dalam testis memerlukan stimulus ekstratestikular yang didapatkan dari hipotalamus dan hipofisis. Sekresi gonadotropin relasing hormone (GnRH) dari hipotalamus menginisiasi pelepasan hormon lutrinzing (LH) dari hipofisis. Sebagai hasilnya sel Leydig menstimulasi untuk memproduksi testosteron. Testosteron tidak hanya mempengaruhi spermatogenesis di dalam tubulus seminiferus testis tapi juga didistribusi ke seluruh tubuh dan memberikan timbal balik ke hipofisis yang berhubungan dengan aktivitas sel Leydig. Stimulasi sel Sertoli oleh hormon follicle stimulating hormone (FSH) penting untuk pematangan sel germinal. Sel Sertoli sendiri mensekresikan inhibin timbal balik yang diarahkan ke hipofisis. Pengaruh ekstratestikular merupakan dasar penting untuk fungsi pengaturan secara intratestikular (Holstein, 2003).
2.3.4 Peran Hormon Pada Spermatogenesis
Spermatogenesis dikendalikan oleh sekresi gonadotropin, yaitu sekresi Folicle Stimulating Hormone (FSH) dan produksi testosteron oleh Luteinizing Hormone (LH) (Muslim Akmal dkk, 2011).
a. Folicle Stimulating Hormone (FSH)
b. Hormon Testosteron
Testosteron dan metabolitnya, dihidrotestosteron (DHT) dan estradiol (E2) merupakan hormon reproduksi. Hal ini karena peran utama mereka dalam regulasi gonad dan perkembangan sel germinal di pria dan wanita seperti pada diferensiasi seksual pada pria (Holdcraft, 2004).
Gambar 2.6 Konversi Hormon Testosteron (Goodman & Ghilman, Ed. 11th Online Edition, 2005)
c. Luteinizing Hormone (LH)
Hormon LH disekresikan melalui kelenjar anterior pituitari, menstimulasi sel Leydig untuk mensekresikan testosteron (Guyton, 2010).
2.4 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Teknik non kompetitif ini dibagi menjadi dua yaitu sandwich dan indirect. Pemeriksaan hormon menggunakan teknik kompetitif dan sandwich (Kricka, 1999; Ashihara, 2001).
2.4.1 Competitive Assay Format
Competitive assay format adalah kombinasi sejumlah analit yang tidak diketahui yang diperkenalkan dari sampel dan analit referensi berkompetisi untuk berikatan pada daerah ikatan antibodi (antibody binding sites) yang jumlahnya terbatas.
Antibodi
dengan
spesifiksitas
yang
bervariasi
Antigen dengan
Epitop yang
bervariasi
Protein untuk
blokade daerah
ikatan non
spesifik
streptavidin Enzim Gambar 2.7Competitive Assay Format (Technical Guide for ELISA, 2013)
Pada gambar 2A menunjukkan, analit sampel yang ditambahkan berkompetisi dengan solid phase adsorbed analit referensi (kit) untuk mengikat antibodi berlabel dalam jumlah yang terbatas. Pada gambar 2B menjelaskan, analit referensi yang berlabel dalam larutan dikombinasi dengan analit sampel berkompetisi untuk mengikat solid phase adsorbed antibody dalam jumlah yang terbatas. Jika penjenuhan antibodi terjadi, penambahan sedikit jumlah sampel kompetitor tidak akan memberikakan efek pada perubahan aktivitas deteksi. Dengan demikian sensitivitas
competitive assay bergantung pada daerah ikatan antibodi yang lebih sedikit dibandingkan jumlah daerah analit referensi. Ini menyediakan kuantisasi yang paling akurat dari berbedanya format yang ada. Karena terbatasnya jumlah antibodi yang dapat digunakan, sensitivitas pada format ini secara ketat dibatasi oleh afinitas interaksi antara antibodi dan analit.
2.4.2 Non competitive Assay Format
Non competitiveassay adalah format pengujian dimana daerah ikatan antibodi yang ada lebih dari jumlah analit yang dideteksi sehingga format non kompetitif ini yang paling sensitif.
2.4.3 Sandwich Assay
Prinsip dasar dari sandwich assay adalah sampel yang mengandung antigen direaksikan dengan antibodi spesifik pertama yang terikat dengan fase padat. Selanjutnya ditambahkan antibodi spesifik kedua yang berlabel enzim dan ditambahkan substrat dari enzim tersebut (Asihara, 2001).
Keuntungan metode ELISA yaitu : 1. Cukup Sensitif
2. Reagen relatif murah dan dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama
3. Dapat memeriksa beberapa parameter sekaligus 4. Peralatan mudah didapat
5. Tidak menggunakan zat radiasi (Asihara, 2001) Kerugian metode ELISA :
1. Pemeriksaan menggunakan enzim sebagai label cukup kompleks karena aktivitas enzim dipengaruhi oleh berbagai faktor (Asihara, 2001).
2.4.4 Kit ELISA
Kit ELISA testosteron adalah fase padat enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) dengan prinsip competitive binding.
Sumuran mikrotiter dilapisi secara langsung dengan antibodi monoklonal tikus untuk sisi antigen unik pada molekul testosteron. Testosteron endogen dari sampel hewan uji berkompetisi dengan semacam testosteron
konjugat peroksidase untuk berikatan dengan lapisan antibodi. Setelah inkubasi konjugat yang tidak terikat dihilangkan. Jumlah dari ikatan konjugat peroksidase adalah berbanding terbalik terhadap konsentrasi testosteron sampel. Setelah penambahan larutan substrat, intensitas warna berkembang berbanding terbalik dengan konsentrasi dari sampel hewan uji.
2.5 Preparasi Bawang Putih
2.5.1 Homogenat Bawang Putih Kasar
Homogenat bawang putih dibuat dari umbi bawang putih yang telah dikupas kemudian dihancurkan di dalam blender dengan sejumlah volume air destilasi. Campuran ini kemudian dibiarkan selama 30 menit pada suhu 250C. Homogenat bawang putih kasar diperloleh setelah disaring melalui kain flanel (Kasuga et al., 2001)
2.5.2 Serbuk umbi lapis bawang putih
Untuk mendapatkan serbuk umbi lapis bawang putih, umbi bawang putih terlebih dahulu dipotong, dihancurkan, didehidrasi dan dipulverisasi menjadi bentuk serbuk. Bentuk ini merupakan salah satu bentuk yang digunakan sebagai suplemen makanan. Kandungan sulfur di dalam bentuk kasar bawang putih dan serbuk umbi lapis bawang putih adalah Alliin. Dehidrasi yang sempurna (dengan minimum kehilangan) menghasilkan 2-2,5 mg aliin g-1 dari serbuk umbi lapis bawang putih (Iberl et al, 1990 dalam Hammami, 2012).
2.5.3 Aged Garlic Extract
2.5.4 Minyak Bawang Putih
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2015 hingga Mei 2015. Pembuatan serbuk umbi lapis bawang putih dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia UIN Syarif Hidayatullah dan Laboratorium Fitokimia Universitas Indonesia, pemeliharaan dan perlakuan hewan uji di Animal House (AH), pengamatan terhadap parameter dilakukan di laboratorium penelitian II, laboratorium Kultur dan MPR UIN Syarif Hidayatullah dan pengujian skrining fitokimia dilakukan di laboratorium kimia obat Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender, freeze dry, timbangan analititk (AND GH-202 dan Wiggen Hauser), erlenmeyer, beaker glass, spatula, corong gelas, tabung reaksi, pipet tetes, cawan penguap, botol timbang, kurs silikat, oven (Memmert), tanur (Thermo Scientific), alumunium foil, timbangan, kandang tikus beserta tempat makanan dan minuman, sonde oral,
syringe, wadah pembiusan, alat bedah minor, kaca objek dan cover glass, mikropipet (Eppendorft Research plus), Eppendorf tube, centrifuge, vortex, mikroskop cahaya (Motic dan Epson), Hemositometer improved Neubauer (NESCO), freezer, waterbath,
desikator, kit ELISA dan ELISA reader, corong pisah dan destilasi.
3.2.2 Bahan Penelitian
a. Bahan Uji
Sebelum dilakukan penelitian, bawang putih terlebih dahulu dideterminasi di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor untuk memastikan kebenaran bahan uji.
b. Bahan Kimia
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah aquades dan NaCMC untuk preparasi suspensi serbuk umbi lapis bawang putih, pereaksi untuk penapisan fitokimia (HCL 2N, pereaksi Bouchardat, pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, Metanol, Eter, etanol 95%, HCL pekat, NaOH 10%, FeCl3 1%,
serbuk Mg, Amil Alkohol, H2SO4 pekat, Etanol 70%, Kloroform,
asetat anhidrat, Toulena p.a). Penyiapan sperma (normal saline water); larutan George;NaCl fisiologis; dan larutan Baker’s buffer
glukosa 3%; Na2HPO4 2H2O 0,31%; NaCl 0,2%; KH2PO4 0,01%).
3.2.3 Hewan Uji
Hewan uji yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jantan strain Sprague Dawley yang sehat dan fertil berumur 2,5-3 bulan (10 minggu) dengan berat badan 200-300 gram yang diperoleh dari Animal Facility and Modeling Provider Institut Pertanian Bogor (IPB).
3.3 Rancangan Penelitian
3.3.1 Besar Sampel
Penelitian ini bersifat eksperimental yang terbagi dalam 5 kelompok perlakuan yang masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus jantan strain Sprague Dawley (WHO, 1993). Hewan uji yang digunakan sebanyak 25 ekor tikus.
3.3.2 Dosis Perlakuan
penghambatan fase spermatosit primer. Dosis pada penelitian merupakan peningkatan dosis yang mengacu pada penelitian Dixit & Joshi, maka dosis yang digunakan 50 mg/kgBB, 100 mg/kgBB dan 150 mg/kgBB. Waktu perlakuan dilakukan selama 30 hari. Penelitian mengenai aktivitas pemberian pakan bawang putih kasar dapat memodifikasi testikular tikus jantan dilakukan selama satu bulan (Hammami, 2009).
Darah dari vena lateral ekor (testosteron Serum) pada
hari ke-0 dan ke-31 Sperma dikeluarkan dari
kauda epididimis
Darah dari vena lateral ekor (testosteron Serum) pada
Darah dari vena lateral ekor (testosteron Serum) pada
hari ke-0 dan ke-31 Sperma dikeluarkan dari
kauda epididimis
Darah dari vena lateral ekor (testosteron Serum) pada
hari ke-0 dan ke-31 Sperma dikeluarkan dari
kauda epididimis
- Sperma dikeluarkan dari kauda epididimis
3.4 Prosedur Kerja
3.4.1 Penyiapan Serbuk umbi lapis bawang putih
Bawang putih didapatkan dari Tawangmangu, Karang Anyar Jawa Tengah. Sebanyak 749 gram bawang putih segar dikupas kulitnya dan dibersihkan, kemudian dihancurkan menggunakan blender hingga homogen. Hasil bawang putih yang diblender, kemudian dikeringkan menggunakan freeze dry. Bawang putih yang telah kering akan berbentuk bongkahan kering kemudian dihaluskan dengan menggunakan lumpang dan alu hingga di dapatkan serbuk.
3.4.2 Penapisan Fotokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia dan sampel dalam bentuk basah meliputi pemeriksaan kandungan senyawa alkaloida, saponin, flavonoida, terpenoida/steroida, tanin dan minyak atsiri sebagai berikut :
1. Pemeriksaan Alkaloida (Harbone, 1987)
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 gram kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk test alkaloida sebagai berikut :
i. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Bouchardat, reaksi positif ditandai dengan terbentuknya endapan berwarna coklat sampai hitam
ii. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi Dragendorff, reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau jingga
iii. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah 2 tetes pereaksi Mayer, reaksi positif ditandai dengan terbentuknya endapan menggunmpal berwarna putih atau kuning
2. Pemeriksaan Saponin (Depkes, 1995)
kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin. Prosedur yang sama juga dilakukan untuk sampel dalam keadaan basah.
3. Pemeriksaan Tanin (Harbone, 1987)
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 gram, disari dengan 10 ml air suling lalu disaring. Filtrat diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan dengan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida 1%. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin. Prosedur yang sama juga dilakukan untuk sampel dalam bentuk basah.
4. Flavonoid
i. Uji reagen alkali : Sampel ditambahkan larutan NaOH 10%, kemudian akan terbentuk warna kuning intens yang mengindikasikan adanya Flavonoid (Godghate Ashvin et al., 2012). ii. Sejumlah 1 gram serbuk bahan ditambah 100 ml air panas, didihkan selama 5 menit dan disaring, filtrat digunakan sebagai larutan percobaan. Ke dalam 5 ml larutan ditambahkan sedikit serbuk magnesium dan 1 ml HCl pekat. Ditambahkan 5 ml amil-alkohol, dikocok dengan kuat, biarkan hingga memisah. Terbentuk warna dalam larutan amil-alkohol menunjukkan adanya senyawa flavonoid. Warna yang terbentuk orange sampai merah (flavon), merah sampai crimson (flavanol), crimson sampai magenta (flavanon) (Harbone, 1987; Farnsworth, 1966).
5. Steroid dan Triterpenoid (G.C Bag et al., 2013)
penambahan asam sulfat pekat melalui sisi tabung secara hati-hati (tanpa dikocok) menunjukkan adanya terpenoid.
3.4.3 Pengukuran Parameter Spesifik dan Non Spesifik
1. Parameter Spesifik (Depkes RI, 2000)
Identitas ekstrak dengan deskripsi tata nama sebagai berikut : Nama ekstrak
Nama latin tumbuhan (sistemika botani) Bagian tumbuhan yang digunakan Nama Indonesia tumbuhan
Organoleptik diamati menggunakan panca indera untuk mendeskripsikan bentuk, warna, bau, rasa sebagai berikut :
Bentuk : padat, serbuk-kering, kental, cair Warna : kuning, coklat, dll
Bau : aromatik, tidak berbau dll 2. Parameter Non Spesifik
a. Susut pengeringan (Depkes RI, 2000)
b. Kadar abu (Depkes RI, 2000)
Sebanyak 2 gram Serbuk yang telah digerus dan ditimbang secara seksama dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan kemudian ditimbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa kertas dan kertas saring dalam kurs yang sama. Masukan filtrat ke dalam kurs, uapkan. Kemudian dipijarkan hingga bobot tetap, lalu ditimbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
c. Kadar Air (Depkes RI, 2000)
Cara Destilasi : bersihkan tabung penerima dan pendingin dengan asam pencuci, bilasi dengan air, keringkan dalam lemari pengering. Ke dalam labu kering masukkan sejumlah ekstrak yang ditimbang seksama yang diperkirakan mengandung 2 ml sampai 4 ml air. Jika ekstrak berupa ekstrak kental, timbang dalam sehelai lembaran logam dengan ukuran yang sesuai dengan leher labu. Untuk ekstrak yang dapat menyebabkan gejolak mendadak, tambahkan pasir kering yang telah dicuci secukupnya hingga mencukupi dasar labu atau sejumlah tabung kapiler, panjang lebih kurang 100 mm yang salah satu ujungnya tertutup. Masukkan lebih kurang 200 ml toluen ke dalam labu, hubungkan alat. Tuang toluen ke dalam tabung penerima (R) melalui alat pendingin. Panaskan labu hati-hati selama 15 menit.
pendingin tabung penerima, gosok dengan karet yang diikatkan pada sebuah kawat tembaga dan basahi dengan toluen hingga tetesan air turun. Setelah air dan toluen memisah sempurna, baca volume air. Hitung kadar air dalam persen.
3.4.4 Penyiapan Hewan Coba
Tikus jantan galur Sprague-Dawley diaklimatisasidi animal house Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan selama 4 minggu. Diberi makan dan minum ad libitum. Bawang putih (Allium sativum)
kasar diberikan secara oral menggunakan sonde sekali setiap hari selama 30 hari dengan dosis seperti tertera pada tabel rancangan percobaan (Tabel 4).
3.4.5 Pengukuran Parameter
1. Perhitungan konsentrasi spermatozoa
Perhitungan konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara mengambil spematozoa pada kauda epididimis. Spermatozoa yang didapat diletakkan dalam cawan penguap yang berisi cairan NaCl sebanyak 500 µL. Spermatozoa dimasukkan ke dalam kamar Neubauer (Hemasitometer) sampai kamar Neubauer terisi rata. Kemudian dihitung jumlah spermatozoa pada salah satu kamar hitung Neubauer dan selanjutnya ditentukan pengenceran yang akan dilakukan dan jumlah kotak yang akan dihitung (Tabel 5) (Ilyas, 2007)
No. Jumlah
Spermatozoa
dalam 1 kotak
Faktor
pengenceran
Kotak kecil yang
dihitung
1 >40 50 kali 5
2 15-40 20 kali 10
3 <15 10 kali 25
Dari sejumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang terhitung (Ilyas, 2007).
No. Pengenceran Pembuatan Pengenceran
1 50 kali a. 980 µL larutan George + 20 µL
spermatozoa
b. 2.450 µL larutan George + 50 µL
spermatozoa
2 20 kali 950 µL larutan George + 50 µL spermatozoa
3 10 kali a. 900 µL larutan George + 100 µL
spermatozoa
b. 450 µL larutan George + 50 µL
spermatozoa
Setelah pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai dengan jumlah spermatozoa dan cara pengenceran pada tabel 5. kemudian dilakukan pengukuran konsentrasi spermatozoa sesuai dengan rumus di bawah ini (Ilyas, 2007).
Keterangan:
n : jumlah spermatozoa yang dihitung 10.000 : volume kamar hitung Neubauer Fp : faktor pengenceran
25 : total kotak kecil yang terdapat dalam kamar hitung Neubauer
k : kotak kecil yang dihitung pada saat pengamatan Tabel 6. Cara Pengenceran
Konsentrasi Spermatozoa = n x 10.000 x Fp x 25
vNaCl : volume NaCl fisiologis (ml) yang digunakan untuk membantu mengeluarkan spermatozoa (juta/ml) dapat terlihat dari tabel 7 berikut.
No. Jumlah kotak
yang dihitung
Rumus konsentrasi Spermatozoa
1 5 n x 10.000 x 50 x 5 x 0,5
2 10 n x 10.000 x 20 x 2,5 x 0,5
3 25 n x 10.000 x 10 x 1 x 0,5
2. Konsentrasi hormon testosteron
Selama 30 hari tikus diberikan perlakuan dengan cara memberikan serbuk bawang putih peroral. Pada hari ke-0 dan ke-31 dilakukan pengambilan darah melalui vena lateral ekor sebanyak 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tube. Setelah 24 jam dari perlakuan terakhir, berat tikus yang terakhir dicatat. Darah dikumpulkan. Serum dipisahkan dengan cara sentrifugasi pada 3000 g selama 10 menit dan disimpan pada -200C sampai digunakan untuk
assay biokimia (Krishna, 2012).
Prosedur pengukuran kadar testosteron menggunakan kit ELISA, larutan standar, kontrol dan sampel, dipipet masing-masing sebanyak 25 uL ke dalamwells. Enzyme conjugate dipipet sebanyak 200 uL ke dalam setiap wells ,kemudian dicampurkan selama 10 detik. Hal yang penting adalah tahap pencampuran hingga selesai. Campuran tersebut kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruangan (tanpa menutup plate), wells kemudian digoyangkan dengan cepat. Wells diteteskan dengan wash solution (400 uL per well), wells
diletakan di atas kertas penyerap untuk menghapus sisa tetesan.
Substrate solution sebanyak 200 uL ditambahkan ke dalam wells. Setelah itu diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruangan. Penghentian reaksi enzimatik dilakukan dengan penambahan stop solution sebanyak 100uL ke dalam setiap wells. Tentukan nilai
absorbansi setiap wells pada 450 ± 10 nm dengan microtitter plate reader waktu yang direkomendasikan untuk membaca nilai absorbansi setiap wells adalah 10 menit setelah penambahan stop solution.
(DRG® Testosterone (Rat) ELISA, 2013).
3. Aktivitas Spermisidal
Aktivitas spermisidal ditentukan dengan menggunakan versi modifikasi dari protokol asli (Sander dan Metode Cramer) yang mengukur konsentrasi minimum zat spermisida yang dibutuhkan untuk membunuh 100% sperma dalam 20 detik. Tikus yang digunakan adalah tikus yang fertil. Tikus kemudian dikorbankan untuk mengambil kauda epididimis kemudian semen dikumpulkan dan diinkubasi dengan normal saline water untuk uji in vitro dari sperma tikus. Sperma yang digunakan memiliki motilitas (≥50%) dan konsentrasi sperma (≥ 20 juta/ml) (Ashish Ranjan, Singth, 2013).
Uji serbuk umbi lapis bawang putih dilakukan pada berbagai konsentrasi (150, 170, 190, 210, 230 dan 250 mg/ml) yang dicampurkan ke dalam suspensi sperma yang mengandung 1 juta sperma. Campuran tersebut diamati dibawah mikroskop selama 20 detik di perbesaran 10 X dan dicatat motilitas sperma. Konsentrasi dicatat jika ada sperma motil yang terlihat. Lalu 250 uL buffer ditambahkan ke semua campuran dan diinkubasi pada suhu 37oC selama minimal 60 menit. Larutan tersebut perlahan-lahan di vortex dan diamati lagi setiap sperma yang motil. Konsentrasi dicatat sebagai hasil yang efektif jika kedua tes menunjukkan tidak adanya sperma motil. Titik akhir adalah konsentrasi terendah dari serbuk umbi lapis bawang putih yang menyebabkan imobilisasi semua sperma dalam 20 detik pencampuran (Ashish Ranjan Singth, 2013).
3.5 Analisa Data
program pengolahan data statistik SPSS 16 yang meliputi uji normalitas, uji homogenitas, uji parametrik (one-way ANOVA) dan uji paired sample t-test. Jika hasil dari uji ANOVA maupun paired sample t-test menunjukkan perbedaan yang nyata (p≤0,05) maka
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. HASIL PENELITIAN
4.1.1. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman uji adalah benar tanaman bawang putih (Allium sativum L) suku Amaryllidaceae.
Surat pernyataan hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 1. 4.1.2. Pembuatan Serbuk umbi lapis bawang putih
Sebanyak 749 gram bawang putih segar dilakukan pengupasan kulit dan dibersihkan dengan air mengalir. Bawang putih yang sudah bersih dihaluskan dan dihancurkan menggunakan blender. Bawang putih (Allium sativum) yang sudah halus kemudian dikeringkan untuk dijadikan serbuk dengan cara freeze dryer di Laboratorium Fitokimia Universitas Indonesia, Depok. Hasil freeze dry Bawang Putih berupa bongkahan kemudian di haluskan dengan lumpang dan alu untuk didapatkan serbuk umbi lapis bawang putih. Serbuk umbi lapis bawang putih yang digunakan untuk percobaan adalah 80 gram.
4.1.3. Penapisan Fitokimia Serbuk
Tabel 8.Hasil Penapisan Fitokimia Serbuk umbi lapis bawang
putih
Penapisan Fitokimia Uji Hasil Keterangan
Alkaloid
Terpenoid Uji Salkowski
Positif
Warna coklat
kemerahan di
lapisan interfase
Steroid Uji Salkowski
Positif Warna merah pada lapisan bawah
4.1.4. Pengujian Parameter Serbuk
Tabel 9. Hasil Pengujian Parameter Spesifik dan Non Spesifik
Parameter Hasil
Spesifik 1. Identitas Serbuk
a. Nama latin tumbuhan b. Bagian tumbuhan yang digunakan sesuai dengan farmakope herbal Indonesia (2009) yaitu tidak lebih dari 10%. Kadar abu serbuk umbi lapis bawang putih melebihi batas farmakope herbal yaitu tidak lebih dari 3,0%. Menurut keputusan menteri kesehatan Republik Indonesia tentang persyaratan obat tradisional (1994), kadar air serbuk adalah tidak lebih dari 10% sehingga serbuk umbi lapis bawang putih yang digunakan sesuai dengan ketentuan.
4.1.5. Pengukuran Konsentrasi Testosteron
pengukuran konsentrasi testosteron. Hasil pengukuran konsentrasi testosteron dapat dilihat pada tabel 10 dan grafik pada gambar 4.1
Tabel 10. Hasil Perhitungan Konsentrasi Testosteron
Kelompok Uji Konsentrasi Testosteron (ng/mL) ± SD
Hari Ke-0 Hari Ke-31
Kontrol 6,88 ± 0,831 7,26 ± 1,073
Dosis 50 mg/kgBB 6,39 ± 1,921 3,08 ± 1,715
Dosis 100mg/kgBB 2,86± 0,473 2,99 ± 1,309
Dosis 150 mg/kgBB 2,25 ± 0,392 1,80 ± 0,195
Terdapat penurunan konsentrasi testosteron pada kelompok dosis 50 mg/kgBB dan dosis 150 mg/kgBB dan peningkatan konsentrasi testosteron pada kelompok kontrol dan dosis 100 mg/kgBB.
Gambar 4.1. Kurva Rerata Konsentrasi Testosteron
Berdasarkan hasil pengamatan terdapat penurunan konsentrasi testosteron pada kelompok dosis 50 mg/kgBB dan dosis 150 mg/kgBB pada hari ke-31, serta terjadi peningkatan pada kelompok kontrol dan dosis 100 mg/kgBB pada hari ke-31. Penurunan dan peningkatan yang terjadi pada kelompok uji masih berada di dalam rentang konsentrasi testosteron normal. Data hasil
perhitungan kemudian diolah secara statistik dengan uji paired sample t-test untuk membandingkan hasil konsentrasi testosteron sebelum dan sesudah pengujian.
Hasil varian menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi testosteron yang terjadi tidak berbeda secara signifikan (p≥0,05). Hal ini menunjukkan jika pemberian serbuk umbi lapis bawang putih tidak mempengaruhi sistem hormonal dan menjaga konsentrasi testosteron pada rentang normal. Data hasil analisa statistika dapat dilihat pada lampiran 11.
4.1.6. Perhitungan Konsentrasi Spermatozoa
Data hasil perhitungan konsentrasi spermatozoa dapat dilihat pada tabel 4.5 dan grafik pada gambar 11.
Tabel 11. Hasil Perhitungan Konsentrasi Spermatozoa
Kelompok Konsentrasi Spermatozoa (Juta/mL) ± SD
Kontrol 11,93 ± 0,305
Dosis 50 mg/kgBB 18,80 ± 3,751*
Dosis 100 mg/kgBB 22,63 ± 2,490*
Dosis 150 mg/kgBB 22,13 ± 1,881*
Keterangan : angka yang diikuti tanda * berbeda secara signifikan (p≤0,05) terhadap kelompok kontrol
Terdapat peningkatan konsentrasi spermatozoa pada kelompok dosis 50 mg/kgBB, dosis 100 mg/kgBB dan dosis 150mg/kgBB dibandingkan kontrol.
