Semisintesis senyawa brusatol hasil isolasi dari ekstrak metanol buah makasar Brucea javanica L. (Merr) sebagai antitumor

No .Kontrak LPPM-UGM/1143 /2009

Bidang llmu Kesehatan

Klaster Kesehatan dan Kedokteran

LAPORAN AKH1R KEG1ATAN PENELITIAN

HIBAH UNTUK MAHASISWA PROGRAM DOKTORTAHUN ANGGARAN 2009

Semisintesis senyawa brusatol hasil isolasi dari ekstrak metanol buah makasar Brucea javanica L. (Merr) sebagai antitumor

Nama Penelrti: Drs. Sonlimar Mangunsong, Apt. MKes

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS GADJAH MADA

2009

LAPORAN EKSEKUTIF Summary

Semisintesis senyawa brusatol hasil isolasi dari ekstrak metanol buah makasar

Bruceajavanica L. (Merr)sebagai antitumor 1Sonlimar Mangunsong

Promoter -.Prof.lwan Dwiprahasto, M.MedSc.PhD Co-Promotor : 1Prof. Dr. Mustofa, Apt;2 Prof. Jumina, PhD

1. Permasalahan dan Tujuan Penelitian

Kanker merupakan salah satu masalah utama kesehatan di dunia. Selain

menjadi penyebab utama kematian penyakit kanker juga memberi implikasi biaya yang sangat tinggi. Meskipun berbagai terapi kanker selalu dikembangkan setiap

waktu, baik meialui pembedahan, radioterapi dan kemoterapi tingkat keberhasilan terapi relatif masih rendah. Keterbatasan terapi kanker dengan obat modern umumnya adalah masalah keamanan karena hampir semua obat kanker selain membunuh sel kanker juga menimbulkan kerusakan bahan

kematian pada sel sel tubuh yang normal. Harga obat kanker yang sangat mahal juga menjadi kendala dalam upaya menurunkan morbiditas dan mortalitas penderita. Oleh sebab itu perlu perlu dikembangkan upaya untuk menemukan

bahan aktif baru antitumor dari tanaman yang tumbuh di bumi Indonesia, selain memiliki khasiat antitumor yang baik, sensitrf dan spesifik juga tersedia dengan

harga yang terjangkau.

Penelitian ini dilakukan untuk memperoleh isolat brusatol dan analog dari bjji buah makasar (B. javanica) sebagai antitumor. Selanjutnya dilakukan upaya semisintesis dengan senyawa pereaksi benzoil klorida, asetil klorida dan butanoil klorida. Penelitian ini dibagi menjadi 3 tahap.Tahap I dilakukan maserasi dan ekstraksi metanol biji buah makasar, kemudian difraksinasi dengan pelarut heksan.dan diklorometan. Pada Tahap II dilakukan isolasi brusatol dari fraksi diklorometan, dimurnikan dengan methanol dan kolum dan selanjutnya dilakukan upaya semisintesis terhadap brusatol analog yang ditemukan dengan senyawa

pereaksi benzoil klorida, asetil klorida dan butanoil klorida. Diharapkan dapat

diperoleh senyawa produk semisintesis. Dimurnikan dan dielusidasi strukturnya dengan spektroskopi IR. UV, NMR dan MS. Tahap III Melakukan uji antitumor.

Hipotesis yang akan dibuktikan adalah dapat dilakukan isolasi brusatol analog dari biji buah makasar. Dapat dilakukan semisintesis brusatol analog dengan senyawa pereaksi.

Tujuan Penelitian: Isolasi kuasinoid dari btji B.javanica dan kajian semisintesis sebagai antitumor.Hasil yang diharapkan dapat diperoleh senyawa produk semisintesis turunan brusatol yang memungkinkan menambah efek sitotoksik dan antitumor senyawa tersebut terhadap sel kanker yang menggunakan bahan alam dari Indonesia. Pengembangan metode isolasi untuk mendapatkan brusatol analog serta diperoleh produk semisintesis menjadikan hasil penelitian ini memiliki potensi untuk mendapatkan hak atas kekayaan intelektual (HAKI) seperti halnya obat kanker vinkristin juga berasal dari bahan alam yang berasal

dari bumi Indonesia.

2. Inovasi IPTEK

a. Kontribusi terhadap pembaharuan dan pengembangan ipteks

Pelaksanaan Riset dilakukan dengan menggunakan dana DIPA UGM NOMOR: LPPM-UGM/1143/2009 TANGGAL, 19 Mei 2009. Penelitian dilakukan di

Laboratorium Biologi Farmasi Fakuttas Farmasi dan Laboratorium Kimia Oganik FMIPA UGM. Isolasi dan pemumian dilakukan di Laboratorium Farmasi.

Semisintesis dilakukan di laboratorium Kimia FMIPA. Riset ini telah dimulai

sejak Januari 2009 sampai dengan saat ini. Masing-masing dibantu oleh teknisi.

Pengembangan merupakan kegiatan ilmu pengetahuan dan teknologi yang bertujuan memanfaatkan kaidah dan teori ilmu pengetahuan yang telah terbukti kebenarannya untuk meningkatkan fungsi, manfaat, dan aplikasi ilmu pengetahuan dan teknologi yang telah ada, atau menghasilkan teknologi baru.

Bagi Indonesia, pengembangan obat berbasis teknologi maju, masih merupakan jalan panjang yang hams ditempuh meskipun teknologi isolasi merupakan salah satu prioritas nasional dalam kebijakan strategi riset obat. Selain memeriukan

biaya mahal dan waktu panjang, kemampuan nasional dalam konteks dana dan prasarana masih perlu ditingkatkan. Penelitian ini paling tidak memiliki keutamaan-keutamaan penelitian dalam pengembangan keilmuan yaitu sebagai berikut: (1) secara metodologis penelitian adalah penting (2) secara konseptual keilmuan penelitian ini penting karena mengungkapkan bukti-bukti iimiah dan aktivitas sitotoksik. (3) secara praktis penelitian ini juga penting karena memiliki dampak yang luas dalam pengembangan tanaman obat

antikanker di Indonesia.

Dalam penelitian ini dilakukan isolasi suatu senyawa menuju semisintesis. Metode isolasi yang digunakan merupakan modrfikasi dari metode yang sudah dilakukan Sakaki et a/., 1986. Harapan ke depan, agen produk tersebut sangat berpeluang juga untuk dipatenkan dari tanaman obat potensiai asli Indonesia. Seperti B. Javanica perlu diperhatikan dan dipercepat penanganananya karena pesatnya persaingan di bidang fitofarmaka dan obat seperti ketertinggalan Indonesia selama ini, mengingat masih besarnya potensi kekayaan alam Indonesia yang masih belum digali. Penemuan suatu senyawa dalam jumlah cukup sebagai senyawa penuntun sangat diperlukan untuk pengembangan semisintesis.

Bahan utama biji Bmcea javanica diperoleh dari wilayah perkebunan Sragen, Jawa tengah. Sesuai dengan surat keterangan simplisia dari pihak distributor. Bahan kimia dan Pereaksi diperoleh dari Distributor Jogjakarta.

Pemeriksaan struktur kimia dan sifatnya menggunakan spektroskopi UV, IR,

NMR dan MS dilakukan di Laboratorium Kimia. Ketika Alat di Laboratorium Kimia

mendapat perbaikan, maka pemeriksaan kimia dilakukan ke LIPI Serpong Tangerang. Seperti pemeriksaan LC-MS tidak dapat dilakukan di Laboratorium Kimia FMIPA. Pemeriksaan uji sitotoksik dilakukan di laboratorium parasitologi FK UGM. Menggunakan sel HeLa.

Semisintesis sampai saat ini belum selesai dilakukan, karena keterbatasan dan keterlambatan bahan-bahan pereaksi. Selain itu isolasi bahan brusatol analog masih terus dilakukan sampai diperoleh jumlah yang cukup.

Harapan kedepan dengan ditemukannya senyawa brusatol analog dengan data

ilmiah yang lengkap dapat menjadi sediaan marker kuasinoid dan referensi baru terhadap tumbuhan B.javanica yang berasal dari Indonesia.

b. Perluasan cakupan penelitian

Dari hasil penelitian ini akan diperoleh senyawa kristal kuasinoid utama brusatol analog dari tumbuhan B.javanica asal Indonesia. Sebagai bahan dasar untuk penelitian lebih lanjut sebagai antitumor maupun antimalaria. Pada penelitian antitumor akan diuji secara invitro aktivitas sitotoksik terhadap beberapa sel uji ( Mieloma, Sel HeLa, MCF-7) yang mewakili sel epitel dan sel tumor solid. Kemudian dikaji toksisitasnya dengan sel nonnal. Kemudian dikaji

mekanisme molekulernya dengan melihat aktivitas apoptosis, ekspresis p53, Bcl2 dan Bax sebagai bagian dari penelitian untuk melihat target molekul sebagai antitumor. Meialui pemurnian isolate serta melakukan upaya semisintesis dalam rangka mendapatkan senyawa yang lebih selektif sebagai antimalaria ataupun antikanker.Dari beberapa penelitian ada hubungan senyawa kuasinoid family simaroubaceae sebagai antimalaria dan antitumor. Disamping itu upaya perlu pembudidayaan tumbuhan B.javanica oleh pihak terkait dalam meningkatkan nilai ekonomi masyarakat sehingga memperoleh nilai tambah dari bahan tumbuhan B.javanica. Penelitian selanjutnya dapat juga dilakukan untuk menentukan kandungan kuasinoid total dari tanaman Indonesia sebagai standar sebagai antimalaria maupun antikanker.

c.Hasil yang Diperoleh

Telah dilakukan isolasi dari biji buah makasar sebanyak 7 kg dengan cara maserasi dengan methanol. Kemudian dilanjutkan dengan fraksinasi heksan dan diklorometan. Selanjutnya dimurnikan dengan KLT dan Kolom menggunakan eluasi kombinasi etil asetat, toluene, methanol dan kloroform. Sehingga diperoleh kristal amorf putih kekuningan. Dari 7 Kg bahan diperoleh kristal putih kekuningan sebanyak 750 miligram.

Hasil yang diperoleh adalah senyawa brusatol analog dan telah dilakukan pemeriksaan dan analisis struktur terhadap kristalnya sebagai berikut:

Analisis spectrum massa terhadap kristal yang diperoleh tidak memungkinkan dilakukan dengan GC-MS, karena pada pemeriksan awal terhadap titik lebur sudah mencapai 261-263 °C. Dengan titik lebur yang sudah sangat tinggi tidak memungkin untuk dilakukan GC-MS. Dari hasil analisis LC-MS diduga kuat merupakan senyawa kuasinoid, dengan jumlah atom karbon 23- 26. Fragmen peak ion pada m/z tertinggi diperoleh 523,04 dan 540,04 dengan metode DEPT

diekspresikan empat atom karbon yang terdeteksi. Pada analisis 13C NMR

Ditemukan gugus karbonil-enone yang khas, gugus lakton, gugus karboksi metil.

Tidak ditemukan gugus piranosa dengan melakukan reaksi hidrolisis terhadap kristal kuasinoid dengan asamsulfat 10%. Tidak ditemukannya gugus benzoil

dengan melihat analisis 13C NMR yang khas pada benzoil tidak ditemukan.

Pemeriksaan FTIR diperoleh gugus OH, Karbonil, Metoksi dan C=C yang khas.

Pada Pemeriksaan UV diperoleh resapan maksimal pada panjang gelombang 205 dan 280 nm. Pada Pemeriksaan titik lebur diperoleh hasil 261-263 °C. Dari referensi data senyawa yang diperoleh sangat mirip dengan data senyawa brusein A, MR 522,548; Titik lebur 267-270 °C. Data LC-MS, FTIR, TL dan UV mendukung terhadap senyawa tersebut. Hasil uji pendahuluan terhadap uji sitotoksik telah dilakukan menggunakan sel HeLa dengan nilai IC50 < 50 uM inkubasi 24 jam.

Semisintesis terhadap brusatol analog belum selesai dilakukan karena keterbatasan bahan dan pereaksi yang dibutuhkan.

d.Hambatan

Hambatan-hambatan yang ditemukan dalam penelitian ini adalah proses pelaksanaan semisintesis belum dilalkukan. Belum diperoleh perbandingan konsentrasi yang tepat dalam persamaan reaksi dan kondisi yang optimum.

Disamping itu metode pemurnian optimum dari brusatol analog belum ditemukan dalam referensi termasuk harga Rf masing-masing senyawa.

3. Kontribusi Terhadap Pembangunan

Meialui penelitian ini telah diperoleh senyawa brusatol analog sebagai hasil penelitian isolasi zat aktif dari biji buah makasar sebagai tumbuhan asli dari bumi Indonesia. Hal ini menjadi penting untuk diketahui sebagai informasi ilmiah untuk para peneliti selanjutnya dalam melakukan isolasi kuasinoid dari B.javanica asal Indonesia wilayah tumbuh Jawa Tengah. Dari analisis data

spektra didapat senyawa kuasinoid Analog brusatol yaitu Brusein A dengan formula C2e H 34 On. Berat molekul 522,548. Disamping itu telah dilakukan kajian aktivitas sitotoksik terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 <50 ug/mL yang setara dengan dosis 1,25 ug/mL doksorubisin sebagai antitumor.

Hasil penelitian dapat dijadikan sebagai referensi awal terhadap sediaan simplisia B.javanica. Data Brusein A yang diperoleh dapat dijadikan sebagai referensi terhadap kandungan zat aktif dalam biji B javanica sebagai anti kanker asal Indonesia. Penerapan teknologi dapat mempercepat proses pencapaian hasil isolasi dan semisintesis kearah penemuan senyawa produk brusatol analog sebagai antitumor.

Hasil penelitian ini juga dapat dikembangkan dan berpotensi mendapatkan HAKI dalam hal metode melakukan isolasi dan hasil hasil isolate berupa brusein A dari tumbuhan Indonesia. Juga berpotensi untuk dikembangkan menjadi produk frtofarmaka sebagai antitumor alami.

4. Kesimpulan dan Manfaat Bagi Institusi

a. Keterlibatan unit-unit lain di perguruan tinggi dalam pelaksanaan penelitian

Penelitian ini dilakukan di Fakultas Farmasi, FMIPA Kimia dan Fakultas

Kedokteran UGM. Laboratorium yang dipakai antara lain di Fakultas Farmasi meliputi bagian Biologi Farmasi, di Laboratorium Kimia organic FMIPA dan Laboratorium Parasitologi FK UGM. Keterlibatan Laboratorium dari unit -unit lain dalam satu institusi menjadi sangat penting untuk keberhasilan riset ini.

Penelitian ini sangat bermanfaat terhadap mahasiswa sebagai peneliti dan Institusi sebagai penyedia sarana dan prasarana. Membuka cakrawala baru

dalam riset isolasi dari biji buah makasar dan semisintesis serta kesiapan tenaga SDM dan peralatan yang ada untuk kelanjutan riset ini dimasa datang.

Kolarobasi unit-unit penelitian dalam institusi tampak menjadi sangat penting untuk mencapai keberhasilan dalam riset ini.

b. Kerja sama dengan pihak luar (kontrak baru, royalty)

Kerjasama maupun kontrak baru maupun royatti belum dilakukan dari hasil penelitian ini. Diharapkan dengan selesainya keseluruhan disertasi, akan dilakukan uji invivo antitumor. Selanjutnya diharapkan akan ditemukan suatu obat baru dari bahan alam Indonesia sebagai salah satu strategi dalam pengobatankanker.