METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Ekstrak Teh Hijau Hewan coba

(1)

METODOLOGI

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan selama bulan Pebruari 2008 sampai dengan Mei 2008 di Laboratorium Hewan SEAFAST IPB dan Laboratorium Anatomi Fisiologi dan Farmakologi FKH IPB.

Bahan Ekstrak Teh Hijau

Teh hijau yang digunakan adalah teh hijau (Camellia sinensis) klon Gambung VII dengan kandungan katekin 15,9% dari berat kering (Santoso et al.

2006). Persiapan ekstrak dilakukan menurut SNI (Standar Nasional Indonesia) mengenai teh hijau. Sebanyak 16 gram teh hijau kering diseduh dengan 1 L air mendidih dan ditutup. Sepuluh menit kemudian, seduhan disaring dan didinginkan dalam suhu ruang. Ekstrak teh hijau kondisi asam dipersiapkan dengan menambahkan asam sitrat pada ekstrak teh hijau yang didapat dari proses menyeduh tadi secara titrasi sehingga didapat pH 4. Ekstrak teh hijau dan teh hijau kondisi asam dipersiapkan dan diberikan ad libitum sebagai air minum setiap hari, sedangkan sisa teh pada hari sebelumnya diukur volumenya lalu dibuang.

Hewan coba

Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 20 ekor tikus putih betina galur Sprague Dawley usia 8 minggu yang diperoleh dari Laboratorium Genetika Fakultas Peternakan IPB dengan berat badan 54.9 ± 1.58 gram (Lampiran XX). Tikus ditempatkan dalam kandang plastik yang berisi satu ekor tikus untuk setiap kandang. Kandang disusun dalam rak bertingkat 4, masing- masing berisi 5 kandang dalam ruangan dengan siklus gelap terang 12 jam. Suhu ruangan berkisar antara 28-32 ° C.

13

(2)

Pakan tikus

Dalam penelitian ini terdapat 2 jenis pakan, yakni pakan dengan komposisi standar berupa pelet dan pakan dengan komposisi tinggi lemak menurut Axen et al. 2006 dengan modifikasi untuk menginduksi kelainan terkait sindroma metabolik. Sumber lemak yang digunakan untuk pakan standar adalah minyak jagung, sedangkan untuk pakan tinggi lemak adalah lemak kambing dan minyak jagung dengan perbandingan 6:1. Komposisi kedua jenis pakan dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3 Komposisi Pakan Tikus Percobaan (Axen et al.2006)

Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang plastik, timbangan pegas, timbangan analitik digital, rat sfigmomanometer Student

^@

, glukometer Glucosure

^@

, peralatan bedah, peralatan analisis laboratorium dan spektrofotometer Hitachi U-2001

^@

.

Komposisi

Jenis Pakan Standar Tinggi

Lemak

Kasein (g/kg) 115 115

Minyak / lemak (g/kg) 65 350

Mineral mix (g/kg) 50 50

Serat (CMC) (g/kg) 10 10

Vitamin mix (g/kg) 10 10

Maizena (g/kg) 700 415

Air (g/kg) 50 50

Karbohidrat (%energi) 72.9 31.5

Protein (% energi) 11.9 8.7

Lemak (%energi) 15.2 59.8

Energi (kal/g) 3.84 5.27

(3)

Rancangan Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap.

Setelah adaptasi selama 2 minggu, tikus dibagi dalam 4 kelompok perlakuan, yakni diet standar seperti pada masa adaptasi (S), diet tinggi lemak dan air putih (TL), diet tinggi lemak dan ekstrak teh hijau (TLT), dan diet tinggi lemak dan ekstrak teh hijau kondisi asam (TLTA) selama 10 minggu (Gambar 5). Antar keempat kelompok tidak terdapat perbedaan bobot badan yang signifikan.

Tikus ditimbang setiap minggu. Pada akhir minggu ke-10, seluruh tikus diperiksa tekanan darahnya dan dipuasakan selama 12 jam untuk selanjutnya dilakukan pemeriksaan kadar glukosa darah. Pada hari berikutnya, setelah dipuasakan selama 12 jam, tikus dikorbankan dan darah dari jantungnya diambil untuk dilakukan analisis kadar trigliserida dan kolesterol HDL serum. Lemak viseral (intraperitoneal) diambil untuk ditimbang.

Gambar 5 Skema alur penelitian

Data hasil pengukuran ditunjukkan dengan nilai rata-rata ± SD. Untuk menentukan adanya pengaruh dari perlakuan, signifikansi antara kelompok yang berbeda ditentukan dengan uji ANOVA 1 arah. Bila terdapat perbedaan yang signifikan, uji dilanjutkan dengan uji Tukey. Nilai P < 0,05 dinyatakan signifikan. Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS 11.5 for Windows.

Kelompok TLTA 5 ekor tikus diet tinggi lemak + teh hijau kondisi asam

10 minggu Kelompok TLT

5 ekor tikus diet tinggi lemak

+ teh hijau 10 minggu Kelompok TL

5 ekor tikus diet tinggi lemak

+air putih 10 minggu Kelompok S

5 ekor tikus diet standar 10 minggu

- pengukuran bobot badan setiap minggu - pengukuran tekanan darah

- pengukuran kadar gula darah - pengukuran kadar trigliserida - pengukuran kadar kolesterol HDL

20 ekor tikus

adaptasi 2 minggu

(4)

Pengukuran Parameter Sindroma Metabolik

Pengukuran Bobot Badan dan Lemak Viseral

Pengukuran bobot badan dilakukan setiap minggu dengan menimbang tikus menggunakan timbangan pegas (Gambar 6). Pengukuran bobot jaringan lemak viseral dilakukan setelah tikus dikorbankan dengan mengambil lemak intraperitoneal abdomen dan menimbangnya memakai timbangan digital (Gambar 7a dan 7b).

Gambar 6 Penimbangan Tikus

(a) (b)

Gambar 7 Pengambilan (a) dan penimbangan (b) lemak viseral

Pengukuran Tekanan Darah

Pengukuran tekanan darah dilakukan oleh dokter hewan, menggunakan

sfigmomanometer Student

^®

dengan metode non invasive blood pressure

(Gambar8a). Tikus ditempatkan dalam alat untuk memfiksasi, kemudian pada

pangkal ekornya dipasang tail cuff untuk mendeteksi denyut aliran darah yang

terhubung dengan oscillograph (Gambar 8b). Saat tikus telah tenang, alat

dinyalakan. Penilaian hasil pengukuran dilakukan dengan membaca grafik yang

tercetak oleh alat (CWE 2005).

(5)

(a) (b)

Gambar 8 (a). Pengukuran Tekanan Darah Tikus dengan Metode Non Invasive Blood Pressure

(b). Grafik Denyut Aliran Darah pada Ekor Tikus

Pengukuran Kadar Glukosa Darah

Pemeriksaan kadar glukosa darah dilakukan dengan metode enzimatik otomatis menggunakan glukometer Glucosure

^®

setelah tikus dipuasakan selama 12 jam. Sampel darah sebanyak satu tetes diperoleh dengan menusuk ujung ekor dengan jarum spuit steril sekali pakai.

Sampel diteteskan pada strip uji disposibel yang terdiri atas membran yang mengandung reagen-reagen yang diperlukan untuk reaksi enzimatis. Heksokinase mengkatalisis reaksi adenosin trifosfat dan ion magnesium dengan glukosa pada sampel untuk menghasilkan glukosa 6 fosfat. Glukosa 6 fosfat adalah substrat untuk glukosa 6 fosfat dehidrogenase yang mengubah NAD pada strip menjadi NADH. Selanjutnya, diaforase mengkatalisis reaksi antara NADH dan tetrazolium untuk menghasilkan senyawa coklat formazan, yang secara langsung setara dengan konsentrasi glukosa plasma pada sampel. Refleksi cahaya dari strip uji yang mengandung hasil reaksi diukur untuk menghitung konsentrasi glukosa.

Deteksi dilakukan oleh sebuah photocell. Terdapat hubungan kesetaraan antara

jumlah cahaya yang direfleksikan dan jumlah glukosa yang terdapat pada sampel.

(6)

Pengukuran Kadar Trigliserida Serum

Analisis untuk mengukur kadar trigliserida serum dilakukan menggunakan Triglyceride Analysis Kit merek Human

^®

. Sampel adalah serum yang berasal dari darah jantung yang diambil menggunakan spuit sesaat setelah tikus dimatikan dan dibedah. Kadar trigliserida ditentukan setelah reaksi hidrolisis enzimatik dengan lipase. Indikator yang digunakan adalah quinoneimin yang dibentuk dari hidrogen peroksida, 4-amino-antipirin dan 4-klorofenol di bawah pengaruh katalitik dari peroksidase.

Prinsip reaksi:

Trigliserida

^lipase

gliserol + asam lemak Gliserol + ATP

^GK

gliserol-3-fosfat + ADP Gliserol-3-fosfat + O

2

^GPO

dihidroksi aseton fosfat + H

2

O

2

H

2

O

2

+ 4-aminoantipirin+ 4-klorofenol

^POD

quinoneimin + HCl + H2O

Sampel serum atau standar diambil sebanyak 10 µL dan dicampurkan dengan 1000 µL pereaksi kit, kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu dicampurkan sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang (D) 500 nm.

Perhitungan kadar trigliserida dilakukan dengan menggunakan rumus:

Kadar Trigliserida (mg/dL): (absorbansi sampel ) x 200 mg/ dL (absorbansi standar)

Analisis Kadar kolesterol HDL Serum

Pengukuran kadar kolesterol HDL dilakukan dengan Cholesterol HDL

Analysis kit. Sampel adalah serum yang berasal dari darah jantung yang diambil

menggunakan spuit sesaat setelah tikus dimatikan dan dibedah. Pengukuran

dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan presipitasi terhadap lipoprotein

densitas rendah (LDL dan VLDL) dan kilomikron. Presipitasi dilakukan dengan

penambahan asam fosfotungstat dan ion magnesium(MgCl

2

). Setelah proses

sentrifugasi, HDL dalam supernatan diukur menggunakan pereaksi kit untuk

pengukuran kadar kolesterol (CHOD-PAP).

(7)

a. Prosedur presipitasi

Sebanyak 200 µl serum darah dicampurkan dengan 500 µl pereaksi presipitasi yang telah diencerkan dengan akuabides (rasio 4:1), kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah sentrifugasi pada 1074 g (4000 rpm) selama 10 menit, dihasilkan supernatan yang siap untuk dianalisis.

b. Prosedur analisis

- 200 ul serum + 500 ul pereaksi yang telah diencerkan dengan akuabides, diinkubasi selama10 mnt, lalu disentrifugasi selama 10 menit pada 4000 rpm.

- Sebanyak 100 ul supernatan yang dihasilkan dicampur dengan 1000 ul pereaksi (kolesterol esterase, kolesterol oksidase, fenol, 4-aminoantipirin, peroksidase dan buffer).