AMOBILISASI
ENZIM
PENISILIN
ASILASE
DARI
E.
coli
B1O4
DENGAN
POLIAKRILAMIDA
Firman Sebayang
Departemen Kimia FMIPA USU Medan
Abstrak
Penisilin asilase adalah merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis benzil penisilin menjadi asam 6-amino penisilanat (6-APA) dan asam fenil asetat. Isolasi enzim penisilin asilase menggunakan bakteri. E.coli B1O4 sebagai sumber enzim intraseluler. E.coli B1O4 ditumbuhkan dalam medium fermentasi menurut formula morita dan iwata dengan asam fenil asetat 0,2% sebagai induser. Sel dipecah dengan ultrasonikator pada suhu 4 oC. Ekstrak enzim dipisahkan dengan sentrifuga dan diikuti dengan pengendapan enzim dengan menggunakan ammonium sulfat. Aktivitas enzim ditentukan berdasarkan jumlah 6-APA yang dihasilkan dari hidrolisis substrat benzil penisilin. 6-APA ditentukan berdasarkan metodekornfeld. Kadar protein ditentukan dengan metodelowry. Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim adalah 0,65 unit/mg protein dan setelah pemurnian dengan amonium sulfat 20-60% aktivitas spesifik enzim meningkat menjadi 2,85 unit/mg protein pada kondisi optimum pH 7,5 suhu 45 oC dengan lama inkubasi 30 menit.
Amobilisasi enzim penisilin asilase dilakukan dengan menggunakan bahan pendukung poliakrilamida. Aktivitas spesifik enzim amobil adalah 2,70 unit/mg protein pada kondisi pH 7,5 dan suhu 45 oC dengan lama inkubasi 30 menit. Bila dibandingkan aktivitas spesifik enzim penisilin asilase bebas dengan enzim amobil terjadi penurunan aktivitas spesifik setelah diamobilisasi, namun demikian enzim penisilin asilase amobil lebih menguntungkan karena dapat digunakan secara berulang.
Kata kunci: E. coli B104, Enzim penicilin, Asilase, Amobilisasi
A. PENDAHULUAN
Sampai saat ini penggunaan penisilin dan derivatnya di Indonesia cukup tinggi dan diperkirakan akan meningkat dari tahun ke tahun. Penisilin alam dikenal sebagai antibiotik yang secara kimia tidak stabil, sehingga pada pemakaian penisilin untuk tujuan medis sering ditemukan beberapa kekurangan dalam pemakaiannya. Seperti timbulnya gejala alergi, waktu paruh dalam tubuh sempit, tidak tahan terhadap asam dan beta-laktamase serta spektrum kerjanya sempit.
Berdasarkan kenyataan ini perlu dilakukan perbaikan sifat penisilin yaitu membuat derivat penisilin-G sehingga diperoleh penisilin semisintetik yang sifatnya lebih efektif dan lebih bermanfaat. Pengembangan penisilin baru dapat ditempuh dengan jalan modifikasi spektrum kimia benzil penisilin (penisilin-G) menjadi asam 6-amino penisilanat (6-APA) dan merupakan bagian inti penisilin.
6-APA ini merupakan prekursor pada pembuatan penisilin semisintetik yang
sifatnya lebih baik dari penisilin alam. Dari 6-APA dapat dihasilkan proposilin, ampisilin, metesilin, oksasilin, kloksasilin, karbenesilin, fenetesilin, dan sebagainya. Sedangkan produksi antobiotik di Indonesia masih sangat terbatas sehingga harga antibiotik di pasaran cukup tinggi akibatnya sulit dijangkau oleh masyarakat. Terbatasnya produksi antibiotik di Indonesia diperkirakan karena bahan baku serta enzim yang terkait dalam produksi antibiotik tersebut masih harus diimpor. Untuk mengurangi ketergantungan akan bahan baku dari luar negeri maka perlu dilakukan upaya penelitian untuk pemuliaan galur mikroba yang dapat menghasilkan antibiotik.
Langkah awal yang dilakukan untuk mengkonversi benzil penisilin menjadi 6-APA diperlukan enzim penisilin asilase. Enzim penisilin asilase dapat dihasilkan oleh beberapa jenis mikroba baik termasuk jamur dan bakteri yang diproduksi secara intraseluler maupun ekstraseluler. Transformasi benzil penisilin secara enzimatis menggunakan enzim
panisilin asilase dapat digambarkan sebagai berikut:
Walaupun enzim merupakan katalis yang efisien dan cara kerjanya berlangsung secara spesifik dan selektif namun demikian enzim tidak terlalu ideal untuk penggunaan dalam berbagai reaksi kimia karena stabilitas enzim yang rendah, dan secara teknik sulit untuk memperoleh kembali enzim yang masih aktif dari campuran reaksi untuk dapat digunakan kembali.
Adanya perkembangan rekayasa enzim akan dapat mengatasi kekurangan dari reaksi enzimtais biasa. Cara ini dikenal sebagai tenik amobilisasi enzim. Amobilisasi enzim adalah suatu proses di mana pergerakan molekul enzim ditahan pada tempat tertentu dalam suatu ruang reaksi kimia yang dikatalisisnya. Proses ini dapat dilakukan dengan cara mengikatkan molekul enzim tersebut pada suatu bahan pendukung (matriks) tertentu melalui pengikatan kimia atau menahan secara fisik dalam suatu rongga bahan pendukung. Hal ini dimungkinkan karena molekul enzim yang struktur globular (tertier maupun kuartener) mempunyai gugus hidrofilik yang mengarah keluar dari
permukaan melokul enzim. Gugus fungsi inilah yang berikatan dengan gugus fungsi bahan pedukung untuk membentuk ikatan kovalen atau non kovalen.
Teknik amobilisasi enzim dapat dilakukan dengan cara (1) cara fisik yang meliputi
teknik penjebakan (entrapment,
encapsulation), (2) cara kimia yang meliputi teknik pengikatan baik secara kovalen, non kovalen dan teknik ikatan silang (crosslinking), (3) Kombinasi cara fisik dan kimia. Beberapa metode amobilisasi enzim dapat digambarkan sebagai berikut:
Bahan pendukung yang banyak digunakan untuk amobilisasi enzim adalah kalsium alginat, kappa-karagenan, poliakrilamida dan resin sintetis. Dalam penelitian ini digunakan bahan pendukung amobilisasi emzim penisilin asilase adalah poliakrilamida. Struktur poliakrilamida dibentuk oleh reaksi polimerisasi larutan akrilamida dan N-N-metilenbisakrilamida (BIS) sebagai pembentuk ikatan silang. Pada reaksi polimerisasi ini digunakan kalium ferosulfat, K2S2O8 sebagai bahan inisiator serta
aselerator. DMAPN dapat diganti dengan N,N,N,N-tetrametilendiamin (TEMED). Reaksi polimerisasi gel poliakrilamida ini dapat dilihat seperti gambar berikut:
B. BAHAN DAN METODA 1. Pembuatan Inokulum.
Sebanyak 2 mata ose biakan E. coli B104
dipindahkan ke dalam 100 ml medium fermentasi. Medium yang telah diinokulasikan ini dikocok selama 24 jam
pada suhu 30 oC, 180 rpm. Jumlah sel
yang tumbuh diukur berdasarkan turbiditasnya pada panjang gelombang 650 nm.
2. Isolasi Enzim Penisilin Asilase
Sebanyak 3000 ml medium fermentasi diinokulasi dan dikocok selama 20 jam
pada 180 rpm dan suhu 30 oC. 8 jam
setelah diinokulasi pada medium
fermentasi ditambahkan asam fenil asetat 0,2% sebagai penginduksi. Pasta sel bakteri dipisahkan dari medium cair
dengan sentrifuga dingin 2-4 oC pada
5000 rpm selama 30 menit. Pasta sel dicuci dengan NaCl 0,95%, selanjutnya pasta sel disuspensikan dengan 5 ml bufer fosfat 0,01 M pH 7,0.
Pemecahan sel bakteri dilakukan dengan ultrasonikator pada suhu 2-4 oC. Ekstrak enzim kasar dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya dengan sentrifuga dingin pada 5000 rpm selama 30 menit. 3. Pemurnian Enzim Penisilin Asilase. Metode pemurnian enzim dilakukan berdasarkan metode balshingham dan kawan-kawan. Ekstrak enzim kasar dimurnikan dengan penambahan amonium sulfat secara pengendapan bertingkat 0-20% jenuh; 20-60% jenuh; dan 60-80% jenuh. Masing-masing fraksi dipisahkan dari cairannya secara sentrifugasi pada 12000
rpm suhu 2-4 oC selama 20 menit.
Endapan enzim yang diperoleh disuspensikan dalam bufer fosfat 0,01 M pH 7,0. Larutan enzim setiap fraksi dilakukan dialisa menggunakan selofan. 4. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin
Asilase
Sebanyak 0,1 ml enzim hasil isolasi direaksikan dengan 0,4 ml substrat benzil penisilin. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml bufer fosfat 0,1 M pH 7,5. Inkubasi selama 30 menit pada 45 oC. Setelah inkubasi, ke dalam campuran reaksi ditambahkan 1,90 ml bufer fosfat 0,5 M pH 6,8 dan 0,1 ml larutan 2,4-pentanadion, kocok dalam vortek dan langsung dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit. Dinginkan dalam air es selama 10 menit. Selanjutnya tambahkan 1,5 ml regen erlich, campuran reaksi dikocok dan biarkan 10 menit. Warna merah yang terjadi diukur serapannya pada panjang gelombang 538 nm. Sebagai kontrol digunakan enzim penisilin asilase hasil isolasi yang telah dimatikan aktivitasnya melalui
pemanasan. Untuk mengetahui jumlah 6-APA yang terbentuk digunakan kurva standar 6-APA (Lampiran 1).
5. Penentuan Kadar Protein Enzim
Penisilin Asilase
Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode lowry. Sebanyak 1 ml larutan enzim direaksikan dengan 5 ml reagen C, kocok dan biarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Tambahkan 0,5 ml reagen D (folinciocalteu 1 N) kocok dan biarkan 30 menit pada suhu kamar. Warna biru yang terbentuk diukur serapannya pada panjang gelombang 750 nm. Untuk mengetahui konsentrasi protein digunakan kurva standar bovin serum albumin (Lampiran 2).
6. Pembuatan Enzim Penisilin Asilase Amobil
Sebanyak 750 mg akrilamid dicampur dengan 40 mg N,N-metilenbisakrilamida dalam 100 ml gelas kimia yang berisi 5 ml bufer fosfat 0,01 M pH 7,0. Diaduk sampai homogen. Tambahkan 1 ml larutan enzim penisilin asilase hasil isolasi dan diaduk. Tambahkan 0,5 ml larutan N,N,N,N-tetrametilendiamin (TEMED) 5% dan 0,5 ml larutan kalium persulfat. Setiap kali penambahan bahan selalu diaduk.
Dibiarkan membeku dalam kamar pendingin agar enzim yang diamobilkan tidak rusak akibat pengaruh panas pada proses reaksi polimerisasi. Gel yang telah dibentuk dipotong-potong dengan ukuran 2 x 2 x 2 mm, kemudian dengan bufer fosfat dengan volume tertentu. Gel yang telah dicuci merupakan enzim penisilin asilase amobil.
7. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin Asilase Amobil.
Proses yang dilakukan adalah sistem
batch. Sebanyak 2 gr gel poliakrilamida
yang mengandung 0,4 ml enzim ditambahkan sebanyak 0,8 ml substrat
benzil penisilin dan 1,2 ml bufer fosfat 0,1 M pH 7,5. Inkubasi dalam inkubator goyang pada suhu 45 oC selama 30 menit. Jumlah 6-APA yang dihasilkan ditentukan seperti cara penentuan jumlah 6-APA dengan menggunakan enzim penisilin asilase bebas.
8. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin Asilase Amobil pada Pemakaian Berulang.
Penentuan ativitas enzim amobil pada pemakaian berulang sama halnya dengan cara penentuan aktivitas enzim amobil, hanya saja setelah pemakaian pertama selesai, enzim amobil tersebut dicuci dengan air, selanjutnya digunakan kembali. Demikian seterusnya sampai pemakaian berulang 6 kali.
C. HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Isolasi Enzim Penisilin Asilase
Pada tahap isolasi enzim dilakukan
sentrifugasi sel E. coli yang masih
tercampur dengan mediumnya. Pengujian terhadap sisa medium fermentasi menunjukkan tidak adanya aktivitas enzim penisilin asilase. Hal ini membuktikan bahwa enzim penisilin asilase dari E. coli B104 bersifat intraseluler sehingga untuk memperoleh enzim harus dilakukan pemecahan sel menggunakan ultrasonikator. Ekstrak kasar enzim dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya dengan sentrifugasi.
2. Pemurnian Enzim Penisilin Asilase Ekstrak enzim yang diperoleh masih merupakan campuran dari berbagai macam enzim sehingga untuk mendapatkan enzim yang lebih murni dilakukan pemurnian dengan fraksinasi menggunakan amonium sulfat. Aktivitas spesifik sebelum dan sesudah pemurnian dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Aktivitas Spesifik Enzim Penisilin Asilase Sebelum dan Sesudah Pemurnian.
Fraksi Enzim Kadar Protein (mg/ml) Aktivitas spesifik (Unit/ mg Protein) Ekstrak e kasar nzim (NH4)2SO4 12.50 0.65 0 - 20% 12.10 0.85 20 - 60% 10.35 2.82 60 - 80% 9.78 1.15
Dari tabel dapat dilihat bahwa aktivitas spesifik enzim tertinggi diperoleh pada fraksi 20-60%. Hal ini menunjukkan bahwa pada fraksi tersebut enzim penisilin asilase realtif lebih murni.
Kurva 1. Grafik Aktivitas Enzim Penisilin pada Berbagai pH
Kurva 2. Grafik Aktivitas Enzim Penisilin Asilase pada Berbagai Suhu
Kurva 3. Grafik Enzim Penisilin Asilase Amobil pada Pemakaian Berulang
3. Penentuan pH Optimum Enzim Penisilin Asilase
PH optimum enzim penisilin asilase dapat dilihat pada Kurva 1. Dari kurva dapat dilihat bahwa pH optimum enzim penisilin asilase adalah 7,5. pH ini berhubungan dengan struktur enzim yang terdiri dari asam amino. Perubahan pH dalam larutan
menunjukkan perubahan ion H+.
Jumlah ion akan mempengaruhi struktur enzim terutama pada ikatan hidrogen. Pada pH optimum jumlah ion
H+ tidak mempengaruhi konformasi enzim
sehingga pada pH optimum konformasi enzim sama dengan konformasi substrat sehingga pada pH optimum aktivitas enzim paling tinggi.
4. Penentuan Suhu Optimum Enzim Penisilin Asilase.
Suhu optimum enzim dapat dilihat seperti Kurva 2. Dari kurva dapat dilihat bahwa suhu optimum enzim penisilin asilase
adalah 45 oC. Sebelum mencapai suhu
Hal ini disebabkan karena energi aktivasi yang diperlukan enzim untuk menghidrolisa substrat benzil penisilin belum cukup sehingga enzim tidak bekerja secara efektif. Kenaikan temperatur menyebabkan kenaikan aktivitas enzim meningkat sampai mancapai kondisi optimum. Setelah tercapai suhu optimum ternyata dengan kenaikan suhu aktivitas enzim menurun.
Terjadinya penurunan aktivitas diperkirakan karena enzim mengalami denaturasi akibat panas. Ikatan hidrogen yang merupakan ikatan yang lemah pada molekul enzim mungkin terputus sehingga terjadi perubahan struktur tertier dan kuartener dan menurunkan aktivitas enzim.
5. Aktivitas Enzim Penisilin Asilase Sebelum dan Sesudah Diamobilisasi
Aktivitas enzim penisilin asilase sebelum dan sesudah diamobilisasi dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Aktivitas Enzim Penisilin Asilase Fraksi Enzim Aktivitas Spesifik (unit/mg Protein) Enzim penisilin asilase bebas Enzim penisilin asilase amobil 2.85 2.70
Bila dibandingkan aktivitas enzim bebas dengan enzim amobil dengan bahan pendukung poliakrilamida ternyata aktivitas enzim penisilin asilase amobil lebih rendah. Hal ini mungkin disebabkan karena enzim sebagai molekul protein yang bersifat hidrofilik sangat mudah dipengaruhi oleh keadaan lingkungan. Dengan demikian diperkirakan struktur molekul enzim rusak akibat terjadinya perubahan panas pada saat berlangsungnya reaksi polimerisasi. Selain itu turunnya aktivitas enzim amobil mungkin disebabkan karena orientasi antara
molekul substrat dengan sisi aktif enzim kurang efektif sehingga akan menurunkan aktivitas enzim.
6. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin Asilase Amobil pada Pemakaian Berulang
Dari hasil pengujian aktivitas enzim penisilin asilase amobil pada pemakaian berulang untuk enzim yang sama ternyata mengalami penurunan seperti terlihat pada Kurva 3.
Dari kurva dapat dilihat bahwa penurunan aktivitas ini berhubungan dengan stabilitas dan daya katalitik molekul enzim. Daya katalitik dan stabilitas enzim dipengaruhi oleh faktor lingkungan terutama gugus fungsi reaktif enzim pada pusat aktif. Bila suatu enzim sering digunakan maka adanya interaksi antara substrat dengan enzim akan mempengaruhi gugus reaktif sehingga terjadi perubahan konformasi struktur enzim, dengan demikian akan mempengaruhi daya katalitik enzim tersebut.
Bila dilihat stabilitas enzim penisilin asilase amobil pada pemakaian berulang ternyata pada pemakaian 1 sampai ke-4 relatif belum menunjukkan perubahan aktivitas enzim yang berarti. Namun setelah pemakaian yang ke-5 dan ke-6 terjadi penurunan aktivitas yang tajam. Hal ini kemungkinan kerusakan perubahan konformasi enzim penisilin asilase cukup besar sehingga menyebabkan aktivitas enzim menurun secara drastis.
D. KESIMPULAN
1. E. coli B104 dapat memproduksi enzim penisilin asilase jika bakteri tersebut ditumbuhkan dalam medium fermentasi menurut formula morita dan iwata yang mengandung asam fenil asetat 0,2% sebagai penginduksi.
2. Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim adalah 0.65 unit/mg protein, dan setelah pemurnian dengan amonium
sulfat 20-60% jenuh aktivitas spesifik meningkat menjadi 2,85 unit/mg protein dengan kondisi optimum reaksi enzim adalah pH 7,5 dan suhu 45 oC.
3. Aktivitas spesifik enzim penisilin
asilase amobil dengan bahan pendukung poliakrilamida adalah 2,70 unit/mg protein pada pH 7,5 dan suhu 45 oC.
4. Mekipun terjadi penurunan aktivitas enzim penisilin asilase amobil namun penggunaan enzim amobil lebih menguntungkan karena enzim amobil dapat meningkatkan stabilitas serta dapat digunakan secara berulang.
E. DAFTAR PUSTAKA
Widiawati Adinoto, dkk., (1987),
Pemilihan Anti Mikroba yang
Rasional, MKB. XX, No.1, Juli,
30-35.
Carrington, T.R., (1971), The
Development of Commersial Processes for the Production of 6-amino Penisilanic Acid (6-APA), Proc.R.Soc.Lond.B., 179, 321-333.
Crueger, W., and A. Crueger, (1984), Biotechnology: A Textbook of Industrial
Micribiology, Brock, T.D., editor,
Science Tech., Inc., Madison, USA, 178-180, 202-206.
Savidge, T.A., and M.Cole, (1975),
Penicillin Acylase (Bacterial) in
Hash, J.H.(ed.), Methods in
Enzymology-Antibiotics, Academic Press, New York, 705-720.
Chibata, Inchiro, (1978), Immobilized
Enzymes, Kodansha Ltd., Tokyo,
9-54.
Morita, H., and T. Iwata, J., (1984),
Ferment. Technol., 62, 217-218.
Balashingham, K, et al., (1972), The
Isolation and Kinetics of Penicillin
Amidase from Escherichia coli,
Biochim, Biophys, Acta, 276, 250-251.
Kornfeld, J.M., (1987), A New Colorimetric Methods for The Determination of 6-Aminopenicillanic Acid, Anal. Chem., 86, 118-126.
Lowry D.C.H., RoseBrough, N.J. dan Farr, Randall, (1951), J. Biol.Chem, 193. Kawashima, K. and umeda K., (1974),
Immobilization Of Enzymes By Radiopolimerization Of Acrilamide, Biotechnology And Bioenginering, 16, 609-621.
LAMPIRAN
