1
PENGARUH pH TERHADAP AKTIVITAS PENISILIN G ASILASE YANG DIHASILKAN ISOLAT BAKTERI DARI AIR BATANG KURAO KOTA PADANG
Oleh:
Desriyati1, Mades Fifendy2, RRP Megahati Siregar1
1Program Studi Pendidikan Biologi STKIP PGRI Sumatera Barat
2Jurusan Biologi Universitas Negeri Padang
ABSTRACT
Many pathogenic microorganisme were found to be resistant to penicillin, to prevent the occurrence of penicillin resistance is then produced semisynthetic penicillins, basic materials used for the manufacture of semisynthetic penicillins a 6-aminopenisilanat acid (6-APA). 6-APA is the result of hydrolysis of penicillin by the enzyme activity of penicillin G acylase, Penicillin G acylase produced by various microorganisme, such as fungi and bacteria. This study aimed to determine the effect of pH on the activity of penicillin G acylase resulting bacterial isolates from stem water Kurao Padang. This study was conducted from October 2012 to January 2013 in the Laboratory Kopertis X Padang region of West Sumatra. This type of research is that the experimental treatment pH variation between (6,5 - 8,0) of the PGA activity resulting bacterial isolates and calculate the resulting enzyme activity using the method of Kornfeld is a method that has a high sensitivity and fast in detecting compounds 6-aminopenisilanat acid (6-APA). Results showed pH affects the activity of PGA by bacterial isolates from water with pH variation stems Kurao PGA 0.0101 6.5 activity units / ml, at pH 7.0 activity PGA 0.0269 units / ml, where as at pH 7.5 PGA activity of 0.0200 units / ml, and the pH 8.0 activity PGA 0.0064 units / ml. Based on the research that has been done can be concluded that the activity of Penicillin G Acylase resulting bacterial isolates from water Kurao Batang Padang has an optimum pH of 7.0 with enzyme activity (AE) PGA 0.0269 units / ml.
Key words: Penicillin G Acylase, 6-asam aminopenisilanat(6-APA), Kornfeld method
PENDAHULUAN
Banyak mikroorganisme patogen yang ditemukan menjadi resisten terhadap berbagai antibiotika. Oleh karena itu
dibutuhkan antibiotika yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme patogen tersebut, salah satu antibiotik yang
2 dikembangkan adalah penisilin, penisilin yang digunakan dalam pengobatan terbagi dalam penisilin semisintetik dan penisilin alami (Susanti, 2003).
Penisilin alami memiliki kelemahan yaitu sifatnya yang berspektrum sempit dan peka terhadap penisilinase (β-laktamase), (Pratiwi, 2008). Penisilin semisintetik diperoleh dengan cara mengubah struktur kimia penisilin alami atau dengan cara sintesis dari inti penisilin, bahan dasar yang digunakan untuk pembuatan penisilin semisintetik berupa asam 6- aminopenisilanat (6-APA). Asam 6- aminopenisilanat (6-APA) merupakan hasil hidrolisis penisilin oleh aktivitas enzim penisilin G asilase. Penisilin G asilase dihasilkan oleh berbagai macam mikroorganisme, antara lain jamur dan bakteri (Kafsnochi. et al., 2010).
Penelitian yang dilakukan Alpendra (2011) tentang Isolasi dan Uji Aktivitas Enzim Penislin G Asilase Secara Kualitatif Dari Bakteri Escherichia coli Pada Air di Kota Padang, diketahui bahwa hasil isolasi bakteri tersebut positif (+) menghasilkan enzim Penisilin G Asilase. Dari latar belakang di atas telah dilakukan penelitian tentang pengaruh pH terhadap aktivitas penisilin G asilase yang dihasilkan isolat bakteri dari air Batang Kurao kota Padang.
METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Oktober 2012 sampai Januari 2013 di Laboratorium Kopertis wilayah X Sumatera Barat. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: tabung reaksi, gelas ukur, gelas kimia, tabung micro sentrifuse, cawan petri, jarum ose, autoklaf, spiritus, sarung tangan, masker, inkubator, vorteks, spatula, mikropipet, tip pipet, hot plate, pH meter, timbangan digital, cuvet, lemari pendingin, laminar air flow (LAF), waterbath, oven, spektrofotometer dan sentrifuse. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: aquades, penisilin G, alkohol 70%, medium Luria Bertani Broth (LB), sukrosa 0,3 M, Tris HCl 0,1 M, lisozim 0,2 mg/ml, buffer fosfat 0,5 M, pentanadion, reagen ehrlich (PDAB {p- dimetil amino benzaldehid}, Etanol 95%, HCl pekat), aluminium foil, serbuk es, tissue, kapas, karet gelang, kertas label, plastik wrap, kertas koran dan isolat bakteri dari air Batang Kuranji Kota Padang (hasil penelitian Alpendra 2011).
1. Pemanenan Kultur Bakteri
Diambil satu koloni bakteri dengan menggunakan jarum ose yang steril dan dimasukkan ke dalam 10 ml medium LB, kemudian dikocok pada inkubator bergoyang selama 12 jam pada suhu 37°C
3 dengan kecepatan 150 rpm. Setelah 12 jam kemudian kultur dipanen untuk isolasi enzim.
2. Isolasi Enzim
Sebanyak 10 ml kultur sel bakteri yang telah dipanen disentrifugasi selama 15 menit pada putaran 4.000 rpm. Kemudian pelet sel diresuspensi dengan 3 ml larutan 0,3 M sukrosa; 0,1 M Tris HCl pH 8,5 dan 0,2 mg/ml lisozim. Setelah itu suspensi tersebut dikocok dengan vorteks selama 1 menit dan diinkubasi di dalam serbuk es selama 30 menit, kemudian suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan dapat disimpan pada suhu - 20°C.
Supernatan ini merupakan larutan enzim yang akan diuji aktivitasnya.
3. Pembuatan Kurva Standar 6-APA Larutan stok 6-APA 2mM (dilarutkan dalam buffer fosfat 0,5 M pH 8,0) diencerkan dengan variasi konsentrasi 0,15 mM; 0,30 mM; 0,45 mM dan 0,60 mM.
Dari masing-masing 6-APA dengan konsentrasi yang bervariasi tersebut diambil sebanyak 400 µl 6-APA ditambah 100 µl buffer fosfat dan ditambah dengan reagen- reagen pereaksi Kornfeld yang sama dengan perlakuan pada sampel. Sebagai kontrol adalah campuran semua reagen tanpa adanya 6-APA, serapan larutan ini diukur
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 538 nm.
4. Uji aktivitas enzim
Sebanyak 100 µl larutan enzim hasil isolasi direaksikan dengan 400 µl larutan substrat (150 mg penisilin G selanjutnya ditambahkan 0,5 M buffer fosfat sebanyak 10 ml dengan pH yang bervariasi, yaitu 6,5;
7,0; 7,5; 8,0). Inkubasi selama 20 menit pada suhu 450 C. Setelah diinkubasi berupa 6-APA, ke dalam campuran reaksi ditambahkan 2,6 ml buffer fosfat 0,5 M pada pH 6,8 dan 0,1 ml larutan pentanadion, kocok dengan vorteks dan panaskan di waterbath selama 20 menit. Dinginkan dalam air mengalir selama 5 menit dan di dalam serbuk es selama 5 menit.
Selanjutnya tambahkan 1,5 ml reagen ehrlich, campuran reaksi dikocok dengan vorteks. Serapan larutan ini diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 538 nm. Sebagai kontrol digunakan larutan enzim dan substrat tanpa inkubasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian yang telah dilakukan tentang pengaruh pH terhadap aktivitas PGA pada isolat bakteri dari air batang Kurao yang telah diukur serapannya dengan panjang gelombang 538 nm dan didapatkan hasil uji aktivitas enzimnya dengan nilai
4 absorbansi Y1 (perlakuan dengan diinkubasi) pada pH 6,5 adalah 0,034, Sedangkan Y0 (kontrol tanpa inkubasi) adalah 0,022, Y (rata-rata absorbansi) adalah 0,012, pada pH 7,0 nilai absorbansi Y1 adalah 0,0485, Sedangkan Y0 adalah 0,023, Y adalah 0,0255, pada pH 7,5 nilai absorbansi Y1 adalah 0,019 pada pH 7,5 nilai absorbansi Y1 adalah 0,039, Y0 adalah 0,019, Y adalah 0,02 dan pada pH 8,0 nilai absorbansi Y1 adalah 0,029. Y0 adalah 0,020 , Y adalah 0,02 seperti pada tabel 1.
Tabel 1. Hasil absorbansi dan analisa data pengaruh pH terhadap aktivitas PGA yang dihasilkan isolat bakteri air Batang Kurao Kota Padang pada panjang gelombang 538 nm
pH Y1 Y1= Y0
Y (Y1-
Y0)
Aktivitas Enzim (Unit/ml) 6,5 0,034 0,034 0,034 0,022 0,012 0,0101 7.0 0,048 0,049 0.0485 0,023 0,0255 0,0269 7,5 0,039 0,039 0,039 0,019 0,02 0,0200 8,0 0,025 0,033 0.029 0,020 0,009 0,0064
Gambar 3. Hasil uji aktivitas enzim penisilin G asilase yang dihasilkan isolat bakteri dari
Air Batang Kurao pada pH bervariasi
Dari gambar diatas dapat kita lihat bahwa masing-masing perlakuan pH menunjukkan perbedaan aktivitas enzim PGA, pada pH 6,5 aktivitas PGA 0,0101 Unit/ml dan pada pH 7,0 aktivitas PGA 0,0269 Unit/ml, dan pada pH 7,0 ini merupakan pH dengan aktivitas PGA yang paling tinggi (pH optimal), sedangkan pada pH 7,5 aktivitas PGA turun menjadi 0,0200 Unit/ml, pada pH 8,0 merupakan aktivitas PGA yang paling rendah dengan aktivitas PGA 0,0064 Unit/ml enzim.
Hasil uji aktivitas enzim pada klon asal mempunyai aktivitas tertinggi pada pH optimum 7,0, sedangkan pH dibawah atau diatas 7,0 aktivitas PGA akan lebih rendah.
Hal ini disebabkan karena aktivitas enzim akan meningkat seiring dengan peningkatan pH hingga mencapai pH optimum kerja enzim. Tetapi apabila terjadi peningkatan pH yang melewati batas pH optimum maka akan menyebabkan penurunan aktivitas enzim. Penurunan aktivitas enzim diatas pH 7,0 disebabkan karena telah terjadi perubahan kondisi lingkungan enzim dari pH normal menjadi pH yang basa (Megahati, 2001).
Penelitian yang dilakukan Mulyani (2008) mengenai Pemurnian Enzim
0.0101 0.0269
0.02
0.0064 0
0.01 0.02 0.03
6.5 7 7.5 8
Aktviitas enzim (U/ml)
pH
Kurva Aktivitas Enzim PGA
5 Penisilin G Asilase Untuk Meningkatkan Produksi 6-APA menunjukkan hasil yang berbeda yaitu pH optimum aktivitas enzim penisilin G asilase 7.5. sedangkan Souza et al (2005) meneliti tentang karakterisasi enzim PGA dari Bacillus Megaterium menunjukkan aktivitas enzim PGA optimum pada pH 8,0 dengan aktivitas PGA 348,0 U/L.
KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa pH berpengaruh terhadap aktivitas enzim Penisilin G Asilase yang dihasilkan isolat bakteri dari air Batang Kurao Kota Padang memiliki pH optimum 7,0 dengan aktivitas enzim (AE) 0,0269 unit/ml.
DAFTAR PUSTAKA
Alpendra, S. 2011. Isolasi Dan Uji Aktivitas Enzim Penisilin G Asilase Secara Kualitatif Dari Bakteri Escherichia coli Pada Air Sungai Kota Padang. Skripsi Prodi Biologi STKIP PGRI Padang Sumatera Barat.
Kafshnochi, M., Farajnia, S., Aboshof, R., Babaei, H. and Aminolroayaee, M.
2010. “Cloning and over- expression of Penicillin G acylase in E. coli BL21”. African Journal of Biotechnology, 9 (18): 2697- 2701.
Kornfeld, J.M. 1987. “A New Colorimetric Methods for The
Determination of 6-
Aminopenicillanic Acid”.
Analytical Biochemistry, 86: 118- 126.
Megahati, RRP . 2001. Deteksi Mutasi Gen Penisilin Penisilin G Asilase Dari Escherichia coli B130 Hasil PCR Mutagenik dengan Metode Single
Strand Comformation
Polymorphism (SSCP). Tesis Magister Bidang Khusus Genetika dan Biologi Molekul.Program Study Biologi Institut Teknologi Bandung.
Mulyani, S. N. 2008. Pemurnian Enzim Penisilin G Asilase Untuk Meningkatan Produksi 6-APA.
Jurnal dari http://digilib.itb.ac.id.
Diakses pada 11 Maret 2013.
Susanti, E. 2002. “Isolasi dan Karakterisasi Protease dari Bacillus subtilis 1012M15”. Biodiversitas, 4 (1): 12-17.
Pratiwi, S. T.2008.Mikrobiologi Farmasi.
Universitas Gadjah Mada: Jakarta.
Souza, V R., Ana C G S., Laura M P., Heloísa S S A, and Raquel D L C G. 2005. Caracterization of Penicilin G Acylase fro Bacillus Megaterium ATCC 4945. An International Journal Brazilian Archive Of Biology And
Technology Vol 48. Departamento de Ciencias Fisiologicas
Universidade Federal de Sao Carlos Brazil.
6
