PLASMID
PLASMID
Isti Sofia Insani - 130120150006
PLASMID
PLASMID
Plasmid adalah DNA
Plasmid adalah DNA
ekstr
ekstr
akromosomal
akromosomal
pada
pada
bakteri
bakteri
Berbentuk linear atau
Berbentuk linear atau
sirkular, yang berukuran 1
sirkular, yang berukuran 1
kb sampai lebih dari 500 kb
kromosom memiliki jumlah pasangan basa hingga 4,53 Mbp
(
Mega base pair
). Plasmid terbesar saja, pP73A hanya
memiliki sekitar 0,155 Mbp.
PLASMID
Dalam suatu sel bakteri dapat ditemui lebih
dari 1 jenis plasmid, dengan jumlah kopi
(
copy number
) yang berbeda-beda. Plasmid
yang memiliki jumlah kopi 10-100/sel disebut
high copy number plasmid
. Sedangkan
plasmid yang hanya memiliki 1-4/sel
disebut
low copy number plasmid.
PLASMID
Setiap plasmid dapat bereplikasi secara otonom
dalam sel penerima tanpa tergantung pada
kromosom, karena mempunyai
origin of DNA
replication
(
ori
) tersendiri.
Ori
beberapa plasmid
mempunyai spesifitas yang tinggi, sehingga
plasmid tersebut hanya dapat bereplikasi pada
satu spesies bakteri saja (
narrow host range
plasmid
). Sedang kelompok plasmid yang lain
mempunyai
ori
yang kurang spesifik, sehingga
dapat bereplikasi pada beberapa spesies bakteri
(
broad host range plasmid
).
FUNGSI PLASMID
•
Fungsi plasmid adalah sebagai pembawa sifat
non-esensial bagi pertumbuhan bakteri. Esensial
disini berarti berperan secara langsung dalam
metabolisme dan segala aktivitas biologis yang
menyokong pertumbuhan bakteri.
•
Umumnya plasmid memiliki gen-gen pembawa
sifat resisten terhadap antibiotik. Antibiotik
sendiri, seperti yang Anda tahu, tidak selalu ada
dalam lingkungan, hingga keberadaan gen-gen
tersebut tidak esensial.
JENIS PLASMID
F plasmid adalah plasmid yang membawa faktor-faktor
yang memungkinkan untuk transfer materi genetik dari
satu sel ke sel lain melalui konjugasi
Beberapa plasmid membawa faktor resistensi dan disebut R plasmid. Gen pada R plasmid resisten terhadap antibiotik atau penghambat pertumbuhan bakteri lainnya. R plasmid juga dapat membawa gen tra yang memungkinkan plasmid yang akan menyebar dari sel ke sel.
Penyebaran R plasmid merupakan ancaman yang sangat nyata saat ini untuk pengobatan menggunakan antibiotik
JENIS
–
JENIS REPLIKASI PLASMID
•
Replikasi Tetha
(ϴ
)
Replikasi DNA plasmid umumnya disebut
replikasi tetha, karena saat direplikasi, plasmid
mengalami penggelembungan pada suatu titik
hingga
nampak
seperti
lambang
uppercase
theta
(ϴ
). Proses replikasi
DNA plasmid dimulai pada situs khusus pada
plasmid yang disebut
oriV
(origin of
replication, V berarti
vegetative growth
).
Replikasi theta plasmid dimulai dengan membukanya lilitan
double strand DNA plasmid pada
oriV
yang dilanjutkan oleh
pembuatan primer oleh RNA polimerase pada
oriV
tersebut.
Selanjutnya, DNA polimerase III mulai menyintesis untai baru
DNA plasmid.
Replikasi DNA plasmid bisa berjalan dua arah (
bidirectional
) dan
satu arah
unidirectional
Replikasi Theta Plamid
Unidirectional
Pada proses replikasi plasmid unidirectional,
replication
fork
membuka utas ganda DNA plasmid pada satu arah saja
.
Proses penambahan basa berlangsung dengan arah 3′ ke 5′ oleh DNA
Proses Replikasi Theta Plasmid Bidirectional.
Pada replikasi plasmid bidirectional, arah pembukaan replication fork
berjalan dua arah berlawanan. Setelah masing-masing replication fork
JENIS – JENIS REPLIKASI PLASMID
Rep protein: Protein yang memiliki fungsi membuka utas ganda plasmid dan menstabilkan pembukaan itu dengan mengikat asam amino tirosinnya pada ujung fosfat DNA plasmid (5′)
DNA Pol II: Enzim yang menyintesis untai baru DNA plasmid
Enzim ligase: Melengkapi proses sintesis DNA plasmid pada akhir tahap dua
Mekanisme Rolling Circle Replication
MEKANISME Rolling Circle Replication
Rep mengenali area pada plasmid yang disebut sebagai Double Strand Origin (DSO) dan membuka utas ganda DNA plasmid
Karena area DSO adalah urutan basa yang palindromik, seringkali terbentuk formasi cruciform yang mirip salib akibat perpasangan basa dari bagian
inverted repeat
Rep protein tetap menempel pada area tersebut dengan menstabilkan pembukaan. Hal ini terjadi karena asam amino tirosin pada protein Rep membentuk ikatan kovalen dengan ujung fosfat DNA plasmid (5′)
DNA Pol III memulai replikasi dengan menambahkan basa baru dan mengikatkan gugus fosfat asam amino baru pada gugus hidroksil DNA
plasmid lama yang bebas dan proses ini berlangsung hingga utas tersebut berhasil direplikasi
MEKANISME Rolling Circle Replication
Setelah DNA Pol III menyelesaikan replikasi utas tersebut, protein Repmembuat nick baru dan melepas utas tunggal DNA plasmid yang belum direplikasi. Nick yang terbentuk kemudian diligasi oleh DNA ligase dan membentuk plasmid baru yang utuh
Pada utas yang belum direplikasi, ujung bebas utas DNA yang terlepas
tersebut dibentuk DNA sirkuler baru oleh protein Rep dengan mentransfer gugus fosfat DNA yang berikatan dengan tirosin pada awal proses ini dengan gugus hidroksil pada ujung bebas utas DNA tersebut
Pada utas tunggal sirkuler tersebut, proses replikasi dimulai dengan
pembentukan primer oleh RNA polimerase dan dilanjutkan dengan DNA Pol III yang menyintesis utas baru berdasarkan basa yang menyusun utas tadi Setelah plasmid tersebut rampung direplikasi, primer dihilangkan oleh RNA polimerase dan terbentuklah plasmid utuh. Proses ini menghasilkan dua plasmid baru, sama dengan replikasi theta
BIOTEKNOLOGI
•
jika
seseorang
ingin
merancang
dan
mengekspresikan
gen,
mereka
bisa
menempatkannya pada plasmid, masukkan
plasmid ke dalam sel bakteri, dan kemudian
membujuk sel dalam mengekspresikan gen.
•
Sebagai elemen genetik yang bereplikasi secara
otonom, plasmid dapat digunakan sebagai vektor
yang akan disisipi DNA asing. Untuk digunakan
sebagai vektor, suatu plasmid harus memenuhi
beberapa persyaratan, yaitu :
• Plasmid harus berukuran kecil, karena efisiensi transfer DNA asing dalam
plasmid berukuran lebih dari 15 kb akan berkurang secara bermakna.
• Plasmid mempunyai situs pengenalan (recognition sites) enzim restriksi
yang spesifik, sebagai lokasi penyisipan DNA asing.
• Plasmid harus merupakan vektor episomal atau vektor integratif, sehingga
dapat mengintegrasikan dirinya dan DNA asing ke salah satu kromosom sel penerima. Pada saat ini, plasmid integratif yang efisien telah tersedia
untuk berbagai spesies, termasuk untuk jamur berfilamen
seperti Aspergillus nidulans dan Neurospora crassa
• Plasmid dapat memiliki beberapa ori, sehingga dapat bereplikasi di
beberapa jenis sel penerima. Vektor seperti ini dinamakan shuttle cloning vector , dimana ori pertama umumnya dikenali oleh sel E. coli , sedang ori keduanya dikenali sel penerima yang lain. Selain itu, plasmid dapat memiliki satu broad host range ori , sehingga plasmid tersebut dapat dikenali oleh berbagai mikroorganisme.
• Plasmid mempunyai satu atau lebih gen marka seleksi yang digunakan
untuk menyeleksi sel penerima yang membawa konstruksi plasmid-DNA asing.
KONJUGASI
Untuk konjugasi berlangsung, dua sel bakteri hidup
bersentuhan secara angsung dengan satu sama lain. Kontak
antara sel-sel ini dicapai dengan menggunakan pilus
konjugasi. Pilus adalah Istilah (jamak: pili) yang mengacu
pada struktur seperti rambut berbasis protein yang
membentang dari sel bakteri. Beberapa pili digunakan
untuk menempel pada permukaan, namun khusus
konjugasi pilus digunakan khusus untuk menempel pada sel
lain dan memfasilitasi pemindahan DNA. Sel yang akan
mentransfer DNA disebut sel donor dan membangun pilus
konjugasi melekat pada selnya. Konjugasi pilus adalah,
struktur seperti pipa berongga yang menghubungkan
sitoplasma sel donor ke sitoplasma sel resipien.
TRANSFER PLASMID
Setelah sitoplasma donor dan sel resipien secara fisik
terhubung, sekarang saatnya untuk transfer DNA. Jika
sel donor berisi plasmid, bagian melingkar DNA ekstra,
plasmid dapat ditransfer ke sel penerima. Hal ini
dilakukan dengan menyalin plasmid dan pengiriman
untai DNA salinan ke penerima melalui pilus konjugasi.
Hasil akhir adalah salinan plasmid di kedua donor dan
sel resipien. Mungkin yang paling menarik adalah
kenyataan bahwa plasmid, selain gen lain, membawa
gen yang memungkinkan sel penerima untuk menjadi
konjugasi donor itu sendiri! Sekarang sel penerima juga
dapat menyebarkan plasmid ke sel-sel baru.
Transformasi
•
Transformasi genetik adalah proses pengambilan DNA
asing oleh sel penerima, yang menghasilkan sel
transforman atau sel rekombinan. DNA asing
merupakan DNA yang dilepaskan oleh sel donor, baik
berupa fragmen DNA bebas atau fragmen DNA yang
disisipkan dalam suatu vektor (L. Snyder & W.
Champness, 1997).
Jenis-jenis transformasi
•Heat shock
(kejutan panas)
–Mendinginkan
memanaskan
dan
mendinginkan
kembali
–
bakteri,maka
DNA dapat
masuk ke dalam
sel.
• Teknik ini ditemukan oleh trio
peneliti Stanley Cohen,Annie Chang,Leslie Hsu pada tahun 1972.
Jenis-jenis transformasi
•Elektroforasi
mengejutkan sel bakteri dengan medan listrik berkekuatan tinggi (10-20 kV/cm). Saking terkejutnya,akan terbentuk lubang-lubang pada dinding sel yang bisaditerobos DNA
plasmid berukuran besar dan kemudian lubang tersebut akan tertutup dengan
