Prinsip PCR Adalah Penggunaan Polimerase

(1)

Prinsip PCR adalah pengguna

Prinsip PCR adalah penggunaan polimerase an polimerase termostabtermostabil (Taq polymerase) selama beberapa siklus. Dimana ada 3 il (Taq polymerase) selama beberapa siklus. Dimana ada 3 langkalangkah utamah utama yang dilakukan pada setiap siklus

yang dilakukan pada setiap siklus tersebut. Adapun langkah tersebut adalah sebagai berikut :tersebut. Adapun langkah tersebut adalah sebagai berikut :

1.

1. DeDenanatuturarasisi

Den

Dengan gan terjterjadiadinya nya dendenaturaaturasi si yanyang g diladilakukakukan n padpada a temtemperaperatur tur 94°C selam94°C selama a 30-630-60 0 detdetik ik dardari i untauntaian ian ganganda da DNA ( DNA ( doubdouble le –– stranded DNA) sehingga sequence target akan

stranded DNA) sehingga sequence target akan muncul.muncul.

1.

1. AnAnnenealaliningg

Pen

Pendingdinginan inan yanyang g diladilakukakukan n padpada a temtemperaperatur tur 45-645-60°C 0°C selaselama ma 60-1260-120 0 detidetik k padpada a setisetiap ap siklusiklus s memmemungkiungkinkankan n primprimer er untuuntukk melekat pada target.

melekat pada target.

1.

1. ExExtetensnsioionn

Sintesis DNA komplementer baru oleh

Sintesis DNA komplementer baru oleh enzim polimerase dilakukan pada temperatur 72°C selama 60-120 detik enzim polimerase dilakukan pada temperatur 72°C selama 60-120 detik sehingga terbentuksehingga terbentuk kembali DNA rantai ganda .

kembali DNA rantai ganda .

Dima

Dimana na setisetiap ap siklusiklus s terstersebut ebut memmemperbperbanyaanyak k dua kali dua kali jumjumlahlahDNADNAdan siklus dan siklus tersetersebut diulang 20-35 but diulang 20-35 kalikali. . SehSehingga padaingga pada akhir

akhir PCRPCRakan diperoleh amplifikasi sebanyak 10akan diperoleh amplifikasi sebanyak 106 6 ––₁₀₁₀99_{kali dari jumlah DNA ta}_{kali dari jumlah DNA target awal.}_{rget awal. Kemudian prod}_{Kemudian produk amplifikasi tersebut}_{uk amplifikasi tersebut}

dibaca pada gel elektroferesis. dibaca pada gel elektroferesis.

Reaksi amplifikasi ini demikian sensitif

Reaksi amplifikasi ini demikian sensitif sehingga kurang dari 10 molekul DNA sehingga kurang dari 10 molekul DNA target dapat membtarget dapat memberi sinyal eri sinyal positif. Untuk mencegahpositif. Untuk mencegah kontam

kontaminasi aerosol inasi aerosol dari hasil amplifikasi spesimen lain dari hasil amplifikasi spesimen lain yang dapat menyebayang dapat menyebabkan hasil positif bkan hasil positif palsu maka di dalam disertakanpalsu maka di dalam disertakan enzim Uracil N-Glycosylate (UNG) yang mengenali dan mengkatalisa destruksi DNA yang mengandung urasil tidak terdapat dalam enzim Uracil N-Glycosylate (UNG) yang mengenali dan mengkatalisa destruksi DNA yang mengandung urasil tidak terdapat dalam DNA kuman tetapi ada dalam

DNA kuman tetapi ada dalam amplikon karena reagen PCR menggunakan urasil. Amplikon yang mugkin amplikon karena reagen PCR menggunakan urasil. Amplikon yang mugkin terbawa akan dihancurkaterbawa akan dihancurkann terlebih dahulu oleh UNG

terlebih dahulu oleh UNG sehingga tidak ikut proses amplifikasi, dengan demikian mengurangi salah satu sehingga tidak ikut proses amplifikasi, dengan demikian mengurangi salah satu kemungkinakemungkinan hasil n hasil positif positif palsu. Adanya kontrol negatif pada

palsu. Adanya kontrol negatif pada pemeriksaapemeriksaan n menguranmengurangi gi kemungkkemungkinan kontaminasi, maka inan kontaminasi, maka semua peralatan dan perlengkapansemua peralatan dan perlengkapan laboratorium harus dibersihkan secara teratur dan menggunakan perlengkapan habis pakai. Pada hasil biakan negatif, PCR dapat laboratorium harus dibersihkan secara teratur dan menggunakan perlengkapan habis pakai. Pada hasil biakan negatif, PCR dapat memberika

memberikan n hasil positif. Hal hasil positif. Hal ini kemungkinan karena kuman specimen terlalu ini kemungkinan karena kuman specimen terlalu sedikit untuk dapat tumbuh dalam biakan atausedikit untuk dapat tumbuh dalam biakan atau respon imun penderita yang menyebabkan kuman tak dapat tumbuh. Sedangkan hasil negatif palsu

respon imun penderita yang menyebabkan kuman tak dapat tumbuh. Sedangkan hasil negatif palsu dapat diakibadapat diakibatkan karenatkan karena specimen tidak mengandung DNA kuman M. tuberkulosis. walaupun berasal dari

specimen tidak mengandung DNA kuman M. tuberkulosis. walaupun berasal dari penderita TB atau kemungkinan dapat disebabkpenderita TB atau kemungkinan dapat disebabkanan karena kesalahan teknis. Untuk menghindari kemungkinan ini,

karena kesalahan teknis. Untuk menghindari kemungkinan ini, maka pada setiap pemeriksaan disertakan kontrol positif yangmaka pada setiap pemeriksaan disertakan kontrol positif yang men

mengandgandung ung DNA DNA kumkuman an M. M. tubtuberkuerkulosis. losis. UpaUpaya ya lain lain adaadalah lah menmenghilaghilangkangkan n inhiinhibitobitor r yanyang g berpberpotenotensi si dapdapat at menmenurunkurunkanan sensitivitas PCR.

sensitivitas PCR.

Pemeriksaan

Pemeriksaan PCRPCRtelah dilakukan di beberapa laboratorium dengan target IS 6110.telah dilakukan di beberapa laboratorium dengan target IS 6110. Dimana waktu yang Dimana waktu yang diperlukan antaradiperlukan antara 24-36 jam. Sensitivitas PCR di dalam penegakan diagnosis efusi pleura

24-36 jam. Sensitivitas PCR di dalam penegakan diagnosis efusi pleura tuberkulotuberkulosis sekitar sis sekitar 20-81%. PCR positif 100% pada kultur20-81%. PCR positif 100% pada kultur positif efusi pleura tuberkulosis dan sekitar 30-60%

positif efusi pleura tuberkulosis dan sekitar 30-60% PCR positif pada kultur negatif cairan pleura. Pada sampel apusan BTA sputumPCR positif pada kultur negatif cairan pleura. Pada sampel apusan BTA sputum positif dij

positif dijumpai sensitiumpai sensitivitas PCR vitas PCR berkisar berkisar 73,6–100%. Se73,6–100%. Sedangkan sadangkan sampel apumpel apusan BTA spsan BTA sputum utum negatif dijnegatif dijumpai sensitumpai sensitivitas PCRivitas PCR 70% dan spesitifita

70% dan spesitifitasnya snya 98,6 %. 98,6 %. Selain itu pada aSelain itu pada apusan BTA positpusan BTA positif dengan pemeriksaif dengan pemeriksaan PCR dapaan PCR dapat dijumpai hasil yang negat dijumpai hasil yang negatif.tif. Yang mana hal ini

Yang mana hal ini dapat terjaddapat terjadi karena adanya infeksi i karena adanya infeksi M. atipikal dan inhibitor dalam proses amplifikasi.M. atipikal dan inhibitor dalam proses amplifikasi.

PCR (Era Uji Diagnoistik Molekuler Terkini)

UJI DIAGNOSTIK MOLEKULER

(2)

Dalam bidang kedokteran (manusia maupun hewan), uji-uji diagnostik merupakan

salah satu metode untuk menangani kasus penyakit. Berbagai uji diagnostik telah

dikembangkan, baik yang didasarkan pada teknik kultur agen penyakit, reraksi

kimia/biokimia maupun reaksi imunologik. Dengan berkembangnya teknologi dalam

bidang biologi molekuler, maka pengembangan uji-uji diagnostik mulai diarahkan

kepada teknologi tersebut yang menggunakan materi genetik sebagai dasar

pengujiannya.

Materi genetik yang berupa asam nukleat baik DNA (Deoxy-ribose Nucleic Acid)

maupun RNA (Ribo Nucleic Acid) mengandung tiga komponen, yaitu: 1) basa (purin

dan pirimidin); 2) gula (deoksiribosa untuk DNA dan ribosa untuk RNA); dan 3) fosfat.

Basa purin yang terdapat pada DNA maupun RNA adalah sama, yaitu Adenine [A] dan

Guanine [G] sedangkan basa pirimidin berbeda, untuk DNA adalah Cytocine [C] dan

Thymine [T] dan untuk RNA kedudukan Thymine digantikan oleh Uracil [U] Kedua

unsur basa tersebut (purin dan pirimidin) akan berpasangan membentuk kode-kode

genetik pada DNA maupun RNA melalui ikatan hidrogen (A akan berpasangan dengan

T [pada DNA] atau A dengan U [pada RNA]; dan G dengan C). Unsur gula dan fosfat

akan membentuk struktur DNA dan RNA. DNA memiliki struktur rantai ganda

sedangkan RNA memiliki rantai tunggal. Struktur DNA lebih stabil bila dibandingkan

dengan RNA. Berdasarkan materi genetik tersebut, uji-uji diagnostik dikembangkan

melalui teknik-teknik molekuler seperti hibridisasi dengan probe asam nukleat;

polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP)

dan sekuensing asam nukleat.

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Salah satu perkembangan teknik biologi molekuler yang sangat membantu dalam

pengembangan uji-uji diagnostik adalah PCR. PCR dapat mengamplifikasi DNA dan

jumlah yang sedikit menjadi jumlah yang dapat dideteksi/banyak. Adanya penemuan

DNA polymerase (Taq polymerase) yang stabil pada temperatur tinggi dan

pengembangan alat yang mengatur temperatur proses PCR secara otornatis, telah

membuat PCR dapat digunakan untuk uji-uji diagnostik secara praktis. DNA

polymerase adalah enzim yang dapat mensintesis rantai DNA yang baru dan DNA

yang sudah ada. Penemuan enzim yang tahan panas sangat membantu untuk

mensintesis DNA baru, karena tahap awal proses PCR dilakukan dengan cara

pemanasan rantai DNA yang sudah ada pada temperatur 90°C.

Reaksi Rantai Polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu

teknik sintesis untuk mengamplifikasi atau melipatgandakan fragmen DNA target

secara invitro dengan eksponensial yang menggunakan primer atau pemula DNA

yang tepat. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA in vivo. Berbeda

(3)

maka pada proses PCR reaksi ini berjalan kontinu, tetapi hanya untuk satu segmen

tertentu saja dari suatu DNA.

Teknik PCR ditemukan pertama kali oleh Kary, B. Mullis pada tahun 1985. Impian

Mullis dimulai ketika di bulan April, malam Jumat, 1983, saat membawa

kendaraannya keluar kota pada bulan purnama menuju ke Negara bagian utara

California dimana Mullis mendapatkan inpirasi yang bermakna dengan menemukan

cara baru untuk mendeteksi urutan basa yang spesifik dari DNA. Penemuan yang

mempesonakan itu dipublikasi pada American Scientific, 1990, yang memberiny

peluang pada tahun 1993 mendapatkan hadiah Nobel dalam kimia atas penemuan

PCR. Semula Mullis menggunakan enzim Klenow fragmen E.coli DNA Polymerase I

untuk memicu perpanjangan potongan DNA yang spesifik. Namun, enzim ini tidak

dapat bertahan pada saat tahapan denaturasi dari PCR, sehingga mengharuskan

penambahan enzim yang baru lagi pada setiap siklus PCR. Kondisi ini merupakan

suatu hambatan yang kritis, khususnya pada teknik yang diharapkan berlangsung

secara automatis. Klenow enzim dapat bekerja baik pada potongan DNA yang pendek

(<200bp), tetapi tetapi tidak bis bekerja pada potongan DNA yang lebih besar, karena

hasilnya yang memberikan sensitifitas yang rendah dan memperlihatkan hasil yang

heterogen. Hal ini disebabkan karena tahapan annealing yang rendah dan perubahan

temperatur (37’C) yang harus disesuaikan untuk mengaktifkan enzim Klenow. Situasi

yang sangat memperihatinkan pada awal dimulainya PCR ini ialah bahwa teknik ini

dilakukan secara manual dari satu waterbath ke waterbath lainnya sesuai tahapan

dari PCR. Setelah beberapa tahun berikutnya didapatkan enzim thermostable DNA

Polymerase yaitu Taq DNA Polymerase, PCR menjadi sangat populer dalam penelitian.

Penemuan enzim ini juga memberi peluang untuk dilakukannya setiap tahapan PCR

secara automatis, sehingga PCR sekarang telah dapat dikerjakan dengan mesin.

Untuk mendeteksi potongan DNA yang spesifik dengan PCR diperlukan informasi dari

tiap mikroorganisme yang memiliki potongan DNA yang spesifik untuk golongannya.

Dengan merancang komplementer potongan DNA yang spesifik dari mikroorganisme

tersebut, maka dapat dihasilkan pemula DNA atau disebut juga primer. Potongan DNA

yang spesifik ini akan berikatan dengan pasangan yang komplementer dengannya,

dan inilah yang dilipatgandakan atau diamplifikasi sampai jutaan dalam waktu sekitar

4 jam pada mesin PCR. Untuk mendukung amplifikasi tersebut diperlukan berbagai

zat lainnya, kemudian divisualisasikan melalui elektroforesis dan proses hibridisasi.

Keseluruhan proses PCR membutuhkan waktu hanya 2 hari. Pada perkembangan

penggunaan PCR dilakukan pemurnian terhadap sampel yang akan di tes. Permunian

sampel DNA dilakukan dengan memakai metode Boom (1990). Metode ini

menggunakan Chaotropic agent guanidium thiocyanate (GuSCN) dan diatom. GuSCN

dan diatom menghilangkan hambatan secara efisien terhadap berbagai macam

sampel dari rumah sakit. GuSCN berfungsi untuk lisis dan menginaktifkan asam

nukleat, sedangkan partikel silica ataupun diatom berfungsi mengikat asam nukleat.

Untuk mengamplifikasi DNA dilakukan 30-40 kali siklus proses PCR. Satu siklus terdiri

dari 3 tahap, yaitu tahap denaturasi pada temperatur 95°C, tahap hibridisasi primer

pada temperatur 37° sampai 56°C dan tahap polimerisasi pada temperatur 72°C.

(4)

Secara umum, DNA yang akan diamplifikasi diapit oleh sepasang primer sintetik yang

merupakan potongan pendek dari DNA yang spesifik/komplementer yang berfungsi

sebagai template dari DNA yang akan diamplifikasi. DNA target yang akan

diamplifikasi didenaturasi terlebih dahulu dengan pemanasan, kemudian primer

ditambahkan pada DNA target dan temperatur diturunkan agan terjadi proses

hibridisasi. Bila tahap polimerisasi dimulai, maka rantai DNA target yang terdapat di

antara primer akan diperbanyak menjadi dua rantai dengan panjang yang sama

seperti DNA target. Dengan adanya pengulangan tahap-tahap denaturasi, hibridisasi

dan polimerisasi beberapa kali, maka DNA target akan diperbanyak secana efektif.

Bila enzim reverse transcriptase yang mensintesis DNA dan template RNA, digunakan

pada tahap awal proses PCR, maka RNA ribosom dan genomik dan virus RNAjuga

dapat diamplifikasi. Prinsip dasar suatu PCR adalah : pasangan primer

menghibridisasi sekuens komplemen terget pada rantai DNA yang sebelumnya telah

terdenaturasi. Sintesis DNA kemudian berlangsung dengan bantuan enzim polimerase

di sepanjang daerah diantara primer. PCR dilaksanakan dengan cara menginkubasi

sample pada temperatur yang berbeda pada tahap, dalam suatu siklus PCR, yaitu

tahap : 1. Denaturasi Dengan pemanasan 95 oC rantai DNA akan berpisah, karena

panas dapat merusak ikatan hidroksi antara basa-basa yang komplementar. 2.

Annealing ( penempatan / pemasangan primer ) Primer dipasangakan pada tempat

yang sesuai ( berkomplementer dengan rantai tunggal DNA ) melalui proses

pembentukan iktan hidroksi.Untuk proses pemasangan primer ini dibutuhkan

temperature yang berbeda dari setiap primer. 3. Extension ( Perpanjangan) Setelah

primer ditempatkan pada posisi yang tepat, dimulailah proses pemanjangan rantai

baru DNA yang berkomplementar, dengan bantuan enzim DNA polymerase sehingga

terbentuk suatu fragmen rantai ganda DNA yang spesifik. Enzim yang stabil pada

temperatur tinggi ini akan membantu proses penempaan nukleotida yang dibutuhkan

sampai terbentuknya suatu rantai ganda DNA, temperatur optimal yang dibutuhkan

untuk proses ini adalah 72o C. PCR dapat digunakan dalam uji-uji diagnostik untuk

mengamplifikasi asam nukleat dan agen-agen penyakit yang ada dalam jumlah

sedikit sehingga sensitifitas uji dapat ditingkatkan. DNA yang telah diamplifikasi

selanjutnya diidentifikasi dengan teknik hibridisasi yang rnenggunakan probe asam

nukleat yang spesifik, atau dengan analisis restriction fragment length polymorphism

(RFLP) dan elektroforesis pada gel agarose atau dengan cara sekuensing.

Perkembangan selanjutnya terhadap pemanfaatan mesin PCR, dibedakan antara PCR

unipleks dan PCR multipleks. Bila digunakan hanya satu pasang primer disebut PCR

unipleks, sedangkan PCR yang menggunakan lebih dari satu pasang disebut PCR

multipleks tak ada perbedaan pada tahapan denaturasi, annealing dan elongation,

terkecuali pada kandungan PCR-miks, waktu tahapan dan jumlah sikling temperatur.

PCR Unipleks dapat dipakai untuk diagnosis terhadap penyebab penyakit infeksi,

termasuk M. tuberkulosis dan mikobakterium lain, sedangkan PCR multipleks selain

digunakan untuk diagnosis, juga untuk tes resistensi terhadap OAT.

(5)

ELISA adalah suatu metoda immunokimia yang berdasarkan reaksi spesifik antara

antigen dengan antibodi yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi

dengan menggunakan enzim sebagai indikatornya. Dengan memiliki satu dari

komponen tersebut (antigen atau antibodi) yang dilabel dengan enzim dan diikatkan

dengan pendukung immunosorbent, maka akan terbentuk antigen-antibodi kompleks.

Pada metoda ELISA dengan antigen kompetitif, antibodi dilapiskan pada

immunosorbent (substrat padat). Kemudian antigen sampel dan antigen yang

berlabel enzim dimasukan kedalam immunosorbent sehingga terjadi kompetisi antara

antigen sampel dengan antigen berlabel enzim untuk berikatan dengan antibodi dan

terbentuk kompleks antibodi-antigen. Dengan tambahan substrat yang spesifik

terhadap kerja enzim, akan dihasilkan reaksi yang menghasilkan warna. Hasil warna

tersebut dapat dilihat secara visual atau diukur dengan menggunakan kolorimeter

atau spektrofotometer. Ciri utama metoda ini adalah menggunakan suatu indikator

enzim untuk reaksi immunologi (Burgess, 1995).

Teknik pengujian dengan metoda ELISA dapat dilakukan dengan beberapa

konfigurasi, pemilihan konfigurasi tergantung dari besar molekul yang akan dideteksi,

serta tingkat sensitifitas dan spesifitas yang dikehendaki. Beberapa konfigurasi

tersebut adalah:

A. ELISA Kompetitif

ELISA Kompetitif dapat dibedakan menjadi dua, yaitu:

1. ELISA kompetitif langsung

Konfigurasi ELISA langsung merupakan konfigurasi paling sederhana. Antibodi spesifik

dilapiskan pada mikroplat yang kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Analat

yang akan dideteksi bersama dengan enzim-hapten konjugat ditambahkan pada

mikroplat yang telah dilapisi dengan antibodi. Analat dan enzim-hapten konjugat

akan saling berkompetisi untuk mengikat antibodi yang dilekatkan pada permukaan

mikroplat. Banyaknya enzim-hapten konjugat yang dapat mengikat antibodi dapat

ditentukan dengan penambahan substrat senyawa pembentuk warna. Warna yang

terbentuk akan berbanding terbalik dengan jumlah analat yang terdeteksi dalam

contoh. Semakin banyak analat dalam contoh maka analat mempunyai kesempatan

yang lebih besar untuk mengikat antibodi, sehingga akan lebih sedikit enzim-hapten

konjugat yang mengikat antibodi. Akibatnya intensitas warna yang terbentuk

berkurang karena enzim yang bereaksi dengan substrat juga lebih sedikit.

2. ELISA kompetitif tak langsung

Pada metoda ini menunjukan bahwa warna yang ditimbulkan tidak langsung

disebabkan oleh antigen dan antibodi yang bereaksi. Dibutuhkan suatu antibodi

antispesies yang dilabel dengan enzim. Antigen dalam hal ini hapten protein konjugat

dilekatkan pada permukaan mikroplat dan kemudian diinkubasi selama waktu

(6)