Karakterisasi α-Amilase dari Bakteri Laut
Vibrio
sp. B10.2.8
Characterization of α -Amylase from Marine
Vibrio
sp.
B10.2.8
SKRIPSI
Margareth Pratiwi
10503025
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
Abstract
α -Amylases are responsible for hydrolysis of α -D-(1,4) glycosidic linkage in starch to produce oligosacharides. These enzymes have been used widely in many industrial fields, such as starch processing, textile, pharmacy, and detergent. An Indonesian marine isolate identified as Vibrio sp. B10.2.8 produces extracellular α-amylase. This research was conducted to characterize α-amylase of Vibrio sp. B10.2.8 which includes growth profile, temperature, and pH and temperature dependent profiles, molecular weight identification, and its ability to hydrolize raw starch. A 225 mL culture supernatant of Vibrio sp. B10.2.8 was precipitated by 70% saturated ammonium sulphate and the resulted ammonium sulphate fraction has a total activity of 2364,12 Units. α -Amylase of Vibrio sp. B10.2.8 secretion was growth associated with maximum activity occured at late exponential phase. The Vibrio sp. B10.2.8. amylase has optimal pH and temperature of pH 6 and 50 °C, respectively. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamid Gel Electrophoresis) and zymograph analysis showed that the enzyme have molecular weight of ~53,2 kDa. Furthermore, on it was found that α-amylase Vibrio sp. B10.2.8 can not hydrolize raw starch granule.
Abstrak
α -Amilase adalah enzim yang menghidrolisis ikatan α -D-(1,4)-glikosidik. Enzim ini memiliki alpikasi yang luas di industri, misalnya industri pemrosesan pati, tekstil, farmasi, dan detergen. Isolat laut Indonesia yang diidentifikasi sebagai Vibrio sp. B10.2.8 dapat memproduksi α -amilase. Penelitian dilakukan untuk mengarakterisasi α-amilase Vibrio sp. B10.2.8, yang meliputi optimasi waktu pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8, optimasi waktu pertumbuhan, pengaruh pH dan suhu terhadap aktivitas α-amilase , identifikasi berat molekul, dan analisis kemampuan α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 dalam menghidrolisis pati mentah. Sejumlah 225 mL kultur supernatan Vibrio sp. B10.2.8 diendapkan fraksinasi 70% jenuh amonium sulfat dan fraksi yang dihasilkan memiliki aktivitas total sebesar 2364,12 Unit. Produksi α-amilase terus meningkat seiring waktu pertumbuhan dan mencapai maksimum pada fasa pertumbuhan. Aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 optimum pada pH 6 dan suhu 50 °C. Hasil SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamid Gel Electrophoresis) dan zimograf menunjukkan bahwa enzim ini memiliki berat molekul ~53,2 kDa. Dari penelitian juga diketahui bahwa enzim ini tidak dapat menghidrolisis pati mentah.
Program Studi Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Bandung
Menerangkan bahwa skripsi yang disusun oleh:
Nama : Margareth Pratiwi NIM : 10503025
telah disetujui sebagai persyaratan untuk mendapatkan gelar Sarjana Kimia
Bandung, September 2007
Pembimbing
Dessy Natalia, Ph.D. NIP. 131923763
“ Terpujilah Tuhan, sebab kasih setia-Nya
ditunjukkan-Nya kepadaku dengan ajaib...”
(Mzm 31:22)
Karya ini aku persembahkan untuk:
Papa, Mama, Cynthia, Rudy
Ucapan Terima Kasih
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yesus dan Bunda Maria atas segala bimbingan, perlindungan, dan berkat yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dan penulisan skripsi ini.
Pelaksanaan tugas akhir dan penulisan skripsi telah melalui proses yang panjang yang melibatkan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa syukur dan ucapan terima kasih atas bantuan dan dukungan, baik secara moral maupun spiritual selama menyelesaikan skripsi ini kepada:
1. Dr. Dessy Natalia, Ph.D, selaku dosen pembimbing, atas bimbingan, petunjuk,
kesabaran, kepercayaan, dan dorongan yang besar kepada penulis dalam mengerjakan tugas akhir dan skripsi ini.
2. Dr. Muliawati Sindumarta atas bimbingan dan ilmu yang telah diberikan selama penulis melakukan penelitian tugas akhir.
3. Dr. Aminuddin Sulaeman, selaku dosen wali, atas bimbingan yang diberikan dan dukungannya.
4. Ketua Program Studi Kimia FMIPA ITB beserta Staf Pengajar yang telah membimbing penulis dalam menyelesaikan kuliah di Program Studi Kimia ITB.
5. Papa, Mama, Cynthia, dan Rudy atas doa, dukungan, motivasi, kasih sayang,
kebahagiaan, serta atas kebersamaannya.
6. Keluarga besar Ismail dan Ugut yang senantiasa memberikan doa, dukungan, kasih sayang, serta nasehatnya.
7. Julius Vernando Situngkir atas segala doa, kesabaran, dukungan, perhatian, dan kepercayaan yang telah diberikan kepada penulis selama mengerjakan tugas akhir.
8. Sahabat-sahabat seperjuangan, Keni, Sissy, dan Anna yang telah bersedia berdiskusi dan membantu penulis dalam menyelesaikan tugas akhir.
9. Fean, Iman, Bu Ferni, T’ Tina, Mas Tunjung atas bantuan, dukungan, dan kebersamaan yang telah diberikan selama mengerjakan tugas akhir di laboratorium.
10. T’ Dwita, T’Indi, Syifa, Mira, Dea, Bambang, Bu Prima, Ucik, Frisda, dan semua mahasiswa penelitian Laboratorium Biokimia atas semangat dan kebersamaannya. 11. Anggi, Dani, Maya, Dian, Yessi, Yoga, Felicia, Arfan, Yoga atas semua bantuan,
dukungan yang diberikan kepada penulis. Dan terima kasih untuk persahabatan yang telah terjalin selama ini.
12. Pak Yayat, pak Edi, pak Dadan, bu Esar, serta seluruh karyawan Program Studi Kimia ITB yang telah membantu dan memberikan kemudahan selama penulis kuliah.
13. Sr. Anciela, Iin, Probo, Janu, David, Agus, Gil atas semua doa, semangat, keceriaan, dan kebersamaan selama ini.
14. Keluarga besar Situngkir, Agnes, Thomas, Agung, Gilson, Ocep, Manuntun, Timotius, Gala, Martin, Bang Soni, Bang Felix, Yoseph, Tati, Sondang, dan Pengurus Mudika Borromeus 2005-2007 atas doa, dukungan, serta untuk persahabatan dan kebersamaan yang telah ada selama ini.
15. Teman-teman Kimia angkatan 2003, yang tidak mungkin disebutkan satu-satu, atas persahabatan yang telah kita jalin bersama yang tak akan terlupakan.
16. RU Internasional ITB 2007, atas pendanaan yang diberikan sehingga tugas akhir penulis dapat terlaksana.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih belum sempurna. Akan tetapi, penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan dapat menambah wawasan bagi semua pihak.
Terima kasih.
Bandung, September 2007
Daftar Isi
Abstract... ii
Abstrak... iii
Ucapan Terima Kasih ... vi
Daftar Isi ... viii
Daftar Tabel ... xi
Daftar Gambar ... xii
Daftar Lampiran... xiii
1 Pendahuluan... 1
1.1. Latar Belakang... 1
1.2. Tujuan Penelitian... 2
2 Tinjauan Pustaka... 3
2.1. Pati... 3
2.1.1. Pengertian dan karakteristiknya ... 3
2.1.2. Biosintesis pati di tumbuhan ... 9
2.1.3. Kebutuhan dunia akan pati... 10
2.2. Enzim pendegradasi pati... 11
2.2.1. Ciri khas keluarga α-amilase... 11
2.2.2. Mekanisme katalitik α -amilase ... 13
2.2.3. Sumber dan sifat α-amilase ... 14
2.3. Bakteri laut sebagai penghasil enzim bernilai ekonomis... 15
2.4. Vibrio sp. ... 16
2.4.1. Karakteristik Vibrio sp. ... 16
2.4.2. α-Amilase Vibrio sp. ... 17
2.6. Elektroforesis SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)... 19
3 Metode Penelitian ... 21
3.1. Alat ... 21
3.2. Bahan... 22
3.2.1 Bakteri Laut Vibrio sp. B10.2.8 ... 22
3.2.2 Zat Kimia ... 22
3.3. Cara Kerja... 22
3.3.1. Pembuatan media marine broth padat... 22
3.3.2. Peremajaan kultur bakteri Vibrio sp.B10.2.8 pada media marine broth padat ... 23
3.3.3. Pembuatan kurva pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8 dan aktivitas α-amilase selama pertumbuhan ... 23
3.3.4. Produksi α-amilase Vibrio sp. B10.2.8... 23
3.3.5. Pembuatan bufer fosfat 20 mM... 24
3.3.6. Pembuatan stok larutan KI/I2... 24
3.3.7. Pembuatan larutan pati 0,125% (b/v) untuk menentukan aktivitas α-amilase terhadap pati tergelatinisasi ... 24
3.3.8. Uji Aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 ... 25
3.3.9. Penentuan konsentrasi total protein... 26
3.3.10. Pengaruh pH dan suhu terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 ... 26
3.3.11. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gel Electrophoresis) ... 26
3.3.12. Zimografi... 27
3.3.13. Analisis gula pereduksi yang dilepas α-amilase dalam mendegradasi pati mentah ... ... 27
4 Hasil dan Pembahasan ... 28
4.3. Produksi α-amilase ... 31
4.4. Pengaruh pH terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 ... 31
4.5. Pengaruh suhu terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 ... 33
4.6. Identifikasi berat molekul α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 ... 34
4.7. Kemampuan hidrolisis pati mentah α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 ... 35
5 Kesimpulan ... 36
5.1 Kesimpulan... 36
5.2 Saran ... 36
Daftar Pustaka... 37
Lampiran A. Kurva pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8... 40
Lampiran B. Profil sekresi α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 ... 41
Lampiran C. Penentuan konsentrasi protein ... 42
Lampiran D. Pengaruh pH terhadap aktivitas α-amilase ... 43
Lampiran E. Pengaruh suhu terhadap aktivitas α-amilase ... 44
Lampiran F. Kemampuan hidrolisis pati mentah... 45
Daftar Tabel
Tabel 2.1 Karakteristik granul pati dari berbagai sumber... 4
Tabel 2.2 Ukuran dan distribusi granul pati... 4
Tabel 2.3 Pengaruh kandungan amilosa pada karakteristik granul pati ... 7
Tabel 2.4 Daerah lestari asam amino pada keluarga α-amilase ... 12
Tabel 2.5 Karakteristik α-amilase dari berbagai sumber ... 15
Daftar Gambar
Gambar 2.1 Struktur D-Glukosa ... 3
Gambar 2.2 Daerah amorf dan kristalin pada pati ... 5
Gambar 2.3 Pola difraksi sinar X granul pati dan kompleks amilosa ... 6
Gambar 2.4 Struktur amilosa ... 6
Gambar 2.5 Struktur amilopektin ... 8
Gambar 2.6 Proses swelling dan gelatinisasi butiran pati dalam air ... 9
Gambar 2.7 Struktur α-amilase dari Bacillus licheniformis ... 13
Gambar 2.8 Mekanisme katalitik Taka-α-amilase berdasarkan prediksi struktur tiga dimensi kompleks enzim-substrat ... 14
Gambar 2.9 Protein dalam larutan bufer... 18
Gambar 2.10 Protein dalam (NH4)2SO4... 18
Gambar 2.11 Proses dialisis protein dalam bufer ... 19
Gambar 4.1 Uji kualitatif sekresi α-amilase oleh Vibrio sp. B10.2.8 ... 29
Gambar 4.2 Pola pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8 dan profil α-amilase yang disekresikan ... 30
Gambar 4.3 Pengaruh pH pada sisi aktif enzim α-amilase ... 32
Gambar 4.4 Pengaruh pH terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8... 33
Gambar 4.5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8... 33
Daftar Lampiran
Lampiran A. Kurva pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8... 40
Lampiran B. Profil sekresi α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 ... 41
Lampiran C. Penentuan konsentrasi protein ... 42
Lampiran D. Pengaruh pH terhadap aktivitas α-amilase ... 43
Lampiran E. Pengaruh suhu terhadap aktivitas α-amilase ... 44
Lampiran F. Kemampuan hidrolisis pati mentah... 45
