KONVERSI ENZIMATIK TEMPERATUR TINGGI DENGAN ENZIM TERMOFILIK

(1)

KONVERSI ENZIMATIK TEMPERATUR TINGGI

DENGAN ENZIM TERMOFILIK

Luthfan Nur Dwianto

13012111

Pembimbing :

Prof. Dr. I Gede Wenten

PROGRAM STUDI TEKNIK KIMIA

FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2015

(2)

Konversi Enzimatik Temperatur Tinggi dengan Enzim Termofilik Halaman 1

Latar Belakang

Dalam dunia industrialisasi seperti saat ini, penggunaan proses industri dengan menggunakan penerapan prinsip-prinsip ilmu pengetahuan dan teknologi (IPTEK) merupakan hal yang lazim untuk dilakukan. Pendayagunaan dan eksploitasi organisme, sistem atau proses hayati pada pengolahan bahan baku dapat dilakukan untuk menghasilkan produk dan jasa yang dapat dijadikan nilai tambah dari sebuah produk. Terdapat tiga substansi pokok dalam proses bioteknologis, yaitu agen hayati, pendayagunaan dalam teknologi dan industri, serta produk atau jasa yang dihasilkan . Penggunaan enzim dalam proses industri merupakan salah satu penggunaan bioteknologi dalam proses kimia suatu industri berbasiskan bahan kimia.

Pemanfaatan enzim di dalam bioteknologi semakin menuntut terdapatnya enzim bersifat tahan dengan kondisi lingkungan yang cukup ekstrim, seperti enzim termostabil yang dapat melakukan aktivitas pada temperatur tinggi. Temperatur yang terlalu tinggi merupakan salah satu faktor terjadinya kerusakan enzim disamping faktor ketidakadaan kandungan senyawa kofaktor yang dapat melengkapi senyawa kimia yang dibutuhkan dalam suatu reaksi enzimatik.[1] Keuntungan melakukan reaksi dalam temperatur tinggi antara lain adalah mengurangi kontaminasi, meningkatkan kecepatan transfer massa, dan menurunkan viskositas dari larutan. [2]

Kestabilan rendah yang dimiliki oleh enzim tunggal ataupun enzim kompleks merupakan salah satu kekurangan yang paling umum terjadi pada pemanfaatan biokatalis dalam dunia industri. Sementara itu, mikroorganisme penghasil enzim memerlukan kondisi

physico-chemical yang ekstrim untuk tumbuh sehingga hal tersebut menjadi suatu

tantangan dalam menyeimbangkan kondisi operasi yang perlu dilakukan. [3. 4] Dalam penelitian lebih lanjut, enzim yang dihasilkan dari organisme termofiik memiliki kecenderungan lebih stabil terhadap kenaikan temperatur dibandingkan dengan enzim yang dihasilkan dari organisme mesofilik [5, 6] Sebuah mikroorganisme dikatakan mencapai kondisi termostabil ketika kondisi lingkungan telah mencapai temperatur melebihi temperatur optimum pertumbuhan mikroorganisme tersebut. [7]. Hal ini tentu bertolak belakang dengan definisi termostabil bila dilihati dari sudut pandang enzim yang berdasarkan fakta bahwa enzim dari mikroorganisme yang berada dalam temperatur di atas 90oC sudah dianggap termostabil, tanpa mempertimbangkan kondisi tersebut

(3)

sudah melebihi atau belum kondisi optimum pertumbuhannya. Kondisi termostabil dipengaruhi oleh gaya penstabil, seperti ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik, interaksi ionik, dan ikatan logam [8]

Enzim

Enzim berasal dari bahasa Latin yang memiliki arti ragi. Enzim dapat didefiniskan sebagai polipeptida yang mampu bertindak sebagai katalis secara spesifik. Fungsi enzim dipengaruhi oleh struktur primer, sekunder, tersier, dan kuartener protein enzim tersebut [9]

Selain itu, terdapat pula enzim yang memiiki gugus non protein yang berperan dalam aktivitasnya. Enzi mini disebut sebagai holoenzim. Holoenzim terdiri dari dua bagian, yaitu gugus protein yang biasa disebut dengan apoenzim dan gugus non protein yang biasa disebut dengan cofactor. Cofactor biasanya merupakan coenzim, seperti : molekul organik kompleks, NAD, FAD, CoA, vitamin, atau ion logam [10]

Enzim memiliki berat molekular bervariasi mulai dari 13.000 sampai jutaan Dalton. Namun pada umumnya, enzim memiliki berat molekular 30.000-50.000 Dalton. [9] Enzim bersifat spesifik, multifungsi, dan lebih efektif sebagai katalis dibandingkan dengn katalis kimiawi. Enzim bersifat spesifik dengan arti bahwa setiap enzim hanya mampu menjadi katalis pada substrat dan reaksi tertentu. [11]. Spesifikasi enzim ditentukan oleh faktor jenis asam amino yang berada pada sisi aktif enzim. Pada keberlangsungannya, tidak semua asam amino terlibat dalam keaktifan enzim, melainkan hanya sebagiann asam amino saja yang terlibat. Asam amino yang terlibat menyediakan tempat orientasi khusus antara sisi aktif dan substrat serta menyediakan cofactor yang

(4)

dibutuhkan untuk memudahkan reaksi. Dalam suatu reaksi yang dikatalisis oleh enzim, laju reaksi yang terjadi dapat meningkat hingga 108-1017 lebih cepat dengan penggunaan enzim [12]

Enzim merupakan bahan pendukung utama dalam suatu proses produksi gula atau glukosa dengan memecah molekul pati menjadi bagian yang lebih kecil dengan reaksi hidrolisis. Dalam proses, enzim berperan sebagai katalis untuk mempercepat reaksi hidrolisis dan reaksi lainnya yang terjadi dalam proses produksi. Kinerja enzim dapat dipengaruhi oleh kondisi operasi atau sistem tepat berlangsungnya reaksi, seperti tekanan, temperatur, dan senyawa-senyawa yang dapat berperan sebagai kofaktor reaksi enzimatik. Dalam mengkonversi senyawa pati menjadi senyawa gula yang lebih sederhana, pengaruh temperatur merupakan faktor yang cukup penting dikarenakan temperatur reaksi hingga batas tertentu dapat meningkatkan laju reaksi yang terlibat.

Enzim Amilase

Enzim amilase merupakan salah satu jenis enzim hidrolase yang umum digunakan terutama dalam industri pangan. Enzim hidrolase berperan sebagai katali reaksi hidrolisi air pada suatu substrat melalui substitusi nukleofilik. Enzim ini biasa digunakan pada sintesis organik. Enzim hidrolase merupakan enzim yang paling banyak digunakan dalam industri. [13]. Selain enzim amilase, terdapat enzim hidrolase lainnya, seperti enzim esterase, lipase, protease, glikosidase, dan fosfatase[13].

Ohlsson mengusulkan klasifikasi enzim pengolah pati enjadi α- dan β-amilase dengan didasari oleh tipe anomeri gula yang dihasilkan dari reaksi enzimatik yang terjadi dalam penggunaan salah satu jenis enzim tesebut. Enzim amilase merupakan enzim yang secara umum diketahui dengan kemampuannya untuk mengkatalisis reaksi hidrolisis pati dan glikogen. [14] Enzim amilase termasuk dalam jenis enzim glikohidrolase. [11] Dalam penggunaannya, terdapat berbagai enzim amilase yang sudah cukup banyak digunakan, antara lain enzim α-amilase, β-amilase, glukoamilase, pululanase, dan transglukosidase. [14]

(5)

Enzim α-amilase

Enzim α-amilase memiliki nama kimiawi yaitu endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase. Enzim α-amilase merupakan enzim ekstraseluler yang mampu memotong ikatan 1,4-α -D-glikosidik antara monomer glukosa pada rantai linier amilosa. Enzi mini dikategorikan sebagai endoenzim karena pemotongan pati dilakukan secara acak dari dalam [16]. Enzim α-amilase disusun protein yang tersusun dari 3 domain, yaitu domain A, B, dan C. Enzim pula dilengkapi oleh ion kalsium yang berperan sebagai stabilisator dan activator allosteric [17]. Beberapa enzim memiliki lebih dari satu bagian aktif untuk mengikat substrat supaya enzim dapat mengikat substrat lain ketika sudah terikat dengan suatu substrat tertentu. Sifat enzim inilah yang disebut sebagai allosteric. Enzim α-amilase bersifat calcium metalloenzymes sehingga tidak dapat berfungsi tanpa adanya ion kalsium [18]

Sebagian besar enzim α-amilase memotong karbohidrat rantai panjang baik secara endoamilase ataupun eksoamilase. Namun, pada beberapa enzim α-amilase yang memotong karbohidrat secara eksoamilase, proses reaksi bergantung pada sumber enzim α-amilase yang digunakan. Hasil penguraian α-amilase adalah dekstrin, limit dekstrin, oligosakarida, dan turunan siklodextrin. Dextrin adalah campuran

(6)

oligosakarida kompleks yang memiliki rumus molekul C16H10O3. Dextrin merupakan produk antara pati dan dekstrosa/glukosa (Kakhia). Limit dextrin adalah campuran oligosakarida dengan rantai yang lebih pendek.

Enzim α-amilase yang menghasilkan dextrin secara endoamilase berasal dari saliva dan pankreas manusia, pankreas babi, gandum, jamur (Aspergillus oryzae dan Rhizopus

niveus), bakteri temostabil (Bacillus subtilis, Bacillys licheniformis, Bacillus acidocaldarius, Clostridium, Dyctio glomus thermophilum, dan Bacilus stearothermophillus), sera bakteri lainnya seperi Streptococcus bovis. Enzim α-amilase

yang berasal dari bakterii termostabil cenderung lebih stabil pada temperatur 10oC lebih tinggi dati temberatur kerja enzim α-amilase yang dihasilkan bakteri biasa seperti

Bacillus amyloliquefaciens. Keberadaan ion kalsium tidak mempengaruhi sifat

termostabil enzim α-amilase yang dihasilkan.

Enzim α-amilase juga menghasilkan oligosakarida spesifik. Maltotriosa dihasilkan oleh enzim α-amilase secara eksoamilase dari Streptomyces griseus. Maltotetraosa dihasilkan oleh enzim α-amilase secara eksoamilase dari Pseudomonas stutzeri. Maltopentaosa dihasilkan oleh enzim α-amilase secara endoamilase dari Bacillus

licheniformis. Sedangkan, maltoheksaosa dihasilkan oleh enzim α-amilase secara

eksoamilase dari Aerobacter aerogenes secara endoamilase dari Bacillus circulans.

Mikroba Penghasil Amilase

Bakteri merupakan salah satu kelompok mikroorganisme yang dapat menghasilkan enzim amilase. Salah satu jenis bakteri yang menghasilkan enzim amilase merupakan bakteri yang bersifat termofilik. [22]. Pada tahap awal dalam mendapatkan mikroba yang berpotensi sebagai penghasil enzim adalah dengan mengisolasi dan menyeleksi mikroba tersebut dari habitat aslinya dalam kultur campuran. Mikroba yang diperoleh dari hasil isolasi harus memiliki kemampuan dan kelebihan untuk melangsungkan reaksi atau menghasilkan produk yang diinginkan. [23] Produksi amilase dengan menggunakan bakteri termofil mempunyai mempunyai kelebihan yaitu salah satunya dapat menurunkan kontaminasi.

(7)

Tabel 1. Karakteristik dan sumber enzim α-amilase termostabil [14] Bakteri sumber enzim Berat

molekul Toptimum (oC) pH optimum pH stabil B. stearothermophilus 48000 65-73 5-6 6-11 B. licheniformis 62650 90 7-9 7-10 B. subtilis - 95-98 6-8 5-11 Thermophile V-2 50000 70 6-7 9,2 B. Acidocaldarius 66000 70 3,5 4-5,5 Clostridium sp. - 80 4,0 2-7 D. thermophilum 70000 85-90 5,0 - Bakteri Termofilik

Mikroorganisme dapat dikelompokkan berdasarkan suhu optimum pertumbuhannya, yaitu mikroorganisme psikrofil, psikotrop, mesofil, termofil, dan hipertermofil. Bakteri psikrofil hidup pada kisaran temperatur 0 – 20oC, bakteri psikotrop hidup pada kisaran 0 – 35oC, bakteri mesofil hidup pada kisaran temperatur 20 – 45oC, bakteri termofil dapat tumbuh pada temperatur 45 – 65oC, dan bakteri hipertermofil dapat tumbuh pada temperatur di atas 90oC dan maksimal pada suhu 100oC [26]

Gambar 3. Suhu Pertumbuhan Mikroorganisme [26]

Kegunaan Enzim Amilase dari Bakteri Termofilik

Mikroorganisme termofilik mempunyai peran penting dalam dunia industri terutama industri yang menggunakan enzim sebagai katalis reaksi. Organise termofilik menghasilkan enzim-enzim yang memiliki ketahanan panas tertentu sehingga memiliki potensi pengaplikasian yang tinggi. Penggunaan enzim termostabil dalam bidang

(8)

bioteknologi dapat menurunkan biaya operasi dan dapat meningkatkan kecepatan reaksi dan konversi enzimatik dalam temperatur tinggi [24]

Sebagian besar sektor industri yang memanfaatkan enzim dalam proses kimiawinya, memanfaatkan enzim yang berasal dari mikroorganisme termofil. Sebagai contoh, industri pangan yang memecah amilum dengan enzim amilase yang memiliki sifat termofilik sehingga dapat melangsungkan reaksinya dalam temperatur yang relatif tinggi. [25]

Amilum merupakan suatu makromolekul seperti protein dan senyawa molekul karbohidrat lainnya [27] . Enzim amilase yang digunakan dalam proses dapat direcovery menggunakan beberapa metode, salah satunya menggunakan membran [8] Salah satu metode yang digunakan adalah penggunaan reaktor membran enzim yang digabungkan dengan ultrafiltrasi atau membran dialisis dengan penyesuaian besaran molecular

weight cut-off sehingga dapat menjaga enzim dan molekul besar lainnya dan

melewatkan molekul lain seperti produk dan inhibitor [29] Membran dapat digunakan untuk beberapa penggunaan dengan prinsip kerja berupa mengalirkan senyawa dengan besar molekul tertentu dan menyaring molekul dengan besar molekul tertentu sehingga amilum dengan ukuran molekul yang cukup besar dapat tertahan di membran. [28]

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim

Enzim mampu mempercepat reaksi suatu kimia dengan mekanisme penurunan energi aktivasi dari reaksi tersebut. Dalam proses penggunaan enzim dalam suatu reaksi kimia, kondisi lingkungan merupakan salah satu faktor utama yang perlu diperhatikan. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH dari lingkungan tempat enzim bekerja, konsentrasi enzim dan substrat, suhu, dan adanya aktivator atau inhibitor enzim. Aktivitas katalitik enzim di dalam sel mungkin diatur secara parsial oleh perubahan pH medium lingkungan.

a. pH

Aktivitas katallitik enzim di dalam sel diatur secara parsial oleh perubahan pH medium lingkungan. pH lingkungan juga berpengaruh terhadap kecepatan aktivitas enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi. Hal ini disebabkan konsentrasi ion hidrogen mempengaruhi struktur 3 dimensi enzim dan aktivitasnya. Setiap enzim memiliki pH

(9)

optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan aktivitas maksimal. pH optimum enzim tidak perlu sama dengan pH lingkungan normalnya dengan pH yang mungkin sedikit di atas atau di bawah pH optimum. Pada pH optimum, struktur tiga dimensi enzim paling kondusif untuk mengikat substrat.

Enzim sangat bergantung pada pH. Enzim memiliki gugus ionic pada bagian sisi aktifnya yang sangat dipengaruhi oleh pH asam atau basa larutan. Perubahan pH mampu menyebabkan perubahan bentuk sisi aktif enzim yang mempengaruhi aktivitas serta kinetika enzim. Fenomena ini digambarkan sebagai kurva pH optimum yang ditunjukkan pada Gambar 3. Selain perubahan bentuk sisi aktif enzim, bentuk tiga dimensi enzim juga berubah. Oleh karena itu, enzim hanya mampu aktif pada pH tertentu saja. Hal ini dapat dilihat pula pada Gambar 4.

Nilai pH optimum suatu enzim dapat diprediksi secara teoritis dengan mengetahui karakteristik sisi aktif enzim. Akan tetapi, karakteristik sisi aktif enzim sangat sulit diketahui sehingga penentuan pH optimum biasanya dilakukan melalui eksperimen [10]

Gambar 4. Kurva pH dan aktivitas enzim [20]

b. Konsentrasi enzim dan substrat

Kecepatan suatu reaksi yang menggunakan enzim bergantung pada konsentrasi enzim yang digunakan sebagai katalisator. Kecepatan reaksi bertambah seiring dengan bertambahnya konsentrasi enzim hingga batas tertentu. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh konsentrasi substrat. Pada batas konsentrasi tertentu, tidak terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi substrat diperbesar.[19]

(10)

Temperatur berpengaruh besar terhadap aktivitas enzim. Semua enzim bekerja dalam rentang temperatur tertentu pada tiap jenis organisme. Secara umum, untuk kenaikan sebesar 10oC di atas suhu minimum, aktivitas enzim akan meningkat sebanyak dua kali lipat hingga mencapai kondisi optimum. Peningkatan suhu eksternal secara umum akan meningkatkan kecepatan reaksi kimia enzimatik, tetapi kenaikan temperatur yang terlalu tinggi dapat menyebabkan kerusakan pada enzim atau sering disebut dengan denaturasi enzim. Denaturasi enzim merupakan kerusakan struktur enzim akibat pengaruh eksternal. Denaturasi enzim di atas suhu optimum akan menyebabkan terjadinya kematian pada sel organisme, tetapi beberapa organisme mampu bertahan hidup dan tetap aktif pada temperatur yang sangat tinggi.

Peningkatan temperatur akan mempercepat reaksi. Akan tetapi, terdapat batasan maksimum temperatur tertentu yang sebaiknya digunakan pada reaksi enzimatik. Jika temperatur melebihi batas maksimum tersebut, enzim akan terdenaturasi sehingga laju reaksi dari reaksi tersebut akan menurun. Peningkatan aktivitas enzim di bagian awal kurva temperatur dikenal sebagai temperatur aktivasi. Kinetika yang dihasilkan beragam sesuai dengan persamaan Arrheniusnya. Sedangkan penurunan aktivitas di bagian akhir kurva diketahui sebagai temperatur inaktivasi atau denaturasi termal yang dapat dinyatakan dinyatakan juga mengikuti persamaan Arrhenius. Energi aktivasi reaksi yang dikatalis enzim berkisar di antara 4 – 20 kcal/g mol, sedangkan energi deaktivasi bervariasi antara 40 – 130 kcal/g mol. [10]

Tabel 2. Karakteristik dan sumber enzim α-amilase yang menghasilkan malltosa dan

turunannya [14] Sumber

Enzim

Berat molekular

Tstabl (oC) pH stabil Toptimum (oC) pH optimum Produk Streptomyces griseus 55000 <40 3.5-6.5 45 5.6-6.0 Maltotriosa Pseudomonas stutzeri 56000 35 6.0-10.5 45 8 Maltotetraosa Bacillus licheniformis 22500 <60 8 76 5.0-8.0 Maltopentaosa Aerobacter aerogenes 48000-65000 50 5.0-10.0 52 7.0 Maltoheksaosa Bacillus circulans 48000-67000 50 6.0-9.0 60 6.8 Maltoheksaosa

(11)

Gambar 4. Kurva temperatur dan aktivitas enzim [21] Enzim Termostabil

Termostabil adalah istilah yang dapat didefinisikan dalam sejumlah arti dan bersifat relatif. Definisi termostabil umumnya dihubungkan dengan sifat alami dari enzim dan sumber penghasil enzim. Enzim termostabil sering dikenal dengan enzim termozim. Enzim termozim merupakan enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme termofilik. Enzim termozim atau termostabil tidak mengalami denaturasi akibat naiknya suhu lingkungan dan menunjukkan aktivitas optimum pada suhu tinggi (60-120oC). Enzim termostabil umum digunakan untuk meneliti beberapa hal, seperti evolusi enzim, mekanisme molekuler, termostabil protein, dan batas suhu maksimum.

Enzim termostabil memiliki mekanisme katalitik yang sama dengan enzim mesofilik. Namun, dengan ketahanan enzim termostabil memiliki nilai komersial yang lebih besar. Enzim termostabil memiliki beberapa nilai ekonomis, diantaranya :

1. Stabil dalam penyimpanan yang akan mengurangi biaya produksi.

2. Reaksi berlangsung pada suhu tinggi sehingga akan mengurangi kontaminasi oleh bakteri mesofilik.

3. Lebih tahan terhadap pelarut, detergen, dan senyawa denaturan

4. Pada suhu tinggi, proses fermentasi akan berlangsung lebih cepat sebagai hasil reaksi enzim akan meningkat sampai pada rentangan suhu tertentu.

(12)

Enzim termostabil bukan hanya tahan terhadap denaturasi panas, tetapi juga dapat meminimalisasi risiko kontaminan dan dapat menggeser arah reaksi kearah pembentukan produk.

Referensi:

[1] : Pujawati, S., “Seleksi, Karakterisasi, dan Identifikasi Bakteri Termofilik Pasca Erupsi Merapi Sebagai Penghasil Enzim Amilase”, TIdak Diterbitkan, Universitas Negeri Yogyakarta, 2012.

[2] : Rakhmawati, A.; Yulianti, E.; Rohaeti,E., “Seleksi Bakteri Termofilik Pasca Erupsi Merapi Sebagai Penghasil Enzim Amilase dan Protease”, Tidak Diterbitkan, Universitas Negeri Yogyakarta, 2012.

[3]: Kushner, D.J., “Microbial Life in Extreme Enviroments”, San Fransisco : Academic Press, 1978.

[4]: Sonnleitner, B., dalam: Fiechter, A., Ed. “ Microbial Activities”, Berlin : Akademie Verlag, 1984, 69.

[5]: Ng, T.K., Kenealy, W.R., dalam : Brock, T.D., Ed., “Thermophiles. New York : J.Wiley and Sons, 1986. 197.

[6]: Fontana, A., dalam : Proceeding 3rd Europe Biotechnology Symposium. Vol. 1, Munchen, 1984, 221.

[7]: Campbell, L..; Pace, B., “Journall Application Bacteriology. 31 (1968), 24.

[8]: Widiasa, I.N.; Wenten, I.G., “Combination of Reverse Osmosis and Electrodeionzation for Simultaneous Sugar Recovery and Salts Removal From Sugary Wastewater”, Reaktor. 2 (2008). 91-97.

[9]: Parkin, K.L., “Enviromental Effects on Enzyme Activity in Nagodawithana”, Enzymes in Food Engineering, 3rd ed., Academic Press Inc., 1993, 480.

[10]: Shuler, M.L.; Kargi, F., “Bioprocess Engineering: Basic Concepts”, 2nd

Ed., Prentice Hall PTR, 2002.

[11] : Whitehurst, R.J.; Oort, M. V., “Enzymes in Food Technology”. 2nd

Ed., Blackwell Publishing Ltd. 2010.

[12]: Bisswanger, H., “Practical Enzymology”, 2nd

Ed., Wiley-Blackwell, 2011.

[13]: Johannes, T.; Simurdiak, M.R.; Zhao, H., “Biocatalysis”, Encyclopedia of Chemical Processing. Taylor and Francis (2006), 101-110.

[14]: The Amylase Research Society of Japan, “Handbook of amylases and related enzymes”, Pergamon Press, 1988.

(13)

[15] : Maarel, M.J.E.C. van der; Veen, B. van der; Uitdehaag, J.C.M.; Leemhuis, H.; Dijkhuizen, L., “Properties and applications of starch-converting enzymes of the alpha-amylase family”, Journal of Biotechnology 94 (2002), 137-155.

[16] : Pandey, A.; Nigam, P.; Soccol, C.R.; Soccol, V.T.; Singh, D.; Mohan, R., “Review: Advances in Microbial Amylases”, Biotechnology Applied Biochemistry, 31 (2000), 135-152.

[17] : Souza, P.M. de; Magalhaes, P. de O., “Application of microbial alpha-amylase in industry – a review”, Brazilian Journal of Microbiology 41 (2010), 850-861.

[18] : Stein, E.A.; Hsiu, J.; Fischer, E.H, "Alpha-amylases as calcium-metalloenzymes. I. Preparation of calcium-free apoamylases by chelation and electrodialysis", Biochemistry 3 (1964), 56– 61.

[19] : Poedjiadi, A.; Supriyanti, F.M., “Dasar-dasar biokimia”, UI Press. Jakarta. 2009. [20] : Bisswanger, H., “Practical enzymology”, 2nd

Ed., Wiley-Blackwell. 2011. [21] : Bisswanger, H., “Enzyme Assays”, Perspective in Science 1 (2014), 41-55.

[22] : Indrajaya; Madayanti, F.; Akhmaloka, “Isolasi Identifikasi Mikroorganisme Termofil Isolat”, Jurnal Mikrobiologi Indonesia (8).

[23] : Handayani, D.; Mubarik, N.R.; Listiyawati, “Isolasi dan Karakterisasi Amilase Ekstraseluler dari Limbah Cair Tapioka”, 2002.

[24] : Heru, P., “Kandungan Selenium Total Dalam Bakteri Termofilik Terseleksi Dari Sumber Air Panas”, 2006. Institut Pertanian Bogor

[25] : Dessy, C.S., “Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Amilase Kasar Termofilik dari Sumber Air Panas Panen Sibirubiru Sumatera Utara. USU Repository. Sumatera Utara.

[26] : Prescott, “Microbiology Sixth Edition”, Mc-Graw Hill. Amerika

[27] : Wenten, I.G., “Mechanisms and Control of Fouling in Crossflow Microfiltration”, Filtration & Separation (1995) 252-253.

[28] : Wenten et al. “Method for The Removal of Components Causing Turbidity, From a Fluid, By Means of Microfiltration”, US Patent 5560828. 1996.

[29] :Wenten, I.G.; Widiasa, I.N., “Enzymatic hollow fiber membrane bioreactor for penycilin hydrolysis”, Desalination 149 (2002) 279-285.