Metaboromikusu ni yoru kyusei jinshogai (AKI) hatsusho ni taisuru nyochu baiomaka tansaku

Title Sub Title Author Publisher Publication year Jtitle Abstract. Notes Genre URL. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org). メタボロミクスによる急性腎障害(AKI)発症に対する尿中バイオマーカー探索 松浦, 亜里沙(Matsuura, Arisa) 慶應義塾大学湘南藤沢学会 2014 生命と情報 No.21 (2014. ) ,p.54- 65 通常, 様々な外科的手術の後は集中治療室にて患者の経過観察を行う。その際, 少数の患者は急性腎障害(acute kidney injury ; AKI)を発症する。AKIとは腎機能が低下している状態を指し, 比較的侵襲の大きな手術を行った後に, 敗血症や多臓器不全, 薬剤などを原因として引きおこされる病態である。末期腎不全に陥ることを阻止するために, 腎臓 に障害が加わった最も早期の段階を捉えようとする新しい概念として提唱された。現在のAKIの診 断には多くの時間を必要とするため治療の開始が遅れ, 重症化に陥るリスクが高くなる。従って, 早期にAKIを予測出来るバイオマーカーが必要とされている。尿中にはアミノ酸等の低分子代謝物 が豊富に含まれており, イオン性代謝物を網羅的に測定出来るキャピラリー電気泳動質量分析法(capillary electrophoresis-mass spectrometry ; CE-MS)とも非常に相性が良い。 本研究では, 手術後にAKIを発症しなかった患者23人(non-AKI), 軽度のAKIを発症した患者24人(mildAKI), そして重度のAKIを発症した患者14人(severe-AKI)の尿をCE-MSを用いて測定した。その結果, 143のイオン性代謝物を同定した。AKIの早期介入マーカーを見つけるために, ICUに入室した時点に焦点を置いて統計解析を行った。最終的にbeta-AlanineとAlanineが, nonAKIとsevere-AKIを判別できるバイオマーカー候補として同定された。また, non-AKIとmildAKIはほぼ全ての代謝物で同程度尿中に存在することが分かった。しかしながら, Trimethylamine N-oxideとCysteine S-sulfateの比をとることで, non-AKIとmildAKIを判別できる可能性が示唆された。これらのバイオマーカー候補が臨床現場で適用され, AKIの予後不良改善や死亡率の低下につながることを期待する。 慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス先端生命科学研究会 2014年度学生論文集 修士論文ダイジェスト Technical Report http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KO92001004-00000021 -0054.

2014年度修士論文ダイジヱスト. メタボロミクスによる急性腎障害（ A K I) 発 症 に 対 す る 尿中バイオマーカー探索. 慶 應 義 塾 大 学 大 学 院 政 策 • メ デ ィ ア 研 究 科 修 士 課 程 2年 松浦亜里沙. 要旨. 通常，様々な外科的手術の後は集中治療室にて患者の経過観察を行う. その際，少数の患者は急性 腎障害（acute kidney injury; A K I) を発症する. AKI とは腎機能が低下している状態を指し，比較的侵襲 の大きな手術を行った後に，敗血症や多臓器不全，薬剤などを原因として引きおこされる病態であ る. 末期腎不全に陥ることを阻止するために，腎臓に障害が加わった最も早期の段階を捉えようとす る新しい概念として提唱された. 現在のAKI の診断には多くの時間を必要とするため治療の開始が遅 れ，重症化に陥るリスクが高くなる. 従って，早期にAKIを予測出来るバイオマーカーが必要とされて いる. 尿中にはアミノ酸等の低分子代謝物が豊富に含まれており，イオン性代謝物を網羅的に測定出 来るキャピラリー電気泳動一質量分析法（capillary electrophoresis-mass spectrometry; CE-MS) とも非常 に相性が良い. 本 研 究 で は ， 手 術 後 に A K I を 発 症 し な か っ た 患 者 23 人 （ n o n -A K I) ， 軽 度 の A K I を 発 症 し た 患 者 24 人. (m ild -A K I) ， そ し て 重 度 の A K I を 発 症 し た 患 者 14人 （ se v e re -A K I) の 尿 を CE-M S を 用 い て 測 定 し た . そ の 結 果 ， 143 の イ オ ン 性 代 謝 物 を 同 定 し た . A K I の 早 期 介 入 マ ー カ ー を 見 つ け る た め に ， IC U に入室 し た 時 点 に 焦 点 を 置 い て 統 計 解 析 を 行 っ た . 最 終 的 に beta-Alanine とAlanine が ， non-AK I とsevere-AKIを 判別できるバイオマーカー候補として同定された. 程度尿中に存在することが分かった.. ま た ， non-A K I とm ild-AKI は ほ ぼ 全 て の 代 謝 物 で 同. し か し な が ら ， Trimethylamine N-oxide とCysteine S-sulfate の比を. と る こ と で ， non-A K I とm ild-AKI を 判 別 で き る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た .こ れ ら の バ イ オ マ ー カ ー 候 補 が 臨 床 現 場 で 適 用 さ れ ， AKI の 予 後 不 良 改 善 や 死 亡 率 の 低 下 に つ な が る こ と を 期 待 す る .. Keywords: AKI，メ夕ボロミクス，キヤピラリー電気泳動-質量分析法（ CE-MS) ，. バイオマーカー，尿. 54.

1 . 研究背景 1 . 1 急 性 腎 障 害 （acute kidney injury; AK1) 脳 や 心 臓 な ど の 様 々 な 外 科 的 手 術 の 後 ， 患 者 は 集 中 治 療 室 （ intensive care unit; ICU ) に て 加 療 さ れ る. そ の 際 ， 少 数 の 患 者 が A K I を 発 症 す る . AKI は 急 激 な 腎 機 能 低 下 を 示 し て い る 状 態 を 指 し ， 末 期 の 腎 不 全 と な る 事 態 を 阻 止 す る た め に ，侵襲が加わった最も早期の段階を 捉 え る こ と を 目 的 と し て 提 唱 さ れ た 概 念 で あ る （ Mehta e r a / . ，2007) .. A K I は， 胸 腹 部 な ど の 侵 襲 の 大 き な 手 術 に 伴 っ て 見 ら れ る こ と. が多い. AKI の直接的な原因としては，手術中の虚血，敗血症，薬剤性腎臓障害などがあげられる.. ICU に お け る AKI の 発 生 頻 度 は 1980年 代 で 約 30% ， そ の 内 死 亡 率 は 6 4 % と 高 値 で あ っ た （ Hou SH d a / . , 1983) . 2000 年 代 で は 5 .7 % ま で 低 下 し た が ， そ の 内 7 3 .5 % の 患 者 に お い て は 透 析 療 法 を 余 僅 な く さ れ て い る . AKI を 発 症 し た 場 合 の 死 亡 率 は ， 血 液 浄 化 療 法 に よ り 80% か ら 30 〜 5 0 % ま で 改 善 さ れ た が ， そ の後数十年間この数字は変化していない（ M ehtaw W . ，2004) . 現 在 AK I は ， RIFLE (risk of dysfunction, injury to kidney, failure of kidney function, loss of kidney function. and end-stage kidney d is e a s e ) とAKIN (acute kidney injury n e tw o rk ) を 組 み 合 わ せ た ， KDIGO (kidney disease: improving global o u tc o m e s ) と 呼 ば れ る 国 際 基 準 を 基 に 医 師 が 慎 重 に 診 断 を 下 し て い る （ Mehtae? al., 2007; Bellomo et al., 2 0 0 4 ) ( 表 1 ) . し か し ， こ れ ら は 精 度 が 悪 く ， 患 者 が I CU に 入 室 し て か ら 最 低 で も 48 時 間 は 血 清 Cr 値 や 尿 量 を モ ニ タ リ ン グ し な け れ ば な ら な い た め ， 早 期 の 治 療 開 始 が 難 し い . AKI を 早 期 に 診 断 し ， 対 策 す る こ と で 少 し で も 重 症 化 を 防 ぐ こ と が ICU で の 現 代 の 課 題 で あ る . 先 行 研 究 に お い て は ， タ ン パ ク 質 の バ イ オ マ ー カ ー を 探 索 す る 研 究 も 行 わ れ ， NGAL (neutrophil. gelatinase-. associated lip o c a lin ) や KIM-1 (kidney injury m o le c u le -1 ) と い っ た マ ー カ ー が 見 つ か っ て い る . しかし， こ れ ら は 他 の 病 態 で も 尿 中 に 増 加 す る こ と ， IC U に お い て 実 際 に バ イ オ マ ー カ ー と し て 機 能 す る か ど う かが未検討であり，臨 床 応 用 に は 至 っ て い な い （ N g u y e im a/. ，2008) . 表1. RI FLE とAKIN 分 類 （ KDIGO ガ イ ド ラ イ ン ） RIFLE. • 血 清 Crf直 基 線 か ら 1.5倍 以 上 上 昇. AKIN • 血 清 Crf直 0.3 mg 以 上 の 上 昇. . GFR(糸 球 体 濾 過 量 ) 25% 低 下. も し く は 1.5倍 以 上 の 上 昇. • 尿 量 0.5 ml/kg/hrが 6 時 間 以 上 持 続. (48 時 間 以 内 ） • 尿 量 0.5 ml/kg/hrが 6 時 間 以 上 持 続. 1*2. メタポロミクスとキヤピラリー電気泳動質量分析法（capillary. electrophoresis-mass. spectrometry; CE-MS) メ 夕 ボ ロ ミ ク ス と は ， メ タ ボ ロ ー ム を 網 羅 的 に 分 析 し ，代謝に関す る 定 量 的 な 解 釈 を 与 え る 研 究 手 法である. メタボローム解析において，現在よく用いられている分離手法はガスクロマトグラフィー. (gas chromatography; G C ) ， 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ liquid chromatography; LC ) とCE で あ る . こ れ らの機器は一般にM Sと組み合わせることで分離一検出機器として利用され，高い定量性能を有してい る. 全 て に そ れ ぞ れ 長 所 と 短 所 が 存 在 し （ 表 2) ， 目的代謝物質の性質に合わせて使い分ける必要があ る.. C E -M S は 慶 應 義 塾 大 学 の 曽 我 朋 義 の 研 究 グ ル ー プ に よ っ て 開 発 さ れ た メ 夕 ボ ロ ー ム 解 析 装 置 で あ る (Soga d a / . ，2002) . 低 分 子 代 謝 物 の 多 く は イ オ ン 性 で あ り ， CE は こ れ ら の 分 離 を 最 も 得 意 と す る た. 55.

め ， 解 糖 系 の よ う な 主 要 代 謝 パ ス ウ ヱ イ を 調 査 す る 際 や ， ノ《イ オ マ ー カ ー 探 索 の 高 度 な 定 量 性 が 求 め ら れる場合には極めて有用な測定手法である. 尿 中 に は 無 機 物 や 種 々 の 代 謝 物 等 ， 腎 機 能 を 評 価 す る 情 報 が 豊 富 に 含 ま れ て い る . 上 述 し た CE-M S とも相性が良く， さらには前処理が大変な臓器組織や血液に比べて尿は希釈するだけで測定が可能で あ る . 本 研 究 で は ， こ の C E -M S を 用 い て 尿 中 の 代 謝 物 を 定 量 し ， 未 だ 発 見 さ れ て い な い メ 夕 ボ ロ ミ ク ス 分 野 で の AKI の 早 期 介 入 マ ー カ ー を 探 っ た .. 表2. メ夕ボロミクスで用いられる分離法の特徴*. CE. GC. LC. イオン性. 揮発性. 中 性 •脂 溶 性. 不要. 必要. 不要. 105 〜 106. 104 〜 105. 104. 構造異性体の分離. 可能. 可能. 困難. M Sとの接合適合性. 良好. 良好. 測定メソッド依存. 30 〜 45 分. 30 〜 60 分. 測定メソッド依存. 不可能. 不可能. 可能. 対象代謝物 サンプル誘導体化 理論段数. 測定時間 サンプル分画. * 「 T he PRO CEEDING S O F M ETABO LO M IC S 2 nd E dition 」 （ヒ ュ ー マ ン •. メタボローム. テクノロジーズ株式会社）よ. り引用. 2.. 対象と手法. 2 . 1 サンプル収集と患者情報 本 研 究 に 用 い た 尿 は 名 古 屋 大 学 付 属 病 院 に 入 院 し て い た 患 者 121 名 か ら 採 取 さ れ た も の で あ る . 全 て の患者からインフォームドコンセントを得た上で，尿を下記の6点 で 提 供 し て 頂 い た （ 図 1) . これら. 121名 の 患 者 を ， 手 術 を 受 け た 後 に A K I を 発 症 し な か っ た 患 者 （ n o n -A K l) ， 軽 度 の A K I を 発 症 し た 患 者 (m ild -A K I) ， 重 度 の A K I を 発 症 し た 患 者 （se v e re -A K I) の 3 群 に 分 け た . 軽 度 と 重 度 の 判 別 は KDIGO に 基 づ き ， ICU 入 室 ま で の 3 0 日 間 で 測 定 し た 血 清 Cr値 の ベ ー ス ラ イ ン に 比 べ て ， 手 術 後 1 日〜 7 日 目まで に 測 定 し た 血 清 Cr値 の ピ ー ク 値 が 1.5〜 2 倍 ま で の 上 昇 で mild-AKI， 2 倍 以 上 の 上 昇 で severe-AKI とした . 最 初 に 61 名 （ non-AKI: 23 ， mild-AKI: 24 ， severe-A K I:1 4 ) の 尿 を CE-MS で 測 定 し ， 追 加 で 60 名 （ 11〇11-. AKI: 40, mild-AKI: 2 0 ) の 尿 を 測 定 し た • そ れ ぞ れ の 患 者 の 臨 床 情 報 も 下 記 に 示 し た （ 表 3お よ び 4 ) . 尿サンプノレは測 定 に 使 用 す る ま で 一 80 。 ¢： で保管した.. } A. 入院. 手 術 前 終 了. C). B. IC U O h. 6h. 暴 i) 12h. ♦. 珍 K. 24h. 48h. (麻 酔 導 入 時 ） 図l. 尿採取ポイント. 手術前は麻酔を導入した際に尿を採取した.. I C U O h は入室時点，その後6 時間，12 時間，2 4 時間，4 8 時間それぞれで尿を. 採取した.. 56.

表3. 患者の臨床情報（ 初期サンプル). 性別. m ild-AK I. (n =23). (n =24). 男 ：1 6 女 :7. 男 ：1 9 女 -.5. 52-83. 年 齢 （ 中央値） 診瘠科. 表4. non-AKI. 47-84 (71.0). (68.0). (n =14). severe-AKI. 男:9 女 :5 53-76. (67.0). 心臓. 12. 10. 4. 消化器. 7. 9. 6. 乳腺. 1. 0. 1. 整形. 1. 1. 0. 呼吸器. 2. 1. 0. 移植. 0. 0. 1. 血管. 0. 3. 1. 泌尿器. 0. 0. 1. 患者の臨床情報（ 追加サンプル). 性別 年齢(中央値）. non-AKI. mild-AKI. (n =4〇). (n =20). 男 ：3 4 女 ：6. 男 ：1 9 女 ：1. 40-83. (68.0). 31-81. (72.5). 診療科 心臓. 14. 3. 消化器. 7. 11. 脳. 6. 1. 整形. 1. 0. 呼吸器. 2. 2. 移植. 1. 1. 血管. 4. 2. 口腔. 2. 0. 耳鼻咽喉. 5. 0. 57.

2 2 尿サンプルの前処理 —80°C で保管しておいた尿サン プ ノ レ を 室 温 に 戻 し て 2 0 パL を 1.5 mL チ ュ ー ブ に 移 し た . こ れ に 濃 度 2 mM の 内 部 標 準 （ internal standards; IS). cation: methionine sulfone, 3-aminopyrroridine, anion: trimesate,. D-camphor-10-sulfonic acid sodium salt ( C S A ) ， 2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid (MES ) を含んだ Milli-Q 水 と ， 酵 素 法 で 測 定 し た 尿 中 Crf直 を 基 に 希 釈 用 の M im-Q 水 を 加 え た （表 5 ) . 限 外 濾 過 チ ュ ー ブ に 移 し ， 10,000 g で 30〜 50 分 ， 4 °C で 遠 心 分 離 し た .. こ の 内 の 7 " L を 測 定 用 バ イ ア ル に 注 入 し ， 測定に. 使用した. 表5. 尿 中 C rfii に 基 づ く サ ン プ ル 希 釈 量 尿 （ 叫 ）. IS 入 り Milli-Q 水 （ル ）. Milli-Q 水 （叫 ）. 合 計 （ 吣 ）. 20 (100〜300). 20. 40. 340. 400. 10 (50-100). 20. 20. 160. 200. 5 (25-50). 20. 10. 70. 100. 2 (10 〜25). 20. 4. 16. 40. 1 (0 〜10). 90. 10. 0. 100. 希釈倍率（ Crf直） *. *Crf直の単位はm g/dL.. 23. Cation代謝物の測定. CE-MS は ア ジ レ ン ト • テ ク ノ ロ ジ ー 株 式 会 社 の 装 置 （ CE: Agilent 7100 CE シ ス テ ム ， MS: Agilent 6224 M S シ ス テ ム ） を 使 用 し た . 代 謝 物 は ヒ ュ ー ズ ド シ リ カ キ ヤ ピ ラ リ ー （内 径 5 0 パm ， 全 長 100cm ) で 分 離 した . キ ヤ ピ ラ リ ー 内 部 に 流 す バ ッ フ ァ ー は 1. Mの ギ 酸 溶 液 を 用 い た . サンプルは5. kPa で 5 秒 間 注 入. し， + 3 0 k V の 電 圧 を 印 加 し た . シ ー ス 液 は 0 . 0 1 の Hexakis を 含 ん だ メ タ ノ ー ル / 水 （ 50% v / v ) で ， 10 パL/min で 送 液 し た . ESI-TOFMS は 陽 イ オ ン モ ー ド で 測 定 し た .. キヤピラリーの電圧は4. kV ， 窒素ガス. ( ヒ ー タ ー 温 度 300て ） の 流 速 は 10 L/m in とした . TOFMS の fragmenter voltage， skimmer voltage, および octapole radio frequency voltage は そ れ ぞ れ 75 ， 50， 500 V と し た . Reference Mass は 2 つ の 参 照 標 準 ：[1J C isotopic ion of the protonated methanol dimer (2MeOH + H ) ] ' mた 66.0630 6 と， [protonated Hexakis (M + H)]+ ， m/z 622.028 % を 用 い た .. 2.4. Anion代謝物の測定. CE-MS は ア ジ レ ン ト • テ ク ノ ロ ジ ー 株 式 会 社 の 装 置 （ CE: Agilent 7100 CE シ ス テ ム ， MS: Agilent 6230 M S シ ス テ ム ） を 使 用 し た . 代 謝 物 は 陽 イ オ ン 性 ポ リ マ ー で 化 学 的 に 被 覆 さ れ た COSMO ( + ) キャピラ リ ー で 分 離 し た . キ ャ ピ ラ リ ー 内 部 に 流 す バ ッ フ ァ ー は 5 0 m M の 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 溶 液 （ pH 8.5 ) を用 い た . サ ン プ ル は 5 kPa で 30秒 間 注 入 し ， 一 30 kV の 電 圧 を 印 加 し た . シ ー ス 液 は 0 . 0 1 の Hexakis と5. mM の 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム を 含 ん だ メ タ ノ ー ル /水 （ 5 0 % v / v ) で， 1 0 パL/min で 送 液 し た . ESI-TOFMS は陰 イオンモードで測定した.. キ ヤ ピ ラ リ ー の 電 圧 は 3.5. kV ， 窒 素 ガ ス （ヒ ー タ ー 温 度 300 。¢： ) の 流 速 は 10. L/min と し た . TOFMS の fragmenter voltage， skimmer voltage お よ び octapole radio frequency voltage はそれ ぞ れ 100 ， 50， 500 V とした . Reference Mass は 2 つ の 参 照 標 準 ： [ B e isotopic ion of deprotonated acetic acid. 58.

dimer (ICHgCOOH-H)]- ，. 20.03834 と， [Hexakis + deprotonated acetic acid (M + CHgCOOH-H)]一， /n/z. 680.03554 を 用 い た .. 2 5 デ一夕処理と統計解析 C E - M Sで測定した生デ一夕を慶應義塾大学先端生命科学研究所が開発した解析ソフトウェア， MasterHands Version 2.16.0.15 を 用 い て 解 析 し ， 各 代 謝 物 の 濃 度 （ / / M ) を 算 出 し た （ Hirayama et al., 2009;. Sugimoto. et. a l . , 2010) . 続 い て ， 以 下 の 式 を 用 い て Crで 補 正 し た 各 代 謝 物 の 尿 中 量 （ urinary. amounts; U A ) を 算 出 し た （式 1 ) .. 代謝物 の 疲 中 量 UA ( pi m ol/ 祖祖〇1C r). 代謝物の潢度 X 希釈倍率. €r 値 x i:0 113.118 ♦. *Crの 分 子 量 （113.118 g /m o l) で あ る . 統 計 解 析 と し て ， 最 初 に 主 成 分 分 析 （ principal. component analysis;. P C A )を実施した.. P CA は，. umetrics社 製 の 多 変 量 解 析 ソ フ ト ウ ェ ア ， SIM C A 13 を 使 用 し た . 次 に ， 尿 を 採 取 し た 6 点 の 内 の B ポイン ト （ ICU. O h ) で 3 群 で の kruskal-wallis検 定 を 実 施 し た . そ こ で 有 意 差 が 得 ら れ た 代 謝 物 に つ い て ， さら. に 受 診 者 動 作 特 性 曲 線 （ receiver operating characteristic curve; ROC c u r v e ) を 算 出 し ， AKI のマーカーと してより信頼度の高い代謝物を決定した.. これらの代謝物について尿採取ポイント6点の経時的変化を. 観察し， さらに手術時間や患者のバックグランドの影響について調査した.. こ れ に よ り ， A K I のマー. カ ー 候 補 を さ ら に 絞 り 込 ん で ， 追 加 サ ン プ ル を 用 い て の バ リ デ 一 シ ョ ン 研 究 を 実 施 し た .最 後 に 各 代 謝 物 で の ふ る ま い が ほ と ん ど 同 じ で あ っ た non-A K I とmild-AKI に つ い て ， 判 別 で き る 代 謝 物 が あ る か ど う か を 調 査 す る た め ， 2 群 で の mann-whitney の U 検 定 を 実 施 し た . 全 検 定 は ， GraphPadSoftware 社 が 開 発 し た ソ フ ト ウ ェ ア ， Graphpad Prism 5 を 用 い た .. 3.. 結果と考察. 3 . 1 主 成 分 分 析 （ principal component analysis; PCA) 尿 サ ン プ ル を CE-MS で 測 定 し た 結 果 ， cation お よ び anion 合 わ せ て 143 の 代 謝 物 を 同 定 し た . こ れ ら 全 代 謝 物 に つ い て non-A K I ， m ild-A K I ， severe-A K I の 3 群 で P C A を 行 っ た （図 2 ) . こ の 図 か ら 分 か る よ う に， 明 確 な 分 離 は 見 ら れ な か っ た . 本 研 究 の 目 的 は ， 早 期 に A K I を 予 測 出 来 る マ ー カ ー を 探 索 す る こ と な の で ， ICU Oh ( 尿 採 取 ポ イ ン ト 6 点 の う ち の B ) に 焦 点 を 当 て て ， 3群 で の 検 定 を 行 っ た .. 59.

奪 獅 ，,4 K 裏. © miid-AKI %mytrt-AKl. *e 0. 20. 20. 10. PCI (21%) 図2. 全 代 謝 物 の PCA プロット. 楕円はHotelingT2 (0.9 5)を示す. 寄与率はPCI，PC2それぞれ21%，1.8%である.. 3*2 3群での比較解析 ICU. Oh ( 尿 採 取 ポ イ ン ト の B ) に お い て ， non-AKI， mild-AKI， そ し て severe-AKIの 3群 で 差 が あ る 代. 謝物を探った.. そ の 結 果 ， 11 の 代 謝 物 で 有 意 差 が 得 ら れ た （ 図 3 ) . し か し ， ほ と ん ど の 代 謝 物 が non-. A K I に 対 し て severe-AKIで の み 有 意 差 が 得 ら れ ， mild-AKIで 有 意 差 の あ る 代 謝 物 は 1つ だ け で あ っ た . そ して， 同 定 さ れ た 代 謝 物 ほ と ん ど で non-AKI とmild-AKIは ほ ぼ 同 じ 値 を 示 し て い た .. Alanine. betas-Alaniii& 糊. i. tw 承象傘. tm m. 翁. 勢參 _ Urate. DlhydMhymine. 嫌 燊雜. 傘 傘 #. m. i. l. を. l. 琴. I. 60. 分. く. im. 考. itetonleine. isoiaucin#. 愈_____. fp. « r|. m m 嫁 m §. w. w. ^. ^. 喪. L#yciiui. !. i. l. l.

0 i s. で. I. 《. #%#. 4. 扇. 1. _. s. 2. •參费. 1. { J o I O E E / Ia O v E n. 衡. 參t 2. S. v -a j a >. V. sv-uou. P I. V-PHE. l x v l o o > o. 2. lylv-uou. k .. s. 0>. 0>. 図3. ICU Ohに お い て 有 意 差 が 得 ら れ た 代 謝 物. 青，緑，赤のドットはそれぞれnon-AK I, U A ) である. * * *. m ild-A K I ，severe-A K I を不す.. ，* * ，* はそれぞれp < 0.001,. 縦軸は0. fit で補正した尿中量（ urinary a m ou n t;. p < 0 .0 1 ，p < 0 .0 5 を示す. n. s. は有意差無し （ not s i g n if ic a n t ) である.図中の. バーは平均値を示す.. 33. 受 診 者 動 作 特 性 曲 線 （receiver operating characteristic curve; ROC curve). no n -A K I に 対 し て severe-A K I で 有 意 差 の 得 ら れ た 10 の 代 謝 物 に つ い て ， R O C 曲 線 を 作 成 し た . こ れ は， 検 査 の 診 断 特 性 の 評 価 や 新 し い 検 査 法 が ど の く ら い 有 効 で あ る か を 示 す 指 標 と な る 系 統 的 グ ラ フ である.. こ こ で 得 ら れ る 面 積 値 （area under the curve; A U C ) は 0.5 〜 1.0の 値 を 不 す が ， 一 般 的 に 0.8 以 上. で あ れ ば 有 効 性 は 高 い と 言 わ れ て い る . 結 果 と し て ， 5 代 謝 物 に お い て 0 .8 以 上 の A U C が 得 ら れ た （ 図. 4 ) . 従 っ て ， AKI の バ イ オ マ ー カ ー を こ の 5 つ に 絞 り ， こ れ ら の 経 時 的 変 化 を 観 察 し た .. be^i-Alanine. Alanltid. NrAeetylputrascine. ノ。 u —. A U 00.930. フ °?. F. 令 ，. 1 - Sj>ec(fieKy. D ihv#ottiyiiiin6 im ”. Specificity. HydroxyproMtid i,ai g妙. AUC=0.897. AUC=0.888. す •Spici^Ny 図4. SpceiflcH^r. non-AKIに 対 す る severe-AKIの ROC 曲 線. 縦軸は感度（ s e n s i t i v i t y ) , 横軸は偽陽性率（ 1 - s p e c i f i c i t y ) をボす• acetylsperm idine のA U C 値はいずれも0 .8 以下であった.. 61. U r a te ，i s o l e u c i n e ,. b e t o m c in e ,. le u c in e ,. N 8-.

3.4 5代■物の経時的変化 R O C 曲 線 の AUC が 高 か っ た 5 つ の 代 謝 物 に つ い て ， 経 時 的 変 化 を 観 察 し た （図 5) . m ild-A K I は 軽 度 の A K I を 発 症 し て い る に も 閨 わ ら ず ； A K I を 発 症 し な か っ た non-AK I と ほ ぼ 同 じ 変 化 を 示 し て い る こ と が 分 か っ た . Al ani ne で は ， 手 術 前 の 時 点 で 3 群 と も 同 程 度 尿 中 に 存 在 し て い る が ， severe-AKI で は そ の 後 尿 中 か ら 消 失 し て い た . そして， 他 の 2 群 は ICU 入 室 直 後 に 尿 中 量 が 増 え ， 6 時 間 後 に は ほ ぼ 消 失 す る と い う 異 な っ た 傾 向 が 見 ら れ た . N-Acetylputrescine とDihydrothymine に お い て も ， 手 術 前 か ら ICU 入 室 6 時 間 後 ま で の 3 点 で ， A lanine と 同 じ よ う な 挙 動 を 不 し て い た . beta-A lanine とHydroxyproline に お い て は ，. severe-A KI が IC U に 入 室 し た 直 後 か ら 早 い 段 階 で 尿 中 に 多 量 存 在 し ， ICU 入 室 12時 間 後 に は 尿 中 か ら 消 失 し て い た . 一 方 で non-AKIお よ び mild-AKIは ， 同 じ よ う な 挙 動 が ICU 入 室 6 時 間 後 か ら 始 ま っ て い た .. 図5. 5代 謝 物 の 経 時 的 変 化. 縦軸は尿中量UA ，横軸は尿を採取した6点を不している. 青，緑，赤線はそれぞれnon -AKI , mild -AKI , severe -AK 丨を不 す.外れ値の影響により，エ ラ ー バ ー を 示すと視覚的に経時的変化を捉えることが難しいため，エ ラ ー バ ー は 示してい ない.. 3 5 手術時間，患者のバックグラウンドの影響 severe-AKIに お け る beta-Alanine とHydroxyprolineの 尿 中 量 増 加 が ， non-AKIに 比 べ て 少 し 早 い 段 階 か ら 起 こ っ て い る 原 因 は ， 手 術 時 間 に 関 係 し て い る の で は な い か と 考 え ， そ の 影 響 を 調 査 し た . severe— AKI 患 者 の 手 術 時 間 平 均 は 10時 間 36 分 ， non-A K I の 手 術 時 間 平 均 は 9 時 間 46 分 で ， 両 群 共 に 10時 間 前 後 だ っ た . そ の 時 間 を 基 準 と し ， 各 代 謝 物 の non-A K I とsevere-A K I そ れ ぞ れ で ， 平 均 手 術 時 間 よ り も 短 い 手 術 を 行 っ た 群 と 長 い 群 に 分 け て t検 定 を 実 施 し ， 差 が あ る か ど う か を 検 討 し た . 男 女 や 年 齢 で も 差 が あ る かどうかを同様の方法で調査した. 平 均 手 術 時 間 で 2 群 に 分 け た 時 の t 検 定 に お い て ， beta-Alanine とA la n in e , そ し て Dihydrothymine で は 両 群共に差は見られなかった. 従って， 手術時間による代謝物への影響は無いと考えられた.. しかし，. N-Acetylputrescine で は non-AKIで， Hydroxyproline で は severe-AKIで 有 意 差 が 得 ら れ た . そ の た め ， この 2代 謝 物 は 手 術 時 間 に 影 響 を 受 け て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た . 男 女 で は 全 代 謝 物 で 有 意 差 は 無 か っ た も のの，年 齢 （ 6 6 歳 以 下 と 6フ 歳 以 上 ） で は ， Dihydrothymine の severe-AKI で 有 意 差 が 得 ら れ た . 従 っ て ，. Dihydrothymine は 年 齢 に 影 響 さ れ 得 る こ と が 示 唆 さ れ た . 以 上 を 踏 ま え る と ， 手 術 時 間 ， 性 別 ， 年 齢 の ど の フ ア ク タ ー に も 影 響 さ れ な か っ た beta-Alanine とAlanine が non-A K I とsevere-AKI を 判 別 で き る AKI の バイオマーカー候補と考えられる.. 62.

3 . 6 追加サンプルによるバリデーシヨン研究 ICU で の 発 症 頻 度 が 約 5 % と 低 い severe-AKI 患 者 の 尿 サ ン プ ル を 採 取 す る こ と は 非 常 に 難 し く ， 200 人 以 上 の ICU 入 室 患 者 で A K I を 発 症 し た 患 者 は ， 初 期 サ ン プ ル で 既 に 測 定 し た 14人 の み で あ っ た . そ の た め， 今 回 は 新 た に n o n -A K I 患 者 4 0 人 と m ild -A K I 患 者 2 0 人 分 の 尿 を バ リ デ 一 シ ヨ ン 研 究 に 用 い ， beta-. Alanine とAlanine に つ い て ， ICU ( 図 6) . beta-Alanineは ICU. Ohの 時 点 で 初 期 サ ン プ ノ レ と 同 じ よ う な 結 果 に な る か ど う か を 検 証 し た. Ohの 時 点 に お い て ， non-AKI もmild-AKIも 初 期 サ ン プ ル と 同 様 ， 尿 中 に は. ほ と ん ど 存 在 し て い な い こ と が 明 ら か と な り ， また， Alanine もnon-AKI， mild-AKI共 に 尿 中 に 同 程 度 存 在していることが確認された.. 義I細 _. 豪齡. 図6. beta-AlanineとAlanineのバリデ一シヨン研究. 左側は初期サンプルの検定結果（ 図8. ) ,. 右側が追加サンプルの検定結果である. 検定はm a n n - w h i t n e y のU 検定を用い. た. *. * * は，p < 0 .0 0 1 を不す. n .s. は有意差無し （ not s ig n if ic a n t ) である.. 3.7. non-AKIとmild-AKIを判別できるマーカー探索. 図中のバーは平均値を不す.. non-AKI ( + m ild - A K I) とsevere-AKI は AKI の バ イ オ マ ー カ ー 候 補 ， beta-Alanine, Alanine で 判 別する ことが可能である.. し かし， 現 時 点 で non-A K I とmild-AKI を 区 別 す る こ と は 出 来 な い . そ こ で ， この両. 群を判別できる新たな代謝物を探索した.. まず； non-AKI とmild-AKI の 2 群 で mann-whitney の U 検 定 を 実. 施 し ， 有 意 差 の あ る 代 謝 物 と R O C 曲 線 を 算 出 し た . 結 果 と し て ， 10 の 代 謝 物 ， Urate, Trim ethylam ine. N-oxide, Histidine, o-Hyaroxynexanoate, Glycme, Asymmetric dimetnyiarginine, Asparagine, Cysteine Ssulfate ， Tryptophan, N -A cetylaspartate で 有 意 な 差 が 得 ら れ た が ， AUC 値 は 全 て 0.8 以 下 で あ っ た . ま た ， Trimethylamine. N-oxide だ け が non-AKI に 対 し て mild-AKIで 尿 中 に 多 く 存 在 し て い た が ， 他 の 代 謝 物. で は non-AKI よ り も 尿 中 量 が 少 な か っ た . そ こ で 患 者 毎 に ， Trimethylamine. N-oxide を non-AKIよ りも尿. 中 量 が 少 な か っ た 代 謝 物 そ れ ぞ れ で 割 り ， non-A K I とm ild-AKI の 比 を と る こ と で ， より AKI 診 断 の 有 効 性 を 局 め る こ と が で き な い か 検 証 し た . そ の 結 果 ， Trimethylamine N-oxide を Cysteine S-sulfateで割った 場 合 の み が ， AUC 値 0.8 以 上 を 示 し た （ 図 7 ) . 従 っ て ， Trimethylamine N-oxide とCysteine S-sulfateの比 を と る こ と で non-AKI とmild-AKIを 判 別 で き る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た .. 63.

TrtmetNyiamin# N-oxide / Cysteine S^ulfale. 図7. Trimethylamine N-oxide / Cysteine S-sulfate のグラ フ と ROC 曲 線. 左側の図は患者毎，. Trim ethylam ine N -o x id e をC ysteine S-sulfate の尿中量で割ったグラフで，青い丸はnon-A K I ，緑の丸は. m ild -A K I 群を不す.. 検定はm ann -w hitn ey のU 検定を用いたB. * * * は，p < 0 .0 0 1 を不す.. 右側の図はn on -A K I に対するm ild-AK I. のR O C 曲線である. 図中のバーは平均値を示す.. 4.. 結論. AKI の 早 期 介 入 バ イ オ マ ー カ ー を 探 索 す る べ く ， non-AKI ， mild-AKI ， severe-AKI の 尿 サ ン プ ル を CEMS で 測 定 し た . そ の 結 果 ， non-AKI とsevere-AKIを 判 別 で き る 代 謝 物 の 候 補 は 11発 見 さ れ た が ， ROC 曲 線 や 手 術 時 間 ， 性 別 ， 年 齢 と い っ た 因 子 の 影 響 を 考 慮 す る と ， 最 終 的 に beta-Alanine お よ び Alanine が 最 もAKI の バ イ オ マ ー カ ー 候 補 と し て 有 力 で あ る こ と が 不 唆 さ れ た .. ま た ， Trimethylamine. N-oxide と. Cysteine S-sulfateの 比 を と る こ と で ， non-AKI とmild-AKIを 判 別 で き る 可 能 性 も 示 唆 さ れ た . 本 研 究 で は A K I の バ イ オ マ ー カ ー 候 補 が い く つ か 示 さ れ た が ， 1つ の 病 院 で 採 取 さ れ た 尿 だ け を 用 い ての結果である. 他の病院でも， 同様な手法を用いてのバリデ一ション研究をすることが望ましいだろ う. 最 後 に ， こ れ ら の バ イ オ マ ー カ ー 候 補 が AKI 患 者 の 予 後 不 良 改 善 ， ま た 死 亡 率 の 低 下 に 役 立 つ こ と を期待している.. 5• ■ 辞 本 研 究 を 遂 行 す る に 当 た り ， 大 変 多 く の 方 々 に ご 助 力 を 賜 り ま し た .こ の 場 を お 借 り し て 厚 く 御 礼 を申し上げます. 先ず， 慶 應 義 塾 大 学 先 端 生 命 科 学 研 究 所 の 平 山 明 由 氏 に 心 か ら 感 謝 い た し ま す . 分 析 の 知 識 か ら ， 実 験の基礎等，非常に多くのことをご教授くださいました. 夜遅い時間でも対応して頂き，実験や論文 の細部に至るまで細かくご指導をしてくださいました.. ま た ， サンプノレチェックや CE-MS 測 定 に 関 し て. 様々なアドバイスを頂きました，慶 應義塾大学先端生命科学研究所の技術員，鈴 木 麻 子 氏 ，畑山陽子 氏にもこの場を借りてお礼申し上げます. 統計解析を行うにあたり， ソフトウェアの使用方法を丁寧に ご教授くださいました，佐藤尚美氏にも感謝しております. 尿サンプルや患者の臨床情報をご提供くださいました，名 古 屋 大 学 付 属 病 院 腎 臓 内 科 の 秋 山 真 一 医 師， 丸 山 彰 ー 医 師 ， 永 田 高 信 医 師 に 謝 意 を 申 し 上 げ ま す . そ れ だ け で な く ，本 研 究 の 方 向性について多 くの議論を交わし， ご 助 言 も賜りました. 大変感謝しております. 先 端 生 命 科 学 研 究 所 （ Institute for advanced biosciences; I A B ) の 教 員 ， 研 究 ス タ ッ フ ， 事 務 員 ， そして 学 生 な ど に も 大 変 お 世 話 に な り ま し た . 最 後 に ， IAB の 所 長 で あ る 冨 田 勝 氏 に 深 く 御 礼 申 し 上 げ ま す .. IA B は 先 端 生 命 科 学 を 研 究 す る 最 良 の 機 閨 で あ り ， IAB が 無 け れ ば 私 は 先 端 生 命 科 学 分 野 の 研 究 に 身 を 置 く こ と は あ り ま せ ん で し た し ， 研 究 成 果 を こ こ ま で ま と め る こ と も 出 来 ま せ ん で し た .こ の よ う な. 64.

研究の場をお与え頂き，そして多大なご助力や励ましを賜りましたことを尊敬の念と共に深く感謝申 し上げます. ありがとうございました.. 参考文献 Bellomo, R., Ronco, C., Kellum, J.A., Mehta, R.L., and Palevsky, P. (2004); Acute Dialysis Initiative workgroup : Acute renal failure—definition, outcome measures, animal models, fluid therapy and information technology needs : the Second International Consensus Conference of the Acute Dialysis Quality Initiative(ADQI) Group. Crit Care 8 , R204-212. Hirayama A, Kami K, Sugimoto M, Sugawara M, Toki N, Onozuka H, Kinoshita T, Saito N, Ochiai A, Tomita M, Esumi H., and Soga T. (2009); Quantitative metabolome profiling of colon and stomach cancer microenvironment by capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry. Cancer Res 69(11): 4918-4925. Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Acute Kidney Injury Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Acute Kidney Injury. Kidney inter., Suppl. 2012; 2:1-138. Mehta, R.L., Kellun, JA ., Shah, S.V., Molitoris, B A ., Ronco, C., Wamock, D.G., and Levin, A. (2007); Acute Kidney Injury Network : report of an initiative to improve outcomes in acute kidney injury. Crit Care 11,R31. Mehta, R.L., Pascual, M.T., Soroko, S., Savage, B.R., Himmelfarb, J., Ikizler, T A ., Paganini, E.P., and Chertow, G.M. (2004); Spectrum of acute renal failure in the intensive care unit: the PICARD experience. Kidney Int 66:1613-21. Nguyen, M.T., and Devarajan, P. (2008); Biomarkers for the early detection of acute kidney injury. Pediatr Nephrol 23,2151-2157. Raghavan, M., and John, K. (2011); Acute kidney injury: what5s the prognosis? Nat Rev N ephrol,7(14), 209-217. Soga, T., Ueno, Y., Naraoka, H., Ohashi, Y., Tomita, M., and Nishioka, T. (2002); Simultaneous determination intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem., 74:2233-2239. Soga, T., Ueno, Y., Naraoka, H., Matsuda, K., Tomita, M., and Nishioka, T. (2002); Pressure-assisted capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry for analysis of multivalent anions. Anal. Chem., 74:6224-6229. Sugimoto M, Wong DT, Hirayama A, Soga T., and Tomita M. (2010); Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics 6(1): 78-95.. 65.