i
PENGARUH INTERMITTENT FASTING TERHADAP KADAR
SUPEROKSIDA DISMUTASE (SOD) PADA MENCIT BALB-C
Karya Tulis Ilmiah
Sebagai Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Kedokteran Universitas Islam Indonesia
Program Studi Sarjana Kedokteran
Oleh :
ADHITAMA NOOR IDNINDA 15711185
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
YOGYAKARTA 2018
ii
THE EFFECT OF INTERMITTENT FASTING OF SUPEROXIDE DISMUTASE (SOD) LEVEL OF BALB-C MICE
Scientific Paper
As a Part of Requirements to Obtain Medical Bachelor Degree
Program Studi Sarjana Kedokteran
By :
ADHITAMA NOOR IDNINDA 15711185
FACULTY OF MEDICINE UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
YOGYAKARTA 2018
1
PENGARUH INTERMITTENT FASTING TERHADAP KADAR SUPEROKSIDA DISMUTASE (SOD) PADA MENCIT BALB-C
Idninda, A.N.1, Mulyaningrum, U.2, Agustiningtyas, I.3
1Mahasiswa Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia 2Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia
3Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia
[email protected] INTISARI
Hepar merupakan kelenjar terbesar dalam tubuh untuk mendetoksifikasi zat dalam tubuh. Peningkatan Reactive Oxygen Species (ROS) menyebabkan stres oksidatif tubuh, tahap awal dapat dilihat di hepar. Intermittent fasting (IF) merupakan pencetus stres oksidatif ringan, tubuh mengatasi keadaan tersebut melalui peningkatan enzim antioksidan salah satunya superoksida dismutase (SOD). Tujuan penelitian untuk mengetahui pengaruh IF terhadap kadar SOD antara kelompok IF dan kontrol. Penelitian berupa experimental laboratory post test control group design dengan randomisasi. Subjek penelitian berupa mencit BALB-C jantan diberi perlakuan IF. Kelompok AL diberi pakan standar (AIN93) dan minum libitum. Kelompok HF diberi pakan tinggi lemak dan minum ad-libitum. Kelompok IF diberi perlakuan IF dengan durasi puasa 14 jam (pukul 17.00 hingga 07.00) selang satu hari, diberi pakan standar dan minum ad-libitum saat tidak berpuasa. Kadar SOD diperiksa menggunakan metode spektrofotometri. Uji normalitas Shapiro-Wilk didapat data terdistribusi normal. Uji parametrik One-Way ANOVA terdapat perbedaan bermakna kadar SOD antara mencit dengan perlakuan IF dibandingkan kontrol. Rerata kadar SOD hepar kelompok AL=52,86%, kelompok IF=68,57%, dan kelompok HF=38,57% dengan nilai p=0,000 (p<0,05). Kesimpulan adalah terdapat pengaruh IF terhadap rerata kadar SOD berupa rerata kadar kelompok IF lebih tinggi signifikan dibandingkan kelompok AL dan HF.
2
THE EFFECT OF INTERMITTENT FASTING OF SUPEROXIDE DISMUTASE (SOD) LEVEL OF BALB-C MICE
Idninda, A.N.1, Mulyaningrum, U.2, Agustiningtyas, I.3
1Medical Student, Faculty of Medicine, Islamic University of Indonesia
2Departement of Clinical Pathology, Faculty of Medicine, Islamic University of Indonesia 3Departement of Microbiology, Faculty of Medicine, Islamic University of Indonesia
ABSTRACT
Liver is the largest gland in the body to detoxify all substances. Increasing Reactive Oxygen Species (ROS) causes oxidative stress in the body can be seen in liver. Intermittent fasting (IF) triggered mild oxidative stress, body will compensate through increasing antioxidant enzymes level. Superoxide dismutase (SOD) is one of them. This study aimed to investigate IF’s effect to SOD’s levels in liver between IF and control groups. This experimental randomized control group with posttest-control group. Fifteen male BALB-C mices are devided into three groups. AL group had given standart dietary and water ad-libitum. HF group had given high fat dietary and water ad-libitum. IF group had given intermittent fasting regiment with 14 hours fasting (05.00 p.m till 7.00 a.m) every one day interval and given standart dietary and water ad-libitum when feast day. The SOD level is checked by spectrophotometric. The normality test is checked by Shapiro-Wilk showed the data have a normal distribution. A parametric test used One Way ANOVA. The mean of SOD level in AL=52,86%, IF=68,57%, and HF=38,57%, p-value=0,000 (p<0,05). IF has an effect to SOD level’s mean in liver. The SOD levels in IF group is significantly higher than AL and HF group.
3
PENDAHULUAN
Hepar merupakan kelenjar terbesar dalam tubuh untuk mendetoksifikasi segala zat. Stres
oksidatif dapat merusak hepar
ditunjukkan dengan degenerasi, nekrosis, karioreksis, dan
kariolisis.1,2 Ketidakseimbangan
antara zat radikal bebas dan antioksidan yang dapat merusak komponen kimiawi tubuh, radikal bebas yang sering dijumpai antara lain superoksida, hidrogen peroksida, hidroksil, peroksil, alkoksil, dan
hidroperoksil.3,4 Antioksidan dalam
tubuh berupa enzim berperan mengurai radikal bebas, seperti superoksida dismutase (SOD), glutation peroksidase (GPx), glutation reduktase (GR), dan
katalase (CAT).5 Antioksidan
mempertahankan tubuh dari keasaan stres oksidatif yang dapat menyebabkan gangguan terhadap tubuh, khususnya organ hepar agar tidak terjadi karsinoma hepatoseluler, steatosis, hepatitis kronis, fibrosis
atau sirosis hepar.6
Superoksida dismutase merupakan enzim antioksidan utama
yang berperan melindungi tubuh dari superoksida. Superoksida dikatalis
oleh SOD menjadi hidrogen peroksida (H2O2), kemudian oleh GPx dan CAT diubah menjadi air. Superoksida dismutase memiliki tiga jenis isoform pada mamalia yaitu Cu/ZnSOD di sitoplasma (SOD1), MnSOD di mitokondria (SOD2), dan
Cu/ZnSOD di ekstraseluler (SOD3).7
Faktor yang dapat meningkatkan kadar SOD salah satunya peningkatan stres oksidatif ringan saat puasa Ramadan. Stres oksidatif
memicu produksi SOD.8
Pada keadaan fisiologis, tubuh memiliki kemampuan untuk mengatasi stres oksidatif melalui
peningkatan antioksidan.9 Puasa
Ramadan selama satu bulan menunjukkan peningkatan enzim antioksidan yaitu superoksida
dismutase dan glutation peroksidase.8
Puasa Ramadan merupakan puasa wajib bagi umat Islam pada bulan Ramadan, sedangkan puasa Daud merupakan puasa yang disukai oleh Allah. Dari ‘Abdullah bin ‘Amr bin Al ‘Ash, ia berkata bahwa Rasulullah SAW mengatakan padanya, “Sebaik-baik shalat di sisi Allah adalah shalatnya Nabi Daud ‘alaihis salam. Dan sebaik-baik puasa di sisi Allah adalah puasa Daud. Nabi Daud
4
dahulu tidur di pertengahan malam dan beliau shalat di sepertiga malamnya dan tidur lagi di seperenamnya. Adapun puasa Daud yaitu puasa sehari dan tidak berpuasa
di hari berikutnya”.10
Menurut Patterson et al., suatu puasa dengan siklus sehari puasa sehari berbuka termasuk bentuk intermittent fasting (IF). Tujuan penelitian ini untuk mengetahui adakah perbedaan kadar SOD antara kelompok yang diberi perlakuan IF dan kelompok kontrol.
METODE
Penelitian ini berupa penelitian experimental laboratory post test
control group design dengan
randomized control group. Subjek penelitian ini adalah mencit BALB-C jantan yang diberi perlakuan IF. Kriteria inklusi subjek pada penelitian ini yaitu mencit strain BALB-C dengan jenis kelamin jantan, berumur 8-10 minggu, berat badan 15-30 gram, sehat dan tanpa cacat fisik serta belum pernah digunakan sebagai subjek penelitian. Kriteria eksklusi adalah mencit yang mati selama perlakuan berlangsung, mencit yang menunjukkan gerakan
tidak aktif atau tidak mau makan dan minum selama periode aklimatisasi, dan mencit yang menunjukkan perilaku yang agresif atau nampak lemah dan tidak lincah. Subjek penelitian didapatkan dari Laboratorium Hewan Coba Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia.
Sebanyak 15 subjek dibagi secara acak menjadi tiga kelompok yaitu AL, HF, dan IF masing-masing kelompok dengan 5 mencit. Kelompok AL (kontrol normal) diberi pakan standar (AIN93) dan minum ad libitum setiap hari. Kelompok HF (kontrol negatif) diberi perlakuan pemberian pakan tinggi lemak dan minum ad libitum setiap hari. Kelompok IF (kelompok uji) perlakuan intermittent fasting dengan durasi puasa 14 jam (pukul 17.00 hingga pukul 07.00) setiap selang satu hari, diberi pakan standar dan minum ad libitum saat tidak berpuasa. Perlakuan diberikan selama 9 minggu di Laboratorium Riset Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. Sebelum terminasi, mencit dipuasakan selama 12 jam.
5
Pemeriksaan kadar SOD dilakukan di Pusat Antar Universitas di Universitas Gajah Mada. Sampel diambil dari hepar setiap subjek penelitian. Hepar ditumbuk (homogenisasi) kemudian dimasukkan ke dalam tabung
sentrifugasi dan diambil supernatan hepar. Supernatan direaksikan dengan campuran pada tabel 1 sesuai
Superoxide Dismutase (SOD)
Activity Assay Kit (Catalog
#K335-100). Campuran diinkubasi pada plate dengan suhu 37ºC selama 20 menit kemudian absorbansi yang didapat dibaca pada panjang gelombang 450 nm menggunakan microplate reader. Aktivitas SOD (dalam %) dihitung menggunakan rumus sebagai berikut.
Tabel 1. Komposisi Sampel dan Blanko
Data yang diperoleh dari pengukuran kadar SOD dianalisis menggunakan software IBM SPSS Statistics 20. Uji normalitas
menggunakan Saphiro Wilk,
sedangkan uji variansi menggunakan Levene’s test. Apabila uji normalitas dan uji variansi didapatkan terdistribusi normal, maka analisis uji One Way ANOVA dilanjutkan dengan uji Post Hoc (uji Tukey)
untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan signifikan antara masing-masing kelompok data tersebut. Data dinyatakan terdapat perbedaan bermakna apabila kadar SOD antara
masing-masing kelompok data
diperoleh nilai p<0,05.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Subjek penelitian ini sebanyak 15 ekor mencit BALB-C yang
Composition Sample Blank 1 Blank 2 Blank 3
Sample Solution 20 µL 20 µL
ddH2O 20 µL 20 µL
WST Working Solution 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL
Enzym Working Solution 20 µL 20 µL
Dilution Buffer 20 µL 20 µL
Aktivitas SOD =
(𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴1−𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴3)− (𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑒𝑒𝐴𝐴−𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴2) (𝐴𝐴 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑏𝑏1−𝐴𝐴 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑏𝑏3) x 100
6
terbagi menjadi tiga kelompok yaitu AL, IF, dan HF. Setiap kelompok terdiri masing-masing 5 ekor mencit.
Nilai rata-rata kadar SOD pada kelompok AL adalah 52,86%, kelompok IF adalah 68,57%, dan kelompok HF adalah 38,57% (tabel 2). Hasil rerata menunjukkan bahwa kelompok dengan perlakuan IF
memiliki kadar SOD tertinggi
dibandingkan AL dan HF.
Uji normalitas menggunakan uji
Saphiro-Wilk didapatkan hasil
p>0,05 yang menunjukkan data terdistribusi normal. Uji variansi menggunakan uji Levene didapatkan hasil p>0,05, sehingga digunakan uji One Way ANOVA.
Tabel 2. Kadar SOD tiap Kelompok Perlakuan & Nilai-p Uji Way ANOVA
*Uji statistik menggunakan One Way ANOVA, nilai P signifikan apabila p<0,05. AL : kontrol normal; IF : perlakuan intermittent fasting; HF : kontrol negatif.
Tabel 3. Hasil Uji Post Hoc (Uji Tukey)
*mean difference pada tingkat signifikansi 0,05. AL : kontrol
normal; IF : perlakuan intermittent fasting; HF : kontrol negatif.
Kelompok Kadar SOD
(dalam %) Mean Standar Deviasi (SD) Nilai p
AL 1 58,93 52,86 5,73 0,000 2 53,57 3 57,14 4 50,00 5 44,64 IF 1 73,21 68,57 3,70 2 64,29 3 67,86 4 71,43 5 66,07 HF 1 37,50 38,57 4,30 2 44,64 3 33,93 4 41,07 5 35,71
Kelompok Perlakuan Kelompok Perlakuan Mean difference p-value
AL IF -15,71600* 0,000 HF 14,28600* 0,001 IF AL 15,71600* 0,000 HF 30,00200* 0,000 HF AL -14,28600* 0,001 IF -30,00200* 0,000
2
Hasil uji One Way ANOVA disajikan dalam tabel 2 menunjukkan p-value adalah 0,000 (p<0,05). Hasil analisis statistik menunjukkan adanya perbedaan bermakna kadar SOD antara mencit dengan perlakuan IF dan kedua kelompok kontrol. Uji Post Hoc (uji Tukey) dilakukan untuk mengetahui kelompok apa saja yang memiliki perbedaan bermakna. Pada tabel 3 menunjukkan rata-rata kadar SOD berbeda bermakna antara kelompok AL, IF, dan HF.
Tikoo et al. (2007) melakukan penelitian dengan subjek tikus Sprague-Dawley yang dibagi menjadi empat kelompok yaitu control ad libitum (CAL), control IF (CIF), diabetic ad libitum (DAL),
dan diabetic IF (DIF). Hasil
pemeriksaan kadar SOD didapatkan terjadinya peningkatan yang signifikan pada kelompok DIF dibandingkan dengan kelompok DAL. Descamps et al. (2005) melakukan penelitian menggunakan subjek mencit yang diberi perlakuan sehari puasa sehari berbuka (AF) dibandingkan dengan mencit yang diberi makan setiap hari (AL). Hasil pemeriksaan SOD didapatkan
aktivitas SOD meningkat signifikan pada mencit kelompok AF.
Penelitian Hu et al. (2017) memberikan perlakuan IF terhadap tikus jantan Wistar yang kemudian diberi perlakuan hipoperfusi serebral dibandingkan dengan tikus yang diberi makan setiap hari (AL). Hasil pemeriksaan aktivitas SOD didapatkan lebih tinggi pada kelompok IF dibandingkan dengan kelompok AL.
Penelitian Cerqueira et al. (2011), IF yang dilakukan pada mencit yang dibagi menjadi 4 kelompok yaitu pemberian makan
setiap hari ad libitum (AL),
pemberian makan setiap hari dengan sebanyak 60% pakan merupakan suplemen mikronutrien (CR), pemberian makan setiap hari dengan kalori sebanyak 60% dari total kalori kelompok AL (FR), dan perlakuan puasa sehari dan berbuka sehari dengan makan ad libitum (IF). Hasil pemeriksaan aktivitas SOD pada jaringan lemak abdominal meningkat signifikan pada kelompok IF dibandingkan kelompok AL dan jaringan otot skeletal terjadi peningkatan yang signifikan pada
3
kelompok IF dibandingkan kelompok lainnya. Hasil pemeriksaan marker hidrogen
peroksida (H2O2) dari jaringan otot
skelet maupun lemak viseral abdominal didapatkan adanya peningkatan yang signifikan pada kelompok IF dibandingkan kelompok AL, CR, dan FR.
Jaringan hepar memiliki
kebutuhan oksigen (O2) yang tinggi
dalam proses metabolisme terutama
saat perlakuan IF. Produksi H2O2
pada hepar pada subjek dengan perlakuan IF lebih tinggi dibandingkan dengan subjek dengan perlakuan makan setiap hari (AL). Selain itu, IF menurunkan rasio
H2O2/O2 relatif secara signifikan
dibandingkan perlakuan AL pada jaringan hepar, sedangkan jaringan otak, jantung, dan otot skeletal tidak
mengalami penurunan bermakna.5
Pengaruh IF terhadap kadar enzim antioksidan dalam penelitian ini adanya peningkatan kadar SOD melalui mekanisme respon
adaptasi.16 Tubuh selama puasa akan
memecah jaringan adiposa menjadi bentuk asam lemak bebas. Adanya beta oksidasi asam lemak bebas pada
mitokondria jaringan hati yang menghasilkan benda keton sebagai hasil metabolit menyebabkan terjadi
stres oksidatif yang ringan.16,17
Mekanisme adaptasi melalui proses autofagi dimana terjadi peningkatan
kemampuan sel dalam mengeleminasi kerusakan protein
dan mitokondria dalam tubuhnya.16
Di sisi lain, IF menginisiasi aktivasi NFE2-related factor 2 (NRF2) yang berguna sebagai transkripsi gen
antioksidan dan detoksifikasi.17
Selain Mn-SOD (Mangan-SOD), terdapat protein chaperones dan reseptor proliferator koaktivator
gamma 1α yang berfungsi untuk
mengatasi kerusakan DNA, mekanisme autofagi dan regulasi
apoptosis.16
KESIMPULAN
Terdapat perbedaan kadar SOD yang bermakna antara mencit yang diberi perlakuan IF dibandingkan dengan kontrol. Pada kelompok mencit yang diberi perlakuan IF memiliki rata-rata kadar SOD tertinggi dibandingkan dengan kelompok AL dan kelompok HF.
4
SARAN
Penelitian mengenai pengaruh IF terhadap kadar SOD masih terbatas sehingga dapat dilakukan penelitian lebih lanjut pada kelompok dengan subjek penelitian lebih banyak. Perhitungan kalori dalam pemberian pakan bagi mencit perlu dihitung untuk mendapatkan pakan mencit yang sesuai dengan kebutuhan (ad libitum). Selain itu, diperlukan penelitian lebih lanjut terkait pengaruh IF terhadap kadar SOD dalam jaringan lainnya.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantu, khususnya kepada dr. Ika Fidianingsih, M.Sc. yang telah memberikan kesempatan bagi penulis untuk mengikuti penelitian mengenai pengaruh intermittent fasting.
REFERENSI
1. Mescher, AL. Histologi Dasar Junqueira, Teks dan Atlas, Edisi 12. 2011. Jakarta: EGC.
2. Syahrizal, D. Pengaruh Proteksi Vitamin C Terhadap Enzim Transaminase dan Gambaran Histopatologis Hati Mencit yang Dipapar Plumbum. 2008. Tesis. Medan: Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatra Utara. 3. Gomes E., Silva A., de
Oliveira M. Review article: oxidants, antioxidants, and the beneficial roles of exercise-induced production of reactive species. 2012. Oxid Med Cell Longev. page:1-12.
4. Rahman T, Hosen I, Islam T, Shekhar H. 2012. Oxidative stress and human health. 2012. ABB. Vol 3: 997-1019. 5. Chausse B., Vieira-Lara MA.,
Sanchez AB., Medeiros MHG., Kowaltowski AJ. 2015. Intermittent fasting results in tissue-specific changes in bioenergetics and redox state. 2015. PLOS ONE. Vol. 10(3).
6. Li S., Tan HY., Wang N., Zhang ZJ., Lao L., Wong CW., Feng Y. Review: The role of oxidative stress and antioxidants in liver diseases. 2015. Int J Mol Sci. Vol. 16:26087-26124.
7. Fukai T., Ushio-Fukai M. Superoxide dismutases: Role
5
in redox signaling, vascular function, and diseases. 2011. Antioxid Redox Signal. Vol. 15(6):1583-1606.
8. Jannah M., Nasihun T., Sumarawati T. The effect of fasting on the concentration of enzimatic antioxidants (superoxide dismutase and glutathione peroxidase) in rats. 2016. Sains Med. Vol. 7(1): 15-20.
9. Delpazir S., Norouzy A., Mazadi M., Rezaie P., Moshiri M., Etemad L., Nematy M., Vahdati N. Effect of Ramadan Fasting on Oxidative Stress and Pro-Oxidant-Antioxidant Balance. 2015. J Fasting Health. Vol. 3(2): 55-57.
10. Hadist riwayat Bukhari : 1131.
11. Patterson RE., Laughlin GA., Sears DD., LaCroix AZ., Marinac C., Gallo LC., Hartman SJ., Natarajan L., Senger CM., Martinez ME., Villasenor A. Intermittent fasting and human metabolic health. 2015. J Acad Nutr Diet. Vol. 115(8):1203-1212. 12. Tikoo K, Tripathi DN, Kabra DG, Sharma V, Gaikwad AB. Intermittent fasting prevents the progression of type I diabetic nephropathy in rats and changes the expression of
Sir2 and p53. 2007. FEBS J. Vol. 581:1071-1078.
13. Descamps O, Riondel J, Ducros V, Roussel AM. Mitochondrial production of reactive oxygen species and incidence of age-associated lymphoma in OF1 mice: effect of alternate-day fasting. 2005. Mech Ageing Dev. Vol. 126:1185-1191.
14. Hu Y, Yang Y, Zhang M, Deng M, Zhang JJ.
Intermittent fasting pretreatment prevents cognitive impairment in a rat
model of chronic cerebral hypoperfusion. 2017. J Nutr. Vol. 147(7):1437-1445. 15. Cerqueira FM, da Cunha FM, da Silva CCC, Chausse B, Romano RL, Garcia CCM, Colepicolo P, Medeiros MHG, Kowaltowski AJ. 2011. Long-term intermittent feeding, but not caloric restriction, leads to redox imbalance, insulin receptor nitration, and glucose intolerance. 2011. Free Radic Biol Med. Vol. 51(7):1454-1460.
16. Mattson, MP. Challenging oneself intermittently to improve health. 2014. Dose-Response. Vol. 12:600-618. 17. Hine CM, Mitchell JR. NRF2
and the Phase II Response in Acute Stress Resistance Induced by Dietary
6
Restriction. 2012. J Clin Expl Pathol. S4:004.
