i
PEMBERIAN KRIM EKSTRAK BUAH ANGGUR BALI (Vitis vinifera) 4% MENGHAMBAT PENINGKATAN EKSPRESI MMP-1 (Matrix Metaloproteinase – 1) DERMIS TIKUS (Rattus norvegicus) GALUR
WISTAR YANG DIPAPAR SINAR ULTRAVIOLET B ABSTRAK
Ultraviolet B (UVB) merupakan salah satu sumber radikal bebas yang dapat mempercepat proses penuaan, khususnya penuaan pada kulit. Sinar UVB dapat menembus sampai ke lapisan dermis kulit. Paparan sinar UVB berulang akan membentuk reactive oxygen species (ROS) dan meningkatkan kadar Matrix Metaloproteinase – 1 (MMP-1). Buah anggur (Vitis vinifera) adalah salah satu buah di Indonesia yang merupakan sumber antioksidan dengan kandungan polifenol dan antosianin yang cukup tinggi sehingga dapat memperlambat penuaan. Tujuan dari penelitian ini adalah membuktikan bahwa pemberian krim ekstrak buah anggur bali (Vitis vinifera) 4% menghambat peningkatan ekspresi MMP-1 (Matrix Metaloproteinase – 1) dermis tikus (Rattus norvegicus) galur Wistar yang dipapar sinar ultraviolet B.
Rancangan penelitian yang digunakan adalah eksperimental murni dengan post-test only control group design menggunakan 30 ekor tikus putih jantan, berusia 2-3 bulan dengan berat badan 180-200 gram. Sampel yang dipilih dibagi menjadi 3 kelompok yaitu kelompok kontrol yang diberikan paparan sinar UVB (P0), kelompok perlakuan 1 yang diberikan paparan sinar UVB dan krim dasar (P1), dan kelompok perlakuan 2 yang diberikan paparan sinar UVB dan krim ekstrak buah anggur 4% (P2). Setelah 4 minggu perlakuan tikus dieutanasi dan dikoleksi jaringan kulit untuk pemeriksaan ekspresi MMP-1 secara mikroskopis perbesaran 400 kali pada 3 lapang pandang dengan metode imunohistokimia dengan IHC kit POLYMER (Dako, Denmark).
Hasil analisis menunjukkan rerata ekspresi MMP1 pada kelompok kontrol (P0) yang dipapar sinar UVB saja adalah 30,42 ± 6,67 %, kelompok perlakuan 1 (P1) yang diberikan krim dasar dan dipapar sinar UVB adalah 29,34 ± 8,07 %, dan kelompok perlakuan 2 (P2) yang diberikan krim ekstrak buah anggur dan dipapar sinar UVB adalah 12,84 ± 3,44 % (p<0,01). Analisis lanjutan menggunakan LSD menunjukkan tidak ada perbedaan antara kelompok P0 dan P1 (p>0,05), sedangkan kelompok P2 berbeda nyata dengan kelompok P0 dan P1 (p<0,01).
Dapat disimpulkan bahwa pemberian krim ekstrak buah anggur bali (Vitis vinifera) 4% menghambat peningkatan ekspresi MMP-1 (Matrix Metaloproteinase – 1) dermis tikus (Rattus norvegicus) galur Wistar yang dipapar sinar ultraviolet B. Kata kunci: krim ekstrak buah anggur, MMP-1, UVB, tikus Wistar
ADMINISTRATION OF BALINESE GRAPE (Vitis vinifera) 4% FRUIT EXTRACT CREAM PREVENTED THE ELEVATION MMP-1 (Matrix
Metaloproteinase – 1) EXPRESSION IN ULTRAVIOLET B-EXPOSED WISTAR RATS (Rattus norvegicus)
ABSTRACT
Ultraviolet B (UVB) is a source of free radicals that accelerates aging process, especially in the skin. UVB rays can penetrate into the dermis layer. Repeat exposure to UVB rays will form reactive oxygen species (ROS), which inducing the expression of Matrix MetaloProteinase – 1 (MMP-1). Grape (Vitis vinifera) fruit is one of the plant growths in Indonesia and a source of antioxidant with polyphenol and anthocyanin thus has a potential to ameliorate aging phenotype. The purpose of this study was to prove that administration of Balinese grape (Vitis vinifera) fruit extract cream prevented the MMP-1 (Matrix Metaloproteinase – 1) elevation in ultraviolet B-exposed Wistar rats (Rattus norvegicus).
This study was a true experimental with post-test only control group design using 30 male rats, 2-3 months old and weight around 180-200 grams. Selected samples were divided into 3 groups: control group (P0) which were given exposure to UVB, the treatment group 1 (P1) which were given exposure to UVB and a cream base material, and the treatment group 2 (P2) which were given exposure to UVB and Grape (Vitis vinifera) fruit extract cream concentration of 4%. After 4 weeks of treatment the rats were euthanized and skin tissue were collected for microscopic examination of the expression levels of MMP-1 under 400 times magnification on three of the visual field by immunohistochemistry method used IHC kit POLYMER (Dako, Denmark).
The analysis showed that the average levels of MMP1 in the control group (P0) which were exposed to UVB only was 30,42 ± 6,67 %, in the treatment group 1 (P1) which were exposed to UVB and a cream base material) was 29,34 ± 8,07 %, while in treatment group 2 (P2) which were given exposure to UVB and Grape (Vitis vinifera) fruit extract cream concentration of 4% was 12,84±3,44 % (p<0.01). Further analysis using LSD indicated there were no different between P0 and P1 (p>0,05), while a significant different were observed between P2 with both P0 and P1 (p<0,01).
It can be concluded that administration of Balinese grape (Vitis vinifera) 4% fruit extract cream prevented the MMP-1 (Matrix Metaloproteinase – 1) elevation in ultraviolet B-exposed Wistar rats (Rattus norvegicus).
Keywords: grape fruit extracts, MMP-1, UVB, rats
Halaman
SAMPUL DALAM ... i
PRASYARAT GELAR ... ii
LEMBAR PENGESAHAN ... iii
PERNYATAAN BEBAS PLAGIATRISME ... iv
ABSTRAK ... v
ABSTRACT ... vi
DAFTAR ISI ... vii
DAFTAR TABEL ... xi
DAFTAR GAMBAR ... xii
DAFTAR SINGKATAN ... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Rumusan Masalah ... 6
1.3 Tujuan Penelitian ... 7
1.4 Manfaat Penelitian ... 7
BAB II KAJIAN PUSTAKA ... 8
2.1 Penuaan ... 8
2.1.1Mekanisme Penuaan ... 9
2.1.2 Gejala klinis penuaan ... 11
2.2 Proses penuaan Kulit ... 13
2.2.1 Definisi Penuaan pada kulit ... 13
2.2.2 Mekanisme penuaan pada kulit ... 15
2.3 Sinar ultraviolet ... 17
2.3.1 Efek akut radiasi sinar ultraviolet ... 18
2.3.2 Efek kronis radiasi sinar ultraviolet ... 20
2.4 Anatomi dan fungsi kulit manusia ... 20
2.4.2 Lapisan dermis ... 22
2.4.3 Lapisan subkutis ... 23
2.5 Fibroblas ... 24
2.6 Matriks metalloproteinase-1 (MMP-1) ... 25
2.7 Photoaging ... 27
2.7.1 Mekanisme photoaging akibat paparan sinar ultraviolet ... 28
2.7.2 Mekanisme aktivasi MMP-1 pada photo aging ... 30
2.8 Oksidan dan Radikal bebas ... 32
2.9 Antioksidan ... 34
2.10 Anggur Bali (Vitis vinifera) ... 35
2.10.1 Karakteristik tanaman anggur Bali ... 36
2.10.2 Kandungan kimia buah anggur Bali ... 37
2.10.3 Perbandingan hasil fitokimia ekstrak buah anggur dengan ekstrak buah lainnya……….. 39
2.11 Hewan coba tikus (Rattus norvegicus) ... 40
2.11.1 Penggunaan tikus (Rattus norvegicus) ... 40
2.11.2 Pemantauan keselamatan tikus ... 41
BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN ... 42
3.1 Kerangka Berpikir ... 42
3.2 Konsep Penelitian... 44
3.3 Hipotesis Penelitian ... 45
BAB IV METODE PENELITIAN ... 46
4.1 Rancangan Penelitian ... 46
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian ... 47
4.3 Populasi dan Sampel ... 47
4.3.1 Sampel Penelitian ... 47
4.3.2 Kriteria Sampel ... 47
4.4 Variabel Penelitian ... 48
4.4.1 Identifikasi dan klasifikasi variable ... 48
4.4.2 Hubungan antar variable ... 49
4.5 Definisi Operasional Variabel ... 49
4.6 Alat dan bahan ... 51
4.7 Prosedur Penelitian... 51
4.7.1 Prosedur pembuatan ekstrak buah anggur (Vitisvinifera) ... 51
4.7.2 Sebelum Perlakuan ... 52
4.7.3 Prosedur Perlakuan... 53
4.7.4 Setelah Perlakuan ... 55
4.7.5 Pembuatan Sediaan Histologis ... 55
4.7.6 Pengecetan immunohistokimia MMP1 ... 56
4.7.7 Pengamatan hasil ekspresi MMP1 ... 58
4.8 Alur Penelitian ... 59
4.9 Analisis data ... 60
BAB V HASIL PENELITIAN ... 61
5.1 Analisis Deskriptif ... 61
5.2 Uji Normalitas Data ... 63
5.3 Uji Homogenitas Data ... 64
5.4 Uji Komparabilitas ... 64
BAB VI PEMBAHASAN ... 66
6.1 Subyek Penelitian ... 66
6.2 Pembahasan Hasil Analisis Deskriptif ... 66
6.3 Pembahasan Hasil Uji Normalitas Data ... 67
6.4 Pembahasan Hasil Uji Homogenitas Data ... 68
6.5 Pembahasan Hasil Analisis Komparasi Data ... 68
6.6 Paparan Sinar UV-B Meningkatkan MMP-1 ... 69
6.7 Krim Ekstrak Buah Anggur Menghambat Peningkatan MMP-1 pada Jaringan dermis Tikus yang dipapar sinar UV-B ... 71
BAB VII SIMPULAN DAN SARAN ... 76 7.1 Simpulan ... 76 7.2 Saran ... 76 DAFTAR PUSTAKA ... 77 LAMPIRAN-LAMPIRAN ... 83 DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Data Biologi Tikus ... 41
Tabel 5.1 Hasil Analisis Deskriptif Data Ekspresi MMP-1 ... 61
Tabel 5.2 Hasil Uji Normalitas Data Antar Kelompok ... 63
Table 5.3 Hasil Uji Homogenitas Data Antar Kelompok ... 63
Table 5.4 Rerata Ekspresi MMP1antar kelompok ... 64
Table 5.5 Analisis LSD Perbandingan Rerata ekspresi MMP1 antar Kelompok ... 65
Gambar 2.1 Penyebab dan mekanisme Penuaan Kulit ... 16
Gambar 2.2 Jenis Sinar Ultraviolet dan Kemampuan Penetrasi Kulit ... 18
Gambar 2.3 Penampang Histologis jaringan kulit ... 21
Gambar 2.4 Pengamatan Ekspresi MMP-1 dengan Menggunakan Metode Immunohistokimia pada bagian Dermis jaringan Kulit ... 27
Gambar 2.5 Mekanisme penuaan kulit akibat paparan sinar ultraviolet .... 29
Gambar 2.6 Model Mekanisme Photoaging ... 32
Gambar 2.7 Anggur (Vitis vinifera) ... 37
Gambar 3.1 Kerangka Konsep penelitian ... 44
Gambar 4.1 Rancangan Penelitian ... 46
Gambar 4.2 Hubungan antar variabel ... 49
Gambar 4.3 Alur Penelitian ... 59
Gambar 5.1 Ekspresi MMP-1 pada jaringan dermis tikus dengan pengecetan Imunohistokimia ... 62
Gambar 5.4 Perbandingan Rerata Ekspresi MMP-1 antar Kelompok ... 65
AP-1 : Activator Protein 1 DNA : Deoxyribonucleic acid DHEA : Dehydroepiandrosterone FB : Fibroblast
HO : Hidrogen Peroxide
IGF-1 : Insulin like growth factor-1 IL-1 : Interleukin-1
KC : Keratinosit
MED : Minimal Erythema Dose MMPs : Matrix Metalloproteinases MMP-1 : Matrix Metalloproteinase-1 NO : Nitric oxide
NrF2 : Nuclear factor-E2-related factor 2 ROS : Reactive Oxygen Species
SOD : Superoxide Dismutase
TGF-β : Transforming Growth Factor Beta
TIMP-1 : Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase
UV : Ultra Violet
UV-A : Ultra Violet A UV-B : Ultra Violet B UV-C : Ultra Violet C
Lampiran 1 Ethical Clearance ……….… 83
Lampiran 2 Hasil Analisis Laboratorium ……… 84
Lampiran 3 Analisa Statistik ………. 85
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Manusia memiliki fase kehidupan sejak lahir di dunia yang akan dilalui oleh seluruh umat manusia, meliputi lahir, masa kanak-kanak, remaja, dewasa hingga sebelum kematiannya akan mengalami masa penuaan. Hingga saat ini penuaan masih dianggap sebagai takdir dan harus terjadi sebagaimana peristiwa alamiah. Penuaan masih menjadi sesuatu yang menakutkan bagi sebagian besar manusia, karena rendahnya kualitas hidup. Selama ini penuaan identik dengan hari-hari yang kurang menyenangkan karena manusia akan di hadapkan pada berbagai keluhan, penyakit degeneratif, dan menurunnya kualitas hidup. Penuaan ini akan terjadi pada hampir semua sistem tubuh manusia dan tidak semua sistem akan mengalami kemunduran pada waktu yang sama.
Saat ini, pandangan terhadap proses penuaan telah mengalami pergeseran. Proses penuaan dapat dicegah, diobati dan dikembalikan ke keadaan semula (Pangkahila, 2007). Penyakit dan disabilitas dahulu dianggap sebagai bagian yang tidak dapat dihindari dari suatu proses tumbuh kembang, akan tetapi hal ini tidak lagi dianggap benar. Proses penuaan merupakan suatu akumulasi secara progresif berbagai perubahan patologis di dalam sel dan jaringan yang terjadi seiring dengan waktu. Penuaan adalah suatu proses menghilangnya kemampuan jaringan secara perlahan untuk memperbaiki atau mengganti diri dan mempertahankan struktur serta fungsi normalnya, sehingga tubuh tidak dapat
bertahan terhadap kerusakan atau memperbaiki kerusakan tersebut (Pangkahila, 2011). Ilmu kedokteran Anti Aging Medicine mempelajari mengenai patofisiologi proses penuaan sehingga dengan diketahuinya patofisiologi serta penyebab penuaan, maka proses penuaan itu sendiri dapat dicegah, diperlambat atau malah dikembalikan ke keadaan semula.
Penyebab penuaan dapat dikelompokkan menjadi faktor internal dan faktor eksternal. Beberapa faktor internal ialah radikal bebas, hormon berkurang, proses glikolisasi, metilasi, apoptosis, sistem kekebalan yang menurun, dan gen. Faktor eksternal yang utama ialah gaya hidup tidak sehat, kebiasaan salah, polusi lingkungan, stress, dan kemiskinan (Pangkahila, 2011). Proses penuaan pada kulit terdiri dari 2 fenomena yang berbeda secara signifikan namun dapat terjadi secara simultan, yaitu proses penuaan intrinsik (intrinsic aging/chronological aging) dan penuaan ekstrinsik (extrinsic aging /photoaging) (Trojahn et al., 2015).
Proses penuaan terjadi pada seluruh organ dan jaringan pada tubuh, termasuk kulit. Karena kulit merupakan organ terluar yang melindungi tubuh dari berbagai kontak yang kemungkinan dapat berbahaya bagi tubuh, maka kulit merupakan salah satu organ yang paling cepat mengalami penuaan. Hal ini karena kulit sering mengalami kontak dengan senyawa berbahaya seperti radiasi UV dan polusi udara yang dapat menyebabkan penuaan (Battie et al., 2014). Selain itu, secara fenotipik, penuaan pada kulit merupakan proses penuaan yang paling nampak karena ciri fenotipik yang sangat mudah teramati seperti kulit keriput, kulit kendur, atau munculnya melasma (Binic et al., 2013). Dengan bertambahnya usia maka kulit
akan menjadi lebih tipis, lebih kering, kulit mengalami penurunan kelenturan dan kelembaban (Kurniawan, 2011).
Faktor yang paling berperan dalam penuaan dini kulit adalah sinar matahari yang dapat menyebabkan perubahan pada struktur dan fungsi kulit. Sebagian besar penuaan pada wajah diakibatkan oleh paparan terhadap sinar matahari yang berlebih (Flament et al., 2013). Kerusakan kulit yang disebabkan oleh paparan sinar matahari sangat tergantung dari sering dan lamanya paparan, jenis sinar UV serta tipe kulit seseorang (Ichihashi et al., 2009).
Sinar ultra violet berasal dari sinar matahari. Terdapat beberapa macam sinar yaitu sinar UVA (Ultra Violet A) yang memiliki panjang gelombang 320-400 nm, sinar UVB (Ultra Violet B) yang memiliki panjang gelombang 280-320 nm dan sinar UVC (Ultra Violet C) dengan panjang gelombang 100-280 nm. Dari berbagai macam sinar UV (Ultra Violet) yang ada, sinar UVB yang memiliki daya rusak sampai menembus lapisan dermis kulit dan merusak serat-serat kolagen yang ada didalamnya (Krutmann, 2011).
Penuaan yang disebabkan oleh radiasi kronis UV sinar matahari disebut sebagai Photoaging (Trojahn et al., 2015). Proses penuaan sangat erat kaitannya dengan radikal bebas (Goldman and Klatz, 2007; Pangkahila, 2007). Pembentukan radikal bebas di dalam sel terjadi secara terus menerus sebagai konsekuensi dari reaksi enzimatik maupun non-enzimatik. Reactive Oxygen Species (ROS) merupakan kumpulan radikal bebas yang berasal dari oksigen seperti radikal superoxide, hydroxyl, hydroperoxyl, lipid peroxyl, dan lain lain (Dröse and Brandt, 2012).
Matriks metalloproteinase (MMP) adalah enzym proteinase mengandung zinc, yang bertanggung jawab mendegradasi protein matriks ekstraseluler. MMP diklasifikasikan sebagai kolagenase, gelatinase, stromyelisin dan tipe membran (Quan et al., 2009). Sinar UV merangsang produksi Matriks metalloproteinase (MMP) secara epigenetik dan meningkatkan aktivitasnya. MMP kemudian berperan dalam photoaging dengan menginduksi degradasi kolagen dan elastin (Baumann, 2007).
MMP-1 adalah enzim yang berperan terhadap timbulnya degradasi kolagen pada kulit yang mengalami photoaging. Enzim MMP-1 kolagenolitik mendegradasi fibril kolagen dan elastin, yang penting untuk kekuatan dan elastisitas kulit. Aktivitas MMP-1 di kulit akan meningkat walaupun hanya dengan radiasi UV yang singkat, yang akan menyebabkan timbulnya kerutan pada kulit, yang menjadi tanda photoaging (Yaar and Gilchrest, 2008). Pada kulit manusia, MMP-1 adalah tipe yang paling terpengaruh oleh induksi sinar UV matahari dan bertanggung jawab terhadap pemecahan kolagen pada kulit yang mengalami photoaging (Xia et al., 2013). Ditemukan bahwa terjadi peningkatan kadar MMP-1 melalui regulasi ekspresi gen yang melibatkan modifikasi histon atau regulasi secara epigenetik yang signifikan jika dibandingkan dengan kultur sel yang tidak dipapar radiasi UV (Kim et al., 2014). Dengan demikian hambatan terhadap MMP-1 adalah satu cara mencegah kerusakan kulit akibat paparan UV.
Pemahaman patofisiologis photoaging akibat paparan UVB dapat membantu dalam upaya pencegahan keadaan patologis untuk berkembang lebih lanjut. Karena radikal bebas (ROS) yang terbentuk sebagai respon terhadap paparan
UV-B merupakan faktor utama yang menyebabakan peningkatan kadar dan aktivitas MMP-1 dalam mekanisme photoaging, maka dengan menghambat peningkatan kadar ROS atau menetralisir ROS yang telah diproduksi dapat mencegah photoaging lebih lanjut.
Upaya pencegahan dan penanggulangan ini dapat dilakukan dengan pemberian antioksidan. Berbagai macam antioksidan terdapat di alam, antara lain antioksidan primer (SOD, GPx) dan antioksidan sekunder (vitamin C, β–Karoten, vitamin E, sistein, Co Q10, flavonoid), dan antioksidan tersier (Metionin sulfoksida reduktase) (Baumann, 2008). Dengan meningkatkan kadar antioksidan maka efek samping dari paparan UV-B yang dimediasi oleh peningkatan produksi ROS seperti kemerahan atau eritema dan kerusakan kulit lainnya seperti meningkatnya kadar MMP-1 dan menurunnya kadar kolagen dapat dihindari (Nagao et al., 2007; Nagle et al., 2008).
Salah satu antioksidan yang paling banyak dibahas dalam dunia kedokteran belakangan ini adalah antioksidan yang berasal dari tumbuhan atau bahan alam. Diantara antioksidan ini adalah golongan flavonoid yang merupakan antioksidan non enzimatik (Ivanova et al., 2010). Flavonoid merupakan antioksidan yang memiliki potensi tinggi sebagai scavenger radikal bebas dan bersifat protektif terhadap stres oksidatif. Selain itu flavonoid telah terbukti mampu menghambat terjadinya peroksidasi lipid dalam tubuh (Szentmihályi et al., 2010)
Buah anggur mengandung banyak senyawa bioaktif yang memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi. Kulit anggur kaya akan flavonoid. Ekstrak biji anggur dikenal memiliki khasiat antioksidan yang kuat, terutama kandungan
proanthocyanidins yang memiliki kekuatan antioksidan lebih besar jika dibandingkan dengan antioksidan lain seperti vitamin C, vitamin E dan β-karoten dalam melindungi sel dari kerusakan DNA dan peroksidasi lipid akibat reaksi berantai radikal bebas (Pugliese et al., 2013).
Pada penelitian pendahuluan untuk menguji efektivitas dosis krim ekstrak buah anggur terhadap peningkatan jumlah kolagen dermis tikus Wistar yang dipapar sinar UVB didapat hasil bahwa pemberian krim ekstrak anggur 4% adalah yang paling efektif dalam meningkatkan jumlah kolagen, sehingga berdasarkan hasil ini dapat dianalogikan bahwa dosis 4% juga efektif untuk mencegah peningkatan MMP-1 (Liana, 2017). Dengan mekanisme yang belum diketahui penulis telah melakukan penelitian untuk menilai efek pemberian krim ekstrak buah anggur dalam menghambat peningkatan ekspresi MMP-1.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dapat diajukan masalah penelitian sebagai berikut: Apakah pemberian krim ekstrak buah anggur (Vitis vinifera) 4% dapat menghambat peningkatan eskpresi MMP-1 dermis kulit tikus Wistar yang dipapar sinar UVB?
Untuk membuktikan pemberian krim ekstrak buah anggur (Vitis vinifera) 4% dapat menghambat peningkatan ekspresi MMP1 dermis kulit tikus Wistar yang dipapar sinar UVB.
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah: 1. Manfaat ilmiah
Dari hasil penelitian diperoleh informasi ilmiah tentang efek pemberian krim ekstrak buah anggur (Vitis vinifera) 4% dapat mencegah penuaan kulit dengan menghambat jalur degradasi kolagen yaitu peningkatan ekspresi MMP-1 dermis kulit tikus Wistar yang dipapar sinar UVB. 2. Manfaat praktis
Untuk menegaskan bahwa jalur yang terlibat dalam pencegahan penuaan kulit tikus Wistar yang dipapar sinar UVB oleh krim ekstrak buah anggur (Vitis vinifera) 4% adalah jalur MMP-1.
