Seminar Nasional Ikan Ke-9, Masyarakat Iktiologi Indonesia,

(1)

Seminar Nasional Ikan Ke-9, Masyarakat Iktiologi Indonesia, 2016 1 PENDAHULUAN

Sumber Daya Alam (SDA) di Indonesia sangat melimpah.Sumberdaya alam tersebut beraneka ragam dibuktikan dengan semakinbertambah jenisnya.Hal ini menjadi alasan Indonesia merupakan salahsatu negara yang memiliki keanekaragaman hayati sangat besar (MegaBiodiversity) di dunia setelah Brazil (Muchlisin, 2009). Letak perairan Indonesia di daerah khatulistiwa dan beriklim tropis membuat Indonesia memiliki kekayaan jenis biota air yang lebih banyak dibandingkan dengan daerah dingin maupun sub tropis seperti Korea dan Mexico (Tinova, 2011), sehingga, sangat

(2)

Seminar Nasional Ikan Ke-9, Masyarakat Iktiologi Indonesia, 2016 2

pantas masyarakat dunia menempatkan Indonesia sebagai negara mega biodiversity (Dahuri, 2003).

Kekayaan ikan Indonesia yang sangat tinggi diperkirakan mencapai 8500 spesies (Adisoemarto & Rifai, 1992).Dari jumlah tersebut, 1300 spesies adalah ikan air tawar dan 1000 spesies ikan air tawar tersebut belum teridentifikasi (Kottelat, 1996).Pengetahuan biodiversitas sangat penting untuk mendukung informasi terkait database ikan-ikan di Indonesia (Rahayu et al., 2013).Berdasarkan hal tersebut, perlu adanya penyusunan database kekayaan hayati Indonesia sehingga dapat dengan mudah diidentifikasi dan diketahui klasifikasi jenis dan penyebarannya.

Sungai Ketro merupakan aliran sungai alami di desa Ketro, Kabupaten Ponorogo, Jawa Timur.Terdapat banyak spesies ikan yang ditemukan di aliran sungai tersebut. Diantara banyak spesies ikan tersebut, ada yang dikenal dengan nama ikan Melem Biru oleh masyarakat sekitar karena warna sisik ikan yang mengkilap dan berwarna kebiruan apabila terkena sinar matahari. Selain itu, di bagian atas oksiput ikan tersebut juga terdapat pigmen berwarna kebiruan.Ikan Melem Biru termasuk dalam genus Osteochilus.

Gambar 1. Ikan Melem Biru (Osteochilus spp.) yang Ditemukan di Aliran Sungai Ketro, Kabupaten Ponorogo, Jawa Timur; A. Ikan Melem Biru Diukur menggunakan Mistar; B. Ikan Melem Biru diukur Menggunakan Digital Caliper, Panjang Total Ikan (TL/Total Length) mencapai 130.56 mm. (Sumber: Dokumen Pribadi)

(3)

Ikan dari genus Osteochilus merupakan ikan yang memiliki ukuran kecil sampai sedang, terdiri dari 25 spesies dan penyebarannya di Asia Selatan (Karnasuta, 1993; Kottelat, 1995), yakni meliputi: perairan air tawar di Sumatera, Jawa, Kalimantan, Sulawesi, Malaysia, Thailand, Singapura, Vietnam, dan Kamboja (Weber & Beaufort,1916; Djajadireja et al., 1977). Ikan endemik Indonesia tersebut potensial dikembangkan sebagai komoditas perikanan (Mulyasari, 2010). Dari sisi ekonomi ikan nilem atau Melem Biru dijadikan bahan olahan misalnya baby fish goreng, dendeng, pindang, diasap dan dikalengkan (Rahardjo & Marliani, 2007). Dari aspek lingkungan ikan tersebut berperan sebagai biocleaning agent karena sifatnya yang suka memakan dentritus, perifiton dan alga sehingga ikan ini bisa digunakan sebagai pembersih danau (Jangkaru, 1989; Syandri, 2004; Mulyasari et al., 2010). Berdasarkan daftar merah yang diterbitkan oleh IUCN tahun 2014, ikan dari genus Osteochilus masuk dalam kategori leastconcern keberadaannya di alam, sehingga perlu adanya upaya konservasi dan biodiversitas untuk kelestarian ikan tersebut.

Identifikasi secara morfologi ikan Melem Biru di Sungai Ketro Kabupaten Ponorogo telah selesai dilakukan.Hasil identifikasi ikan Melem Biru tersebut diduga termasuk Osteochilus vittatus C.V. Blkr. (Taqwin et al., 2014). Berdasarkan data di Gene Bank dan The Barcode of Life Data System (BOLD System) ikan Melem Biru dari Kabupaten Ponorogo belum terdaftar, maka dari itu perlu dilakukan barcode dengan gen mitokondria yaitu cytochrome-c oxidase I (COI). Kelebihan lain dari sekuen barcode gen COI adalah adanya data base yang disebut The Barcode of Life Data System (Retnasingham et al., 2007). Data base ini menyimpan dan memberikan informasi data berupa hasil sekuen barcode gen COI, data spesimen, tingkatan taksonomi spesies, primer yang digunakan, penelusuran kekerabatan, dan barcode dari gen tersebut. Peneliti dari seluruh belahan dunia dapat dengan mudah mengakses maupun memasukkan hasil penelitiannya.

Teknologi Barcode dengan menggunakan penanda gen mitokondria dapat digunakan untuk mengidentifikasi hampir semua spesies hewan (Ward et al., 2005; Garcia et al., 2010), baik interspesifik maupun intraspesifik (Hebert et al., 2003). Gen yang banyak digunakan sebagai penanda barcode yaitu gen pengkode protein cytochrome-coxidase I (COI) dengan panjang 648 bp (Folmer et al., 1994; Zhang & Hewitt, 1997). Gen COI memberikan peluang yang sangat cepat dan akurat sebagai

(4)

marker untuk identifikasi variasi taksa dan mengungkapkan beberapa kelompok hewan yang belum diketahui tingkat taksonominya (Hebert et al., 2004; Ward et al., 2005, Meyer & Paulay, 2005; Hebert & Gregory, 2005; Popa et al., 2007; Hajibabei et al., 2007; Hubert et al., 2008; Rock et al., 2008; Arief et al., 2009).

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan status taksonomi spesies ikan Melem Biru yang ditemukan di aliranSungai Ketro, Kabupaten Ponorogoberdasarkan sekuen barcode gen COI dan menemukan hubungan kekerabatan genetik(filogenetic relationship) ikan genusOsteochilus yang ditemukan di aliran Sungai Ketro, Kabupaten Ponorogo dengan ikan dalam satu genus dari data yang tersedia di Gene Bank.

METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian telah dilakukan selama bulan Agustus sampai dengan Desember 2015.Isolasi DNA dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Universitas Negeri Malang, dan visualisasi DNA dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang.Tahap sekuensing dilakukan di First BASE Laboratories Sdn Bhd, Malaysia.

Teknik Pengambilan Sampel Ikan

Sampel ikan Melem Biru (Osteochilus spp.) diambil dari aliran sungai Ketro, Kabupaten Ponorogo, Jawa Timur. Cara pengambilan sampel ikan mengikuti prosedur standar dari Cailliet et al. (1996), yakni dengan menggunakan jaring dan alat pancing penyetrum (backpack electro fishing) 12 volt. Tidak ada dimorfisme seksual yang signifikan pada pengukuran karakter morfometrik yang diidentifikasi, oleh karena itu sampel ikan yang diambil tanpa mempertimbangkan jenis kelamin (Choudhury et al., 2011).

(5)

Seminar Nasional Ikan Ke-9, Masyarakat Iktiologi Indonesia, 2016 5 Pengambilan Data Sekuen Gen COI

Amplifikasi gen target dilakukan dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan sepasang primer universal yaitu, primer Forward FishF1:(5’

-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’) dan Reverse

FishR1:(5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’) (Ward et al., 2005). Siklus PCR yang digunakan sebanyak 35 siklus, meliputi predenaturasi pada suhu 940_{C selama 2 menit,}

denaturasi pada suhu 940_{C selama 20 detik, annealing pada suhu 54}0_{C selama 10 detik,}

ekstensi pada suhu 720_{C selama 50 detik, kemudian ekstensi akhir pada suhu 72}0_C

selama 5 menit. Hasil PCR diperiksa melalui elektroforesis dengan gel agarose 1%.Hasil dari elektroforesis diperiksa dengan menggunakan UV Transiluminator.Hasil amplifikasi gen COI disekuensing di First BASE Laboratories, Malaysia.Analisis sekuen barcode COI dilakukan dengan software: Sequence scanner, DNA Baser, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), BioEdit, dan MEGA 6.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA dari sirip ekor ikan Melem Biru dilakukan dengan menggunakan sepasang primer universal yaitu, primer Forward FishF1:(5’

-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’) dan Reverse

FishR1:(5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’) (Ward et al., 2005). Panjang gen COI yang berhasil diamplifikasi sebesar ± 700 bp.

Gambar 2. Pengecekan Hasil Amplifikasi Gen COI Ikan Melem Biru (Osteochilus sp.) dengan Menggunakan UV Transiluminator, M = DNA ladder 1kb, 1 = Sampel Ikan Melem Biru.

(6)

Sekuensing memberikan hasil fragmen COI sepanjang ±564 bp (Gambar 3). Hasil analisis consensus sequence menggunakan BLAST menunjukkan bahwa sekuen yang diperoleh adalah benar sekuen gen COI. Hal ini dibuktikan dari tingkat homologi sekuen sampel dengan sekuen gen COI Osteochilus hasseltii isolate A483a asal Indonesia yang diperoleh dari Gene Bank sebesar 100%. Hasil multiple alignment antara sekuen gen COI sampel dengan sekuen gen COI anggota dari genus Osteochilus menunjukkan bahwa sekuen gen COI sampel ikan yang diteliti memiliki sekuen yang relatif conserved pada basa 181 sampai dengan 690 (Gambar 4). Hasil analisis ini menunjukkan adanya tingkat mutasi yang cukup tinggi dengan ditemukannya basa-basa yang mengalami transisi atau transversi dan insersi atau delesi.

Gambar 3. Panjang Sekuen Gen COI Ikan Melem Biru (Osteochilus spp.)dari Sungai Ketro, Kabupaten Ponorogo ± 564 bp (base pairs)

(7)

Gambar 4. Hasil Multiple Alignment gen COI Ikan Melem Biru dengan Ikan Genus Osteochilus lainnya dan Spesies Ikan Pembanding.

Hasil alignment tersebut kemudian digunakan untuk membuat rekonstruksi topologi pohon filogenetik dengan menggunakan program komputer MEGA 6.Topologi pohon filogenetik dibuat dengan menggunakan metode NJ (Neighbor Joining) dengan perhitungan Kimura 2 Parameter.Penggunaan model perhitungan algoritmik Kimura 2 Parameter dikarenakan efektif untuk analisis DNA Barcoding dengan mempertimbangkan titik substitusi transisi dan transversi (Maralit et al., 2012). Hasil rekonstruksi topologi pohon filogenetik dengan menggunakan metode NJ (Gambar 5) menunjukkan bahwa sampel Melem Biru (Osteochilus spp.) membentuk satu clade monofiletik dengan Osteochilus hasseltiiisolate A483a yang didukung dengan nilai

(8)

boostrap 99%.Posisi taksonomi ikan Osteochilus spp. isolate JX074151 Sumatera Selatan, Osteochilus kahajanensis isolate HM345044 Indonesia, ikan Melem Biru (Osteochilus spp. PNRG), danOsteochilus hasseltii isolate A483a Indonesia berada satu cluster dengan Osteochilus vittatus isolate HM156365 Malaysia dan Osteochilus hasseltii isolate JQ346168 Laos.

Gambar 5. Topologi Pohon Filogenetik Berdasarkan Metode Neighbor Joining (NJ) dengan Nilai Boostrap 1000 Kali. Angka Pada Cabang Menunjukkan Nilai Boostrap.

Jarak genetik yang tinggi mengindikasikan telah terjadi mutasi.Hal ini dapat diamati dari banyaknya perbedaan basa nukleotida antara sampel semakin besar jarak genetik antar sampel, maka kesamaan basa nukleotida semakin kecil atau dapat dikatakan hubungan kekerabatan semakin jauh.Jarak genetik ikan Melem Biru (Osteochilus spp. PNRG) menunjukkan bahwa ikan tersebut diduga interspesies (berbeda spesies)dengan Osteochilus spp. isolate JX074151 Sumatera Selatan Osteochilus kahajanensis isolate HM345044 Indonesia, dan Osteochilus hasseltii isolate A483a Indonesia(Gambar 6)

(9)

Gambar 6. Persentase Jarak Genetik Ikan Melem Biru (Osteochilus spp.) dengan Ikan Genus Osteochilus Lainnya.

Hasil rekonstruksi topologi pohon filogenetik berdasarkan BOLD system menunjukkan bahwa ikan Melem Biru berada dalam clade yang sama dengan Osteochilus vittatus dari Jawa Tengah (Gambar 7). Berdasarkan indeks similaritas BOLD system ikan Melem Biru diduga spesies Osteochilus vittatus Jawa Tengah ditunjukkan dengan nilai similaritas 99,81%.

Gambar 7. Rekonstruksi Topologi Pohon Filogenetik Berdasarkan BOLDSystem, Kolom merah merupakan cluster yang membentuclade

(10)

Identifikasi spesies menggunakan sekuen barcode gen COI berdasarkan BOLD system menunjukkan hasil rekonstruksi topologi pohon filogenetik yang berbeda dengan hasil rekonstruksi topologi filogenetik berdasarkan Gene Bank. Hasil analisis berdasarkan BOLD system menunjukkan ikan Melem Biru berada satu clade dengan Osteochilus vittatus Jawa Tengah. Hal ini didukung dengan indeks similaritas antara ikan Melem Biru dengan Osteochilus vittatus Jawa Tengah sebesar 99,81%. Indeks similaritas yang tinggi menunjukkan tingkat kekerabatan yang dekat. Berdasarkan tingginya indeks similaritas pada BOLD system ikan Melem Biru diduga merupakan spesies Osteochilus vitttus Jawa Tengah.

Data mengenai Osteochilus vittatus Jawa Tengahbelum dipublikasikan pada Gene Bank. Hasil analisis topologi pohon filogenetik menurut Gene Bank menunjukkan bahwa ikan Melem Biru berada satu clade dengan Osteochilus hasseltii A483a Indonesia dengan nilai boostrap 99% bisa dinyatakan bahwa belum bisa hasil topologi tersebut benar untuk menentukan spesies (Georgy, 2008). Hal ini juga didukung dari hasil analisis jarak genetik (pairwise distance) antara ikan Melem Biru dengan spesies Ostochilus hasseltii isolate A483ayang dilaporkan di Gene Bank menunjukkan angka yang cukup tinggi yaitu 96%. Dari hasil tersebut diketahui jarak genetik lebih dari 3%.Spesies yang memiliki jarak genetik >3% tergolong berbeda spesies (interspesies) masih terdapat dalam satu genus, sedangkan spesies yang memiliki jarak genetik <3% tergolong intraspesies (Hebert et al., 2003; Freitas et al., 2011).

Kedekatan antara ikan Melem Biru dengan Osteochilus vittatus Jawa Tengahdapat dihubungkan dengan sejarah Pulau Jawa yaitu adanya aliran sungai purba di dasar laut, 17.000 sampai 20.000 tahun lalu pada Era Pleistocene(Voris et al., 2000). Aliran sungai purba ini menghubungkan antara Jawa Tengah dan Jawa Timur. Adanya aliran sungai purba ini memungkinkan ikan dapat berenang menuju aliran sungai yang terhubung dengan sungai purba menuju ke lokasi lain. Sehingga ikan Melem Biru dengan Osteochilus vittatus Jawa Tengahdiduga merupakan satu spesies dan berkerabat dekat.

(11)

Seminar Nasional Ikan Ke-9, Masyarakat Iktiologi Indonesia, 2016 11 SIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa status taksonomi ikan Melem Biru yang ditemukan dari Sungai Ketro, Kabupaten Ponorogo berdasarkan sekuen barcode gen COI diduga merupakan spesies Osteochilus hasseltii. Hubungan kekerabatan ikan Melem Biru berdasarkan BOLD system berkerabat dekat dengan Osteochilus vittatus dari Jawa Tengah, sedangkan berdasarkan Gene Bank berkerabat dekat dengan Osteochilus hasseltii isolate A483a dari Indonesia.

DAFTAR PUSTAKA

Adisoemarto S dan Rifai M, 1992.Keanekaragaman Hayati di Indonesia. Kantor Meneg KLH dan Konphalindo, Jakarta. 219.

Arief, I. A. & Khan, H. A. 2009.Molecular Markers for Biodiversity Analysis of Wildlife Animals: a brief review. Animal Biodiversityand Conservation. 32: 9-17.

Cailliet, G.M., Love, S., Ebelling, A.W. 1996. Fishes: A Field and Manual on Their Structure, Identification and Natural History, Waveland Press: New York.

Choudhury, S., Saikia, P., Sougrakpam, N., Brahma, D. & Dutta, K. 2011.Assessment of Morphometric Variation and EstablishingTaxonomic Relationship among Six Species under Puntius Genus.The Ecoscan: Special Issue 1(1): 233 237.

Dahuri,R. 2003. Keanekaragaman Hayati Laut, Aset Pembangunan Berkelanjutan Indonesia. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama.

Djajadireja, R.R.S, Hatimah, & Arifin, Z. 1997. Buku Pedoman Perikanan Darat. bagian I (Jenis-jenis Ikan Ekonomis Penting). Jakarta: Departemen Pertanian. Freitas, P.D., Machado,C.B., Ishizuka,T.K., Galetti, J.P.M. 2011. Molecular

Identification of Species From Genus Salminus (Characidae) through DNA Barcoding. Poster in Barcoding Fish in The Fourth International Barcode of Life Conference.

Folmer, O., Hoeh, B. W., Lutz, R. & Vrijenhoeicatk, R. 1994.DNA Primers For Amplification of Mitochondrial Cytochrome-c Oxidase Subunit I From Diverse Metazoan Invertebrates. Molecular Marine Biology And Biotechnology. 3(5): 294-299.

(12)

Garcia, R., Dick, C. W., Machado, C. & Herre, A. 2010.Comparative Phylogeography of Widespread Fig Species and Their Associated Wasp Pollonators.Proceedings of the Association for TopicalBiology & Conservation 2010 Meeting, Bali. Indonesia.

Georgy, T. R. 2008. Understanding Evolutionary Trees. Evo Edu Outreach 2008 (1): 121-137.

Hajibabei, M. M., Siregar, G., Hebert, P & Hickey, D.A. 2007.DNA Barcoding: Hoe it completets taxonomy, molecular phylogenetic, and population genetics. TRENDS in Genetics. Vol.xxx No.x. Pg.x.

Hebert, P. D. N, Cywinska, A.,Ball, S.L. & deWaard, J. R. 2003. Biological Identifications though DNA Barcodes. The Royal Society. 270: 313-321.

Hebert, P.D.N. 2004.Identification of Birds through DNA Barcodes.PloS Biology. 2:e312.

Hebert, P.D.N., Gregory, T. N. 2005. The Promise of DNABarcoding for Taxonomy.Systematic Biology. 54(5): 852-859.

Hubbert, N., Hanner, R., Holm, E. M., Nicholas, E. 2008. Identifying Canadian Freshwater Fishes though DNA Barcodes. PLoS One. 3(6): e2490.

Jangkaru, Z. 1980. Budidaya Ikan dalam Kantong Jaring Terapung.Pros. Lokakarya Nasional Teknologi Tepat Guna bagi Pengembangan Perikanan Budidaya Air Tawar. Bogor.

Karnasuta, J. 1993. Systematic Revision of Southeastern Asiatic Cyprinid Fish Genus Osteochilus with Description of Two New Species and A New Subspecies. Kasetsart Univ. Fish. Res. Bull., 19: IV + 105pp.

Kottelat, M. 1995. Four New Species of Fhises from The Middle Kapuas Basin, Indonesian Borneo (Osteichthyes: Cyprinidae and Belontiidae) Raffles Bull. Zool., 43(1): 51-64.

Kottelat, M. and A.J. Whitten, 1996.Freshwater fishes of Western Indonesia and Sulawesi: additions and corrections. PeriplusEditions, Hong Kong.8 p.

Maralit, B.A., Aguila, R. D., Ventolero, M. F. H., Perez, S. K. L., & Santos, M. D. 2012. Detection of Mislabeled Comercial Fishery By-Products in the Philippines

(13)

using DNA Barcodes and its Implication to Food Traceability and Safety.Food Control.Manuscript. Pg. 1-20

Meyer CP, Paulay G (2005) DNA Barcoding: Error Rates Based on Comprehensive Sampling. PLoS Bio. 3(12): e422.

Muchlisin, Z. A. & Azizah, M. N. 2009. Diversity And Distribution of Freshwater Fishes in Aceh Water, Northern Sumatra, Indonesia. Academic Journal. 5(2): 62- 79.

Mulyasari, D. T., Soelistyowati., Kristanto, A. H. & Kusmini, I.I. 2010. Karakteristik Genetik Enam Populasi Ikan Nilem (Osteochilushasselti) di Jawa Barat.Jurnal Riset Akuakultur, 5 (2): 175-182.

Popa, L. O., Popa, O. P..Gargarea, P. & Murariu, D. 2007.Sequence Analysis of The 5’ COI Gene Region from Dama dama (Linnaeus,1758) (Mamalia: Cervidae). Travaux du Museum National d’Historie Naturelle. Pg: 537-542.

Rahardjo, A.A. & Maharani, L. 2007. Nilem: Diolah Naik Derajat. Trubus. http://www.trubus.com (diakses pada 21 Maret 2008) dalam Mulyasari., D. T. Soelistyowati., A. H. Kristanto., dan I. I. Kusmini. 2010. Karakteristik Genetik Enam Populasi Ikan Nilem(Osteochilus hasselti) di Jawa Barat.Jurnal Riset Akuakultur, 5 (2): 175-182.

Rahayu, Dwi A., Listyorini, D., Ibrohim. 2013. Morphological Study to Improve Identification Toward Poeciliidae Family based on Gonopodium Structres and Morphometric Analysis. JTROLIS 3(1):91-95.

Ratnasingham, S. &Hebert , P. D. 2007. BOLD: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7: 355-364.

Rock, J., Costa, F. O., Walker, J. D., North, W. A., Hutchinson, F. W. & Carvalho, R. G. 2008. DNA Barcodes of Fish of The Scotia Sea,Antartica Indicates Priorty Groups For Taxonomic and SystematicFocus. Antartic Science. 20(3): 253-262. Syandri, H. 2004. Pengelolaan Sumberdaya Perikanan Perairan Umum. Unri Press:

Pekanbaru.

Taqwin, Nanda A. A., Munawaroh, Q., Sari, D. M., Suryani, E. M., Rahayu, Dwi A., & Listyorini, D. 2014. Studi Morfometrik dan Meristik Ikan Melem Biru (Osteochilus sp.) Di Aliran Sungai Ketro, Ponorogo, Jawa Timur. Prosiding Seminar Nasional Biodiversitas V 2014. UNAIR, Surabaya, Hal: 494-503.

(14)

Tinova, S. 2011. Description of Gambusia zarskei sp.n.-a New Poeciliid Fish from the Upper Rio Cochos System, Chicuchua, Mexico (Teleostei: Cyprinodontiformes: Poeciliidae). Vertebrate Zoology. 60: 11-18.

Voris, H.K. Maps of Pleistocene Sea Levels in Southeast Asia: Shorelines, River Systems and Time Durations. Journal of Biogeography, 27 (1157-1167).

Weber, M. & de Beaufort, L.F. 1916.The Fishes of Indo Australian Archipleago (Ostariophysi II: Cyprinidae, Apodes. Synbranchi).E.J. Brill Leiden Ltd.

Zhang, D. X. & Hewitt, G. M. 1997.Assesment of The Universality and Utility of a set of Conserved Mitochondrial Primers in Insect.Insect Molecular Biology. 6: 143-150.