Karakterisasi Kapulasan... 66 Karakterisasi Kapulasan (Nephelium Mutabile) Berbasis PCR_RAPD
di Sumatera Barat
Characterization Kapulasan (Nephelium mutabile) based on PCR_RAPD in West Sumatra
oleh:
Ediwirman 1) dan Ellina Mansya2) 1)
Jurusan Agrotegnologi Fakultas Pertanian Universitas Andalas Padang
2)
Balitbu Sukarami Sumatera Barat ABSTRACT
Research on the characterization Kapulasan (Nephelium mutabile) based on PCR-RAPD in West Sumatra have been made in the form of surveys and laboratory. The study aims to get kapulasan diversity of molecular markers based on PCR-RAPD. Conducted in the field Bonjol Pasaman, West Pasaman Kinali, and bottom scrapings district 50 City of West Sumatra province, while the laboratory experiments on the Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD) is done at the Laboratory of Biotechnology and Plant Breeding of Andalas University Padang. The resulting data is translated into binary data and analyzed with the NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) using NTSYS PC Version 2:01. Based on the results of research that has been done can be concluded, that there are 3 primary are used as markers (OPN-15, OPS-18 and OPW-02) produced levels of similarity ranged from 0.88 to 1.0 (88-100%). Similarity level of 0.94 (94%) resulted in six main groups, and at 100% similarity, the kapulasan genome from Bonjol (KPBJ-06) with from Kinali kapulasan KPKNL-06 has 100% similarity, as well as kapulasan genome from Kinali (KPKNL-04) and Guguk (KPGGK-01 with KPGGK-02). Key word : Diversity, PCR-RAPD, Kapulasan, molecular markers.
PENDAHULUAN
Kapulasan merupakan buah tropik yang potensial untuk dikembang- kan. Indonesia merupakan daerah tropik yang kaya sumberdaya genetik yang belum sepenuhnya dieksplorasi secara optimal. Kapulasan menjadi salah satu kekayaan flora dan tidak ditemukan pada semua wilayah. Menurut Sudarmadi (2003) kapulasan ditemukan di Jawa Barat dan Sumatera Barat. Berkurangnya populasi kapulasan terjadi akibat kerusak an lingkungan dan secara habitusnya tidak banyak wilayah yang cocok untuk kapulasan.Konservasi merupakan salah
satu upaya untuk menjaga kelestarian dan keragaman kapulasan di Indonesia.
Keanekaragaman kapulasan mam -pu menjelaskan hubungan kekerabatan secara umum, tetapi belum tentu mem- berikan informasi karakternya secara spesifik. Untuk mendapatkan informasi tersebut diperlukan suatu program karakterisasi dari plasma nutfah pada tingkat morfologi dan molekuler. Karakterisasi morfologi sering dipengaruhi oleh faktor lingkungan, sehingga penggunaan marka molekuler diharapkan dapat memberikan gambaran
Karakterisasi Kapulasan... 67 karakterisasi dengan akurasi yang cukup
tinggi dalam melihat keragaman genetik individu, baik pada tingkat spesies maupun kerabat jauhnya. Salah satu penanda molekuler adalah melalui hibridisasi fragmen DNA dengan marka DNA dengan mengamplifikasi fragmen DNA dengan mesin PCR.
Prinsip kerja markah RAPD adalah berdasarkan perbedaan ampli-fikasi PCR pada sampel DNA dari sekuen oligonukleotida pendek yang secara genetik merupakan kelompok penanda dominan (Williams, et al. 1990; Welsh dan McClelland 1990). Primer RAPD bersifat random dengan ukuran panjang biasanya 10 nukleotida. Jum-lah produk amplifikasi PCR berhubungan langsung dengan jumlah dan orientasi sekuen yang komplementer terhadap primer di dalam genom tanaman. Teknik RAPD dapat dilakukan setiap saat dengan sederhana, tanpa radioaktif, tidak perlu mencari urutan DNA pelacak, contoh DNA sedikit (McPerson et al., 1992); Yu et al., 1993), dan tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan (Marn et al., 1996).
Berdasarkan survei yang telah dilakukan dalam penelitian ini, penye-barannya di Sumatera Barat tidak pada semua daerah. Daerah utamanya antara lain : Pasaman dan 50 Kota. Hal ini da-pat dilihat dari populasi yang ada, namun tidak tertutup kemungkinan di daerah lainnya, mengingat kapulasan itu belum dikenal luas oleh masyarakat. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui tingkat keragaman kapulasan berda-sarkan penanda RAPD berbasis PCR. METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan mengenai karakterisasi kapulasan dengan penanda molekuler RAPD. Bahan yang digunakan untuk karakterisasi adalah
daun segar yang digunakan untuk karakterisasi secara molekuler dengan analisis RAPD.
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metoda Shangai-Maroof (1983) dengan menggunakan nitrogen cair, dan Doyley and Doyley (1991) melalui penyimpanan kering, dan metoda ekstraksi CTAB (Gillies et al, 1997) yang telah dimodifikasi untuk mening-katkan kualitas DNA yang akan diha-silkan.
Analisis kualitas DNA dilakukan berdasarkan kemampuannya untuk dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRI. Pemotongan DNA menggunakan 20 µl volume reaksi yang terdiri dari : 1 µl enzim restriksi EcoRI (Promega); 2 µl bufer H, dan 5 µg DNA dan diinkubasikan pada suhu 37˚C selama 3 jam. Reaksi dihentikan dengan penam-bahan 1 µl EDTA 0.5 M, kemudian di-tambah 4 µl loading bufer.
Hasil restriksi dari DNA dielektroforesis pada gel agarose (1.5 b/v) menggunakan bufer 0,5 x TBE yang telah ditambahkan larutan etidium bromida (0.5 mg/l). Eleketrooforesis dilakukan pada voltase konstan sebesar 135 volt selama 2 jam, selanjutnya divi-sualisasikan di atas UV transiluminator, dan dipotret mengguna-kan unit gel dokumentasi. Dari tahapan ini akan diperoleh preperasi DNA yang smear akibat terdegredasi, dan DNA utuh pada DNA yang tidak direstriksi.
Rekasi amplifikasi DNA dilakukan menggunakan kit RTG PCR (promega) dengan volume reaksi 15 µl yang terdiri dari : 9 µl ddH2O; 3 µl DNA template, dan 3 µl praimer RAPD (20 ρmol). PCR dilakukan dengan menggu-nakan DNA thermal cycler Biometra. Kondisi PCR yang digunakan disajikan pada Tabel 1.
Karakterisasi Kapulasan... 68 Tabel 1. Amplifikasi DNA kapulasan pada berbagai kondisi suhu annealing PCR
Program PCR Kondisi PCR I II III Pra PCR (°C) waktu (menit) 94 (0,30) 45 siklus 94 (5) 35 siklus 93 (2) 45 siklus Denaturasi (°C) waktu (menit) 94 (0,30) 94 (1) 92 (0,45) Annealing(°C) waktu (menit) 36 (0,30) 36 (3) 35 (2,45) Ekstensi(°C) waktu (menit) 72 (0,80) 72 (2) 72 (1,45) Final Ekstensi (°C) waktu (menit) 70 (10) 72 (10) Hasil amplifikasi dengan PCR
dianalisis dengan menggunakan elek-troforesis gel agarose dan didokumen-tasikan dengan menggunakan polaroid instan film. Data marka RAPD dianalisis menggunakan program aplikasi (NTSYS) untuk mengetahui pola kekera-batan pada setiap spesies (Numerical Taxo-nomy and Multivariate Analysis System) versi 2.0 (Rohlf, 1998).
HASIL DAN PEMBAHASAN Keragaman Kapulasan
Isolasi DNA genom kapulasan dilakukan dengan menggunakan metode antara lain; yaitu Sanghai-Maroof (1987), Doyle and Doyle (1991), dan Gillies et al, (1997). Hasil isolasi dari genom kapulasan disajikan pada Gambar 1. penggunaan metode isolasi yang tepat mampu menghasilkan pita DNA yang lebih baik. Isolasi yang menggunakan metode Doyle and Doyle (1987) mampu memberikan hasil isolasi yang lebih baik terhadap sampel yang telah dikeringkan menggunakan silika gel selama 1 ming-gu, dibandingkan dengan daun segar. Namun ditemukan pola pita yang ganda seperti pada Gambar 1 di bawah disebabkan oleh adanya RNA, RNA yang
dikandung oleh larutan DNA belum sepenuhnya hilang, sehingga penam-bahan RNase mampu menghilangkan aktifitas RNA. Tingginya polisakarida dan protein merupakan salah satu faktor yang dapat menghambat amplifikasi pada berbagai genom tanaman kapulasan. Keberadaan polisakarida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat. Untuk itu diperlukan untuk meningkat-kan kemurnian DNA dengan men-ghilangkan senyawa-senyawa terse-but dengan menambahkan senyawa puri-fikasi seperti RNase.
Selain kandungan polisakarida dan senyawa metabolit sekunder, kondisi daun juga menentukan kualitas DNA, untuk mempermudah proses isolasi, penggunaan daun yang berasal dari lapangan dengan jarak yang jauh, dapat dioptimalkan dengan menggunakan daun kering disimpan silika gel.
Penggunaan daun kering mampu menghasilkan DNA yang lebih baik di-bandingkan daun segar. Hal ini disebab-kan kapulasan merupadisebab-kan salah satu jenis tanaman yang memiliki kan-dungan fenol dan polisakarida yang tinggi,seperti halnya dengan rambutan yang merupa-kan kerabat dekat kepulasan.
Karakterisasi Kapulasan... 69 Gambar 1. Hasil isolasi DNA genom dari tanaman kapulasan dengan menggunakan metodDoyle and
Doyle (1987). Hasil isolasi yang belum diberikan RNase (A) dan yang diberi RNase (B)
Menurut Chew, Clyde, Normah, dan Salma (2005) sulitnya mengektraksi DNA disebabkan oleh tingginya kan-dungan polisakarida dan protein. Senyawa fenol dan polisakarida meru-pakan salah satu faktor yang dapat me-ngurangi efisiansi amplifikasi. Menurut Fang et al, tahun 1992 dalam Porebski et al. (1997), metabolit sekunder dan polisakarida dapat menghambat kerja enzim. Adanya polisakarida dalam tana-man ditandai dengan kekentalan pada hasil isolasi DNA yang menyebabkan kesulitan dalam pekerjaan pemipetan
DNA, dan DNA tidak dapat diampli-fikasi dalam reaksi PCR akibat peng-hambatan aktivitas Taq polymerase. Screening PCR dan Seleksi Individu
Screening PCR merupakan langkah penting dalam mendapatkan pola pita yang dapat menjelaskan polimor-fisme. Pengaturan suhu anealing menja-di salah satu faktor penting dalam mendapatkan pola pita yang jelas. Berda-sarkan Gambar 2, penggunaan suhu anealing 36°C mampu memberikan pola pita yang jelas dibandingkan dengan
Gambar 2.Pola pita hasil amplifikasi DNA genom kapulasan pada perbagai kondisi suhu anealing selama 45 siklus (suhu anealing 34°C, 36°C, 48°C, dan 42°C) pada gel elektroforesis 1% pada voltase 90 menit selama 120 menit.
A
B
Karakterisasi Kapulasan... 70 penggunaan suhu anealing 34°C, 48°C,
dan 42°C. Penggunaan konsentrasi 5 ng/µL bisa memberikan pita yang jelas. Menurut Prana dan Hartati (2003), Keberhasilan amplifikasi DNA genom menggunakan teknik RAPD selain ditentukan oleh urutan basa primer yang digunakan serta kuantitasnya (kandungan primer dalam setiap reaksi), ditentukan pula oleh kesesuaian kondisi PCR yang meliputi suhu annealing primer dan ekstensi.
Seleksi primer yang dilakukan terhadap genom tanaman kapulasan yang dilakukan menghasilkan tingkat polimorfisme yang berbeda diantara primer. Primer yang digunakan tidak semuanya mampu menghasilkan pola pita, namun pita DNA yang dihasilkan dari hasil amplifikasi berkisar antara 2 hingga 12 pita dengan ukuran berkisar antara 225 hingga 750 bp. Hasil amplifikasi DNA pool yang dilakukan dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Perbandingan pola pita DNA 12 primer yang terseleksi hasil amplifikasi dari 20 primer dengan menggunakan gabungan dari 3 genom kapulasan (M)1 kb ladder, (1) OPE-14, (2) OPY-09, (3) OPN-15, (4) OPS-03, (5) OPS-18, (6) OPK-15, (7) OPW-01, (8) OPW-02, (9) OPW-03, (10) OPW-14, (11) OPA-02, (12) OPW-04 (pada gel elektroforesis 1% pada voltase 90 menit selama 120 menit.
Hasil seleksi primer menunjukkan bahwa, tidak semua primer yang dapat digunakan sebagai penanda. Primer yang mampu menghasilkan produk amplifikasi yang lebih banyak diharapkan merupak-an salah satu penmerupak-anda ymerupak-ang dapat di-gunakan untuk seleksi individu pada tanaman kapulasan. Berdasarkan hasil seleksi primer tersebut ada 8 primer yang dapat digunakan untuk seleksi individu. Tiga primer diantaranya dapat dilihat Gambar 3, antara lain OPN-15, OPS-18, dan OPW-02. Salah satu hasil
ampli-fikasi primer yang terseleksi yang di-jadikan sebagai penanda adalah OPW-02 dapat dilihat pada Gambar 4.
Berdasarkan hasil amplifikasi dari setiap individu genom kapulasan, menghasilkan polimorfisme. Pita yang dihasilkan berkisar antara 7 hingga 9 pita, secara umum terdapat 2 pola pita yang berbeda yang dihasilkan. Pola pita yang berbeda itu diperlihatkan oleh genom kapulasan KPBJ-04 (lajur 4), KPBJ-06 (lajur 6), KPGGK-02 (lajur 10), KPGGK-04 (lajur 12), KPGGK-02 (lajur10). Untuk lebih
Karakterisasi Kapulasan...
jelasnya hasil seleksi individu menggu nakan 3 primer terseleksi disajikan pada Gambar 5. Berdasarkan hasil amplifikasi dengan tiga primer (Operon 10 dekamer)
Gambar 4. Hasil amplifikasi 20 genom tanaman kapulasan menggunakan (2) KPBJ-01; (3) KPBJ
08; (9) KPKNL-01; (10) KPKNL (14) KPGGK-06; (15) KPGGK KPGGK-04; (20) KPGGK
Gambar 5. Dendrogram keragaman kapulasan di Sumatera Barat menggunakan primer OPN-15, OPS
seleksi individu menggu-terseleksi disajikan pada Gambar 5. Berdasarkan hasil amplifikasi dengan tiga primer (Operon 10 dekamer)
setelah dianalisis menggunakan NTSys PC ver. 2.01 menghasilkan tingk
ripan yang berkisar antara 0,88 1,00 atau 88 hingga 100% pada tingkat
Hasil amplifikasi 20 genom tanaman kapulasan menggunakan primer OPW-KPBJ-03; (4) KPBJ-04; (5) KPBJ-05; (6) KPBJ-06; (7) KPBJ
01; (10) KPKNL-02; (11) KPKNL-03; (12) KPKNL-04; (13) KPKNL 06; (15) KPGGK-07; (16) KPGGK-01; (17) KPGGK-02; (18) KPGGK 04; (20) KPGGK-05. Elektroforesis pada gel agarose 1,5%.
Gambar 5. Dendrogram keragaman kapulasan di Sumatera Barat menggunakan 15, OPS-18, dan OPW-02 (konsentrasi 20 ρmol).
71 setelah dianalisis menggunakan NTSys PC ver. 2.01 menghasilkan tingkat kemi-ripan yang berkisar antara 0,88 hingga 1,00 atau 88 hingga 100% pada tingkat
-02 (1) KPBJ-01; 06; (7) 07; (8)
KPBJ-04; (13) KPKNL-05; 02; (18) KPGGK-03; (19)
Karakterisasi Kapulasan... 72 kemiripan 94% menghasilkan 6
kelom-pok utama. Kelomkelom-pok pertama adalah genom kapulasan asal Kinali (KPKNL-05), kelompok kedua asal Guguk (KPGGK-06), kelompok ketiga asal guguk (KPGGK-05), kelompok keempat asal Kinali (KPKNL-03), kelompok kelima asal Kinali dan Guguk (KPKNL-01 dan KPGGK-07), dan kelompok keenam adalah asal Bonjol (KPBJ-01, KPBJ-02, KPBJ-03, KPBJ-04, KPBJ-05, KPBJ-06, dan KPBJ-07), asal Kinali (KPKNL-02, KPKNL-04), dan asal Guguk (1, 2, KPGGK-3, KPGGK-4).
Dendrogram yang dihasilkan menunjukkan bahwa, kapulasan yang berasal dari Bonjol cenderung memisah dari kelompok lain, dan cenderung berada pada satu kelompok utama, dan bergabung dengan beberapa genom yang berasal dari Kinali dan Guguk. Hal ini diduga, bahwa kelompok kapulasan yang berasal dari Bonjol memiliki kekerabatan yang dekat, dibandingkan dengan kapulasan dari Kinali dan Guguk. Namun ada salah satu genom asal Bonjol (KPBJ-06) dengan genom kapulasan asal Kinali KPKNL-06 memiliki tingkat kemiripan yang sama (100%), begitu juga antara genom kapulasan asal Kinali (KPKNL-04) dan asal Guguk (KPGGK-01 dan KPGGK-02).
Berdasarkan pengelompokkan itu, bila dilihat dari sifat morfologi yang ada, tidak memberikan pengelompokkan yang nyata. Dari pengamatan di lapangan, salah satu faktor pembeda utama dapat dilihat dari bentuk cabang. Secara umum kapulasan memiliki bentuk cabang utama yang mendatar dan mengarah ke atas. Bentuk percabangan tanaman kapulasan secara umum ada dua, dari kedua sistem percabangan itu, percabangan mendatar memiliki cabang sekunder lebih sedikit, sedangkan pada tipe percabangan yang mengarah ke atas menghasilkan
cabang-cabang sekunder yang lebih banyak dengan pertumbuhan daun yang lebih rimbun.
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan, bahwa ada 3 primer yang dijadikan sebagai penanda (OPN-15, OPS-18, dan OPW-02) menghasilkan tingkat kemiripan berkisar 0,88 – 1,0 (88 – 100%). Tingkat kemiripan 0,94 (94%) menghasilkan enam kelompok utama, dan pada tingkat kemiripan 100%, genom asal Bonjol (KPBJ-06) dengan genom kapulasan asal Kinali KPKNL-06 memiliki tingkat kemiripan yang sama (100%), begitu juga antara genom kapulasan asal Kinali (KPKNL-04) dan asal Guguk (01 dan KPGGK-02). Pengelompokkan yang dihasilkan belum bisa menjelaskan secara morfo-logi, namun secara umum karakteristik morfologi, percabangan utama pada kapulasan ada dua, yaitu percabangan utama mendatar dan mengarah ke atas. UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Direkturat Jendel Pembinaan Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (DP2M) dengan nomor kontrak 0306/SP2H/DP2M/III/2008 yang telah memberikan dukungan dana dalam kegiatan penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Doyle JJ and Doyle JL, 1987. A rapid isolation proce dure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19:11–15. Marn, M.V., F. Stampar, and B.
Javornik. 1996. Screening for each scab resistance by RAPD markers in cultivar of apple.
Karakterisasi Kapulasan... 73 (Malus spp.). Plant Breeding 115:
488−493
McPherson, M.J., R.J. Oliver, and S.J. Gurr. 1992. The polymerase chain reaction. In: Gurr, S.J., M.J. McPherson, and D.J. Bowles (eds.). Molecular Plant Pathology, A
Practical Approach, vol. 1. Oxford University Press, New York: 123−144.
Porebski, S., Bailey, L.G. & Baum, B.R. 1997. Modification of CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysacharide and polyphenol components. Plant Molec Biol reporter 15: p. 8-15.
Porebski, S., Bailey, L.G. & Baum, B.R. 1997. Modification of CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysacharide and polyphenol components. Plant Molec Biol reporter 15: p. 8-15.
Prana. T.K, dan N. S. Hartati. 2003. Identifikasi sidik jari DNA talas (Colocasia esculenta L. Schott) Indonesia dengan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): Skrining Primer dan Optimalisasi Kondisi PCR. Jurnal Natur Indonesia 5(2): hal. 107-112.
Rohlf, F.J. 1993. NTSYS-pc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Exeter
Software, Applied Biostatistics Inc, New York. Lamoureux and Wulijarni-Soetjipto, eds.). N. Bogor genetik populasi. Inovasi. Vol.4/XVII. Hal. 33 – 35. Nucleic Acids Research, 1990, 18:7218–7228
Sudarmono. 2005. Konservasi tumbuhan dengan pendekatan Sastrapradja, S. 1975. Tropical fruit
germplasm in Southeast Asia. in South East Asian Plant Genetic Resources. (J.T. Williams, C.H. Welsh, J., and M. McClelland. 1990.
Finger printing genomes using PCR with arbitrary primers Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J.
Livak, J.A. Rafalski and S.V.
Tingey. 1990. DNA
polymorfisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids res. 18 (22): p. 6531 – 6535. Yu, K.F., A.D. Deynze, and K.P. Pauls.
1993. Random amplified polymorphic DNA analysis. In: Polick, B.R. and J.E. Thomson (Ed.). Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC
