Lampiran 1 Persiapan sebelum tahapan kuantitasi DNA dengan RT-PCR.
a. Penempatan larutan di dalam well sebelum DNA dikuantitasi dengan RT-PCR Std 1 Std 1 1A EC Std 2 Std 2 1 B Std 3 Std 3 1 C NTC 1 Std 4 Std 4 1 D 3 D NTC 2 Std 5 Std 5 Std 6 Std 6 Std 7 Std 7 Std 8 Std 8 2 D Keterangan :
Std 1- 8 : Larutan standar dengan urutan konsentrasi tertentu. 1 A, 1B, 1C : Larutan DNA + larutan glikogen ulangan I, II dan III
1 D,2 D,3D : Larutan DNA (tanpa larutan glikogen) = blanko presipitasi DNA. EC : Extraction Control = blanko ekstraksi DNA.
NTC : Non Template Control = larutan buffer TE.
b. Pembuatan larutan standar DNA manusia untuk membuat kurva standar konsentrasi DNA femur yang terpresipitasi
Standar Konsentrasi (ng/µL) Campuran Dilution Factor Std 1 50,00 5µL(200ng/µL stok)+15µL buffer TE 4x Std 2 16,70 5µL(Std 1)+10µL buffer TE 3x Std 3 5,56 5µL(Std 2)+10µL buffer TE 3x Std 4 1,85 5µL(Std 3)+10µL buffer TE 3x Std 5 0,62 5µL(Std 4)+10µL buffer TE 3x Std 6 0,21 5µL(Std 5)+10µL buffer TE 3x Std 7 0,068 5µL(Std 6)+10µL buffer TE 3x Std 8 0,023 5µL(Std 7)+10µL buffer TE 3x
Lampiran 2 Nilai rataan asam amino temilok.
No. Jenis asam amino
Hasil (% berat protein)
Rataan Standar deviasi I II 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Treonina Valina Metionina Isoleusina Leusina Fenilalanina Lisina Histidina Arginina Asam aspartat Asam glutamat Serina Glisina Alanina Prolina Tirosina Sisteina 0,387 1,293 0,596 0,337 1,251 1,195 1,821 1,005 1,839 2,854 3,663 1,285 1,662 1,651 0,418 0,719 0,423 0,360 1,287 0,518 0,349 1,243 1,179 1,795 1,016 1,761 2,841 3,432 1,236 1,820 1,618 0,403 0,729 0,402 0,37 1,29 0,56 0,34 1,25 1,19 1,81 1,01 1,80 2,85 3,55 1,26 1,74 1,63 0,41 0,72 0,41 0,019 0,004 0,055 0,008 0,006 0,011 0,018 0,008 0,055 0,009 0,163 0,035 0,112 0,023 0,011 0,007 0,015 Total 22,399 21,989 22,19 0,290 Sumber : Leiwakabessy (2011).
Lampiran 3 Rekapitulasi data pengukuran dan tabel sidik ragam residu nitrogen ekstrak glikogen (ppm) karena perlakuan konsentrasi KOH (resin kationik 6%). Konsentrasi KOH (%) Ulangan 20 30 40 I 2836,40 2846,40 120,33 II 3056,47 2106,24 383,30 III 2600,00 1457.97 248,81 Rataan±SD 2731,98±387,41 2136,87±694,73 250,81±131,49 Sumber keragaman db JK KT F Ftabel α=0,05 Perlakuan 2 10067554 5033777 23,23* 5,14 Galat 6 1300020 216670 Total 8 11367574
Uji Beda Nyata Jujur (Tukey):
W = q α(p;dbg). = q 0,05 (3;6). = 3,43 x 268,74 = 921,79
Residu nitrogen ekstrak glikogen karena perlakuan konsentrasi KOH yang dicobakan berbeda nyata pada taraf 0,05. Rataan residu nitrogen yang paling rendah adalah 250,81ppm atau 0,03%, yang dihasilkan dengan perlakuan KOH 40%.
Rumus kadar nitrogen:
% N = x 100%
Lampiran 4 Nilai absorbansi glukosa standar dan glikogen terekstrak dengan konsentrasi tertentu pada panjang gelombang 490 nm.
Sampel ke- Konsentrasi glukosa (ppm) Absorbansi Absorbansi sampel-blanko 1 0 (blanko) 0,009 - 2 50 0,240 0,231 3 100 0,433 0,424 4 150 0,665 0,656 5 200 0,819 0,810 6 250 1,072 1,063
a. Kurva standar glukosa
b. Karakterisasi glikogen terekstrak perlakuan konsentrasi KOH Sampel glikogen Absorbansi pada 490 nm Konsentrasi Glukosa (ppm) Persentase glukosa di dalam glikogen (%) 1 3,300 799,56 99,95 2 2,889 699,32 87,41 3 2,885 698,34 87,29 Rataan±SD 3,025±0,238 732,41±58,16 91,55±0,07
c. Karakterisasi glikogen terekstrak perlakuan resin dan lama pengadukan Sampel glikogen Absorbansi pada 490 nm Konsentrasi Glukosa (ppm) Persentase glukosa di dalam glikogen (%) 1 2,828 684,44 85,56 2 2,902 702,49 87,81 3 2,373 573,46 71,68 Rataan±SD 2,701±0,286 653,46±69,87 81,68±8,74 y = 0.004x + 0.021 R² = 0.995 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 50 100 150 200 250 300 A b sor b an si p ad a 490 n m Konsentrasi glukosa (ppm)
Lampiran 5 Ekstrak glikogen temilok yang menempel pada dasar tabung gelas dan larutan ekstrak glikogen temilok.
Lampiran 6 Rekapitulasi data pengukuran dan tabel sidik ragam rendemen ekstrak glikogen (%) karena perlakuan konsentrasi KOH (resin kationik 6%). Ulangan Konsentrasi KOH (%) 20 30 40 I 9,68 14,10 8,69 II 11,72 6,91 9,50 III 12.,53 14,58 7,50 Rataan±SD 11,31±1,47 11,86±4,30 8,56±1,01 Sumber keragaman db JK KT F F tabel α = 0,05 Perlakuan 2 18,74 9,37 1,30 5,14 Galat 6 43,26 7,20 Total 8 61,99 Keterangan :
Rendemen ekstrak glikogen karena perlakuan konsentrasi KOH yang dicobakan tidak berbeda nyata pada taraf 0,05.
Lampiran 7 Rekapitulasi data pengukuran dan tabel sidik ragam rendemen ekstrak glikogen temilok (%) dengan perlakuan persentase resin kationik dan lama pengadukan.
Ulangan
Resin (%)
Lama Pengadukan (jam)
Rataan±SD 8 16 24 I 9 12 11,78 8,46 7,92 11,60 8,56 9,24 9,42±2,07 9,77±1,63 II 9 12 12,40 12,36 10,50 7,71 12,71 12,24 11,87±1,20 10,77±2,65 III 9 12 12,19 10,08 14,91 11,26 14,60 13,84 13,90±1,45 11,73±1,92 Rataan±SD 9 12 12,12±0,32 10,30±1,96 11,11±3,53 10,19±2,15 11,96±3,09 11,77±2,34 11,24±2,21 Sumber Keragaman Jumlah Kuadrat db Kuadrat Tengah F hitung F tabel α= 0,05 Lama pengadukan Persentase resin Interaksi Galat Total 4,6710 3,8786 1,8579 73,3849 83,7924 2 1 2 12 17 2,3355 3,8786 0,9289 6,1154 0,38 0,63 0,15 3,88 4,75 3,88
Lampiran 8 Pengamatan bobot ekstrak glikogen selama pengeringan di dalam desikator vakum gel silika.
Ulangan Gram KOH Gram Temilok Kode Bobot sebelum pengeringan (g) Bobot setelah pengeringan (g) Bobot setelah/sebelum I 40,11 100,32 9-24 15,80 8,59 0,5437 40,09 100,47 12-8 13,61 8,50 0,6245 40,16 100,56 9-16 10,35 7,96 0,7691 40,07 100,23 9-8 15,39 11,81 0,7674 40,11 100,27 12-16 18,02 11,63 0,6454 40,02 100,26 12-24 13,28 9,26 0,6973 Rataan 40,09 100,35 14,41 9,63 0,6746 SD 0,05 0,13 2,62 1,68 0,0878 II 40,01 100,16 12-8 14,47 12,38 0,8556 40,06 100,06 12-24 14,60 12,25 0,8390 40,09 100,08 9-8 14,73 12,41 0,8425 40 100,02 9-24 14,93 12,71 0,8513 40 100,03 9-16 13,95 10,50 0,7527 40,12 100,05 12-16 10,27 7,71 0,7507 Rataan 40,05 100,07 13,83 11,33 0,8153 SD 0,05 0,05 1,77 1,94 0,05 III 40,06 100,11 9-8 14,21 12,20 0,8586 40,05 100,04 9-24 16,72 14,61 0,8738 40,02 100,02 12-24 16,22 13,85 0,8540 40,04 100,02 12-8 12,11 10,08 0,8324 40,01 100,08 12-16 13,50 11,27 0,8348 40,04 100,08 9-16 17,47 14,92 0,8539 Rataan 40,04 100,06 15,04 12,82 0,8512 SD 0,02 0,04 2,09 1,95 0,02
Lampiran 9 Rekapitulasi data pengukuran dan tabel sidik ragam residu asam nukleat larutan glikogen temilok 2% (mg/mL) dengan perlakuan persentase resin kationik dan lama pengadukan.
Ulangan Resin (%)
Lama Pengadukan (jam)
Rataan±SD 8 16 24 I 9 0,0658 0,0861 0,0797 0,0772±0,0104 12 0,0853 0,0633 0,0780 0,0755±0,0112 II 9 0,0770 0,0886 0,0905 0,0854±0,0073 12 0,0997 0,0862 0,0903 0,0921±0,0069 III 9 0,0836 0,0998 0,0817 0,0884±0,0099 12 0,0702 0,0702 0,0915 0,0790±0,0152
Rataan±SD 9 0,08±0,01ab 0,09±0,01b 0,08±0,01ab
0,08±0,01 12 0,09±0,01b 0,07±0,00a 0,09±0,01b
Sumber Keragaman Jumlah Kuadrat db Kuadrat Tengah F hitung
F tabel α=0,05 Lama pengadukan Persentase resin Interaksi Galat Total 0,00010 0,00001 0,00080 0,00099 0,00200 2 1 2 12 17 0,00005 0,00001 0,00040 0,00008 0,55 0,11 4,44* 3,88 4,75 3,88
Uji Beda Nyata Jujur (Tukey):
W = q α(p;dbg). = q 0,05 (6;12). = 4,75 x 0,0052 = 0,02
Interaksi perlakuan lama pengadukan dan bobot resin berpengaruh nyata terhadap rataan kadar asam nukleat larutan glikogen temilok 2% pada taraf 0,05. Lama pengadukan 16 jam dan persentase resin 12% adalah interaksi perlakuan terbaik dengan rataan kadar asam nukleat yang paling rendah yaitu sekitar 0,07 mg/mL.
Lampiran 10 Data pengukuran absorbansi sampel larutan glikogen temilok 2% Ulangan Gram KOH Gram Temilok Resin (%) Pengadukan (jam) A260 A280 A320 I 40.11 100.32 9 24 3.397 2.687 1.673 40.09 100.47 12 8 3.324 2.546 1.495 40.16 100.56 9 16 3.484 2.712 1.625 40.07 100.23 9 8 2.553 1.946 1.154 40.11 100.27 12 16 2.671 2.096 1.316 40.02 100.26 12 24 3.137 2.435 1.457 Blanko 0.046 0.054 0.063 II 40.01 100.16 12 8 4 3.158 1.772 40.06 100.06 12 24 3.593 2.746 1.655 40.09 100.08 9 8 4 3.677 1.972 40 100.02 9 24 4 3.314 1.906 40 100.03 9 16 4 3.393 1.889 40.12 100.05 12 16 3.328 2.515 1.484 Blanko 0.004 0.005 0.006 III 40.06 100.11 9 8 3.358 2.592 1.566 40.05 100.04 9 24 3.29 2.544 1.535 40.02 100.02 12 24 3.591 2.664 1.557 40.04 100.02 12 8 4 3.871 2.016 40.01 100.08 12 16 2.888 2.26 1.372 40.04 . 100.08 . 9 . 16 Blanko 3.74 -0.0250 2.787 -0.0190 1.633 -0.0100
Lampiran 11 Contoh perhitungan uji perbandingan berganda terhadap data konsentrasi DNA femur yang terpresipitasi.
Sampel Ulangan I Ulangan II Ulangan III Rataan Simpangan Baku Sampel 0.0415 0.0391 0.0214 0,0340 0,0110 Blanko 0,0527 0,0427 0,0250 0,0401 0,0140 H0 : µ1=µ2 atau rataan konsentrasi DNA femur tertinggi yang terpresipitasi dengan penambahan glikogen sama dengan yang terpresipitasi tanpa penambahan glikogen (blanko), atau dengan kata lain µ1-µ2= 0
Ulangan Blanko dj dj2 I 0,0415 0,0527 0,0415 - 0,0527 = -0,0117 0,000137 II 0,0391 0,0427 0,0391 - 0,0427 = -0,0036 0,000013 III 0,0214 0,0250 0,0214 - 0,0250 = -0,0036 0,000013 0,0189, ( )2=0,000357 0,000163 to = dengan Sd2 = = = -0,063 Sd2= 0,000022 Sd = 0,0047, maka to = = -23,2643
dengan α =0,05 maka t tabel = tα/2, n-1 = t0,025; 2 = 4,303
karena to < t tabel , maka keputusan yang diambil adalah gagal tolak Ho, artinya
tidak ada peningkatan yield DNA femur yang signifikan setelah presipitasi DNA femur dengan penambahan larutan glikogen dari formula ekstraksi terbaik.
