APLIKASI PENANDA MOLEKULER MIKROSATELIT/SSRs
(
Simple Sequence Repeats
) UNTUK MENUNJANG PROGRAM
PEMULIAAN TANAMAN
Imas Cintamulya*Universitas PGRI Ronggolawe-Jl. Manunggal No.61 Tuban jawa Timur *Corresponding author: warli_tbn@yahoo.com
ABSTRACT
Based on DNA markers lately become a choice and has been applied to many types of plants. The advantages of DNA markers or molecular markers are not infl uenced by the environment and are expressed in all plant tissues. Selection of activities on conventional breeding could be accelerated if synergized with molecular marker technology, known as Marker Assisted Selection (MAS). With MAS, the selection becomes more effective and effi cient as selection based solely on genetic properties of plants, not infl uenced by environmental factors. Simple Sequence Repeats (SSRs) or microsatellite is one DNA markers. SSRs or microsatellite markers proved accurate and more precise compared to other molecular markers in studying genetic variation in plants. Everything has been developed and mapped in several species of plants and proved useful in selecting a marker, because mikrosaterlit markers are at the level of the genes responsible for the characteristic/phenotype trait. Microsatellite, useful to create a genetic map based on the nucleotide sequence of plant species, so it is an effi cient tool for plant breeding and genetics expert to connect between phenotypic and genotypic variation. Use of microsatellite molecular markers in plant breeding programs is one way to get a new superior cultivars, which empowered the high-quality results and on certain environmental conditions.
Key words: microsatellites, molecular markers, plant breeding
PENGANTAR
Dewasa ini telah berkembang penanda genetik untuk membantu analisis variasi genetik tanaman baik antar spesies maupun dalam satu spesies. Ada tiga jenis penanda yang umum digunakan yaitu: penanda morfologi, penanda berdasarkan protein, dan penanda berdasarkan DNA. Penanda yang mudah dikenali dari pengamatan mata adalah penanda morfologi seperti bentuk daun, urat daun, bentuk kelopak bunga, warna bunga dan sebagainya. Penanda morfologi dapat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan sehingga kurang akurat.
Penanda berdasarkan protein umumnya adalah isozim, sedangkan alozim jarang digunakan, isozim menunjukkan satu enzim dengan satu lokus. Penanda isozim mempunyai beberapa kekurangan yaitu terbatas pada enzim yang dapat dideteksi insitu, dan pola pita relatif dapat dipengaruhi oleh lingkungan dan tipe jaringan sel spesifi k. Penanda isozim telah banyak diaplikasikan pada beberapa tanaman seperti kedelai (Rita et al., 2004), dan tanaman jarak pagar (Yunus, 2007a dan Yunus, 2007b).
Penanda berdasarkan DNA akhir-akhir ini menjadi pilihan dan telah diaplikasikan pada banyak jenis tanaman (Yunus et al., 2008). Kelebihan penanda DNA atau penanda molekuler adalah tidak dipengaruhi oleh lingkungan dan terekspresi pada semua jaringan tanaman. Weising et al.
(1995) mengemukakan bahwa pendekatan molekul pada tingkat DNA memiliki beberapa keuntungan diantaranya: (1) Penelitian tingkat genotip dapat langsung diuji dari pada fenotip, (2) Bagian DNA yang berbeda, berevolusi dengan kecepatan yang berbeda sehingga bagian yang tepat dapat dipilih untuk studi selanjutnya, (3) Berbagai teknik berdasarkan tingkat DNA telah banyak dikembangkan dan masing-masing berpotensi menjadi penanda gen yang tepat untuk pemecahan masalah tertentu, (4) Dapat digunakan untuk melihat filogeni, tes parental atau pembuktian silsilah.
Beberapa macam penanda molekuler berdasarkan DNA meliputi: (1) Penanda yang berdasarkan pada hibridisasi DNA seperti Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP), (2) Penanda yang berdasarkan pada reaksi rantai polimerase yaitu Polymerase Chain reaction (PCR) dengan menggunakan urutan-urutan nukleotida sebagai primer, seperti Randomly Amplifi ed Polymorphic DNA (RAPD) dan Amplifi ed Fragment Length Polymorphism (AFLP), (3) penanda yang berdasarkan pada PCR dengan menggunakan primer yang menggabungkan urutan komplementer spesifi k DNA target, seperti Sequence Tagged Sites (STS), Sequence Characterized Amplifi ed Regions (SCARs), Simple Sequence Repeats (SSRs) atau mikrosatelit, dan Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) (Varshney et al., 2005).
Dari berbagai penanda molekuler, penanda SSRs atau mikrosatelit terbukti akurat dan lebih tepat dibandingkan dengan penanda molekuler yang lain dalam mempelajari variasi genetik tanaman. Semuanya telah dikembangkan dan dipetakan pada beberapa spesies tanaman dan terbukti bermanfaat dalam penyeleksian dengan penanda tersebut, karena penanda mikrosaterlit berada pada tingkat gen yang bertanggung jawab terhadap ciri/sifat fenotip. Di samping itu penanda SSRs atau mikrosatelit berguna untuk membuat peta genetik berdasarkan urutan nukleotida pada spesies tanaman, sehingga merupakan alat yang efi sien bagi para pemulia tanaman dan ahli genetik untuk menghubungkan antara variasi fenotip dan genotip (Gupta dan Varshney, 2000).
Dengan adanya proyek Expressed Sequence Tag (EST) yaitu program untuk penemuan gen pada beberapa spesies tanaman, telah memberikan banyak data mengenai urutan DNA, yang bertanggungjawab atas sifat-sifat tertentu dan klon cDNA dengan"full-length" telah disimpan dalam
online database untuk khalayak umum (Rudd, 2003).
Data ini dapat digali untuk identifikasi adanya Simple
Sequence Repeats (SSRs) atau penanda mikrosatelit yang
di-download dengan menggunakan program komputer
dari Gen Bank dan di-scan. Selanjutnya dari data tersebut, primer yang mengapit lokus spesifi k dari mikrosatelit dapat dirancang untuk memperbanyak lokus mikrosatelit secara
in vitro melalui teknik PCR. Dalam tulisan ini penulis
meninjau penanda molekuler mikrosatelit pada tanaman, serta memberikan penilaian kritis mengenai penggunaan relatif dari penanda gen mikrosatelit atau penanda genom mikrosatelit untuk tujuan khusus, yang menunjukkan adanya pergeseran paradigma dalam penelitian untuk pemuliaan tanaman.
BAHAN DAN CARA KERJA
Cara kerja dala penelitian ini adalah melakukan kajian rentang penanda molekuler mikrosatelit pada tanaman. Kajian ini akan dibahas lebih mendalam tentang potensi perkembangan mikrosatelit di masa akan dating.
HASIL
Semua kromosom eukariotik mengandung DNA berulang, tetapi prokariotik biasanya tidak mengandung jenis DNA ini. DNA berulang disebut DNA satelit karena potongan-potongan DNA berisi urutan berulang dari pita satelit ketika DNA genom dipecah menjadi potongan-potongan dengan sentrifugasi yang tinggi. Walaupun
beberapa DNA satelit tersebar disekitar genom, sebagian besar berada di daerah sentromer di mana memainkan peranan struktural mungkin sebagai pengikat untuk satu atau lebih protein sentromer.
DNA satelit diklasifi kasikan ke dalam dua tipe, yaitu minisatelit dan mikrosatelit. Minisatelit adalah untaian DNA yang berisi urutan berulang yang panjangnya sekitar 20 hingga 100 pasangan basa. Minisatelit sebagian besar terpusat di dekat telomer. Minisatelit fungsinya sangat penting dalam repliksi DNA. Mikrosatelit adalah urutan DNA dengan motif sederhana yang berulang-ulang terdiri dari dua sampai lima unit nukleotida yang melimpah dalam genom suatu spesies (Azrai, 2005). Dua sampai lima motif urutan nukleotida pada mikrosatelit tersebut merupakan urutan yang konservatif.
Kelebihan Mikrosatelit
Dalam Park et al. (2009) disebutkan bahwa mikrosatelit memiliki banyak keuntungan dibandingkan dengan sistem penanda lain yaitu diantaranya:
Reproduktifitasnya Tinggi
Reproduktifi tas profi l mikrosatelit kuat seperti halnya RFLPs. Prosedur untuk analisis SSR sederhana dan hanya memerlukan sedikit DNA template. Analisis SSR tidak memerlukan restriksi dengan enzim, hal ini dapat menghasilkan profi l yang sama dari bagian DNA template. Tidak memerlukan DNA template yang murni seperti yang diperlukan dalam analisis AFLP. Biasanya DNA yang terkontaminasi atau DNA kotor akan menyulitkan dalam pencernaan oleh enzim restriksi sehingga menghasilkan band non-spesifi k.
Variasi Alel Sangat Tinggi
Sistem penanda mikrosatelit menghasilkan variasi alel yang sangat tinggi, dan sangat erat terkait dengan varietas. Sebuah survey menunjukkan bahwa jumlah alel bervariasi dari 1–37 dengan indeks keragaman 0,29–0,95 dalam major crop species. Tingkat variasi genetik yang terdeteksi oleh SSRPs hampir dua kali lebih tinggi daripada yang terdeteksi oleh RFLPs, pada 61 galur kedelai. Dalam studi perbandingan dengan menggunakan sistem penanda RFLP, RAPD, AFLP dan mikrosatelit pada analisis plasma nutfah, mikrosatelit menunjukkan heterozigositas yang diharapkan tinggi.
Bersifat Kodominan
Mikrosatelit berhubungan dengan sifat kodominan, meskipun band homoplasious dapat menyesatkan dalam
penskoran profil mikrosatelit. Band yang dihasilkan mikrosatelit dari primer yang sama secara intuitif adalah
orthologous. Beberapa band yang dihasilkan dari analisis RAPD dan AFLP tidak menunjukkan alelik atau band
orthologous sampai dikonversi ke dalam penanda STS
setelah sequensing. Sifat kodominan dari mikrosatelit cocok untuk analisis genetik dalam segregasi populasi F2 atau analisis asal-usul dalam persilangan.
Terdistribusi dalam Genom
Mikrosatelit melimpah dan terdistribusi di dalam genom. Semakin banyak sequensing genom yang diidentifi kasi dari berbagai spesies eukariotik, hal ini semakin jelas bahwa mikrosatelit benar-benar melimpah dihampir semua spesies dan terdisribusi dengan baik disepanjang genom.
Terkait dengan Nonrepetitif
Mikrosatelit adalah secara istimewa terkait dengan
nonrepetitif DNA. Tempat genomik dari penanda SSR,
berasal dari genomic libraries, kemudian menuju daerah yang ditranskripsikan (genic SSR) atau daerah yang tidak ditranskripsikan (genomic SSR). SSRs yang berasal dari ESTs atau cDNA, kebanyakan genic SSR, yang memiliki potensi aplikasi seperti daerah untuk karakterisasi fungsi gen, analisis QTL, dan analisis asosiasi penandaan gen. Namun keuntungan terakhir hanya dapat diterapkan pada spesies dengan jumlah besar pada EST atau urutan cDNA atau dapat diakses secara bebas untuk umum.
Jumlah lokus mikrosatelit banyak variabelnya, terdistribusi dengan baik diseluruh genom, memberikan data berkualitas baik dan mudah digunakan. Tapi mikrosatelit pun punya kekurangan. Sebelum lokus mikrosatelit dapat digunakan, harus ditemukan terlebih dahulu. Pendekatan termudah adalah dengan "menumpang" pada pekerjaan yang pernah ada. Beberapa model organisme telah memiliki banyak gen yang telah disekuensi dan pencarian database
melalui komputer akan memunculkan beberapa urutan-urutan mikrosatelit yang akan dapat dijadikan primer untuk disain PCR. Namun untuk hampir semua spesies, harus dilakukan beberapa pekerjaan khusus molekular untuk menemukan mikrosatelit. Jika pekerjaan ini telah dilakukan pada spesies kajian tersebut dan tersedia sekuensinya (atau primernya), maka akan lerbih mudah. Ada 1 perusahaan yang menyediakan beberapa primer dengan harga rendah (Research, Genetics, Huntsville, Alabama, USA). Pilihan lain adalah mendesain primer mikrosatelit dari spesies berkerabat dekat yang telah dikaji sebelumnya. Beberapa primer manusia sama dengan simpanse, primer sapi dengan
domba, primer paus dengan paus-paus lainya. Batasnya belum diketahui secara pasti, namun mungkin tidak terlalu jauh, mengingat mikrosatelit diharapkan berada pada tempat yang belum dikode yang terjadi secara cepat.
PEMBAHASAN
Kegiatan seleksi dalam pemuliaan secara konvensional hanya didasarkan pada pengamatan fenotip yang dibantu dengan pendugaan menggunakan metode statistik yang tepat. Beberapa masalah yang sering muncul dalam pemuliaan secara konvensional seperti yang dicantumkan dalam jurnal Azrai, (2005) adalah: (1) Memerlukan waktu yang cukup lama, (2) Sulit memilih dengan tepat gen-gen yang menjadi target seleksi untuk diekspresikan pada sifat-sifat morfologi atau agronomi, karena penampilan fenotip tanaman bukan hanya ditentukan oleh komposisi genetik, tetapi juga oleh lingkungan tempat tanaman tersebut tumbuh, (3)Rendahnya frekuensi individu yang berada dalam suatu populasi yang besar sehingga menyulitkan kegiatan seleksi untuk mendapatkan hasil yang valid secara statistik, dan (4) Pautan gen antara sifat yang diinginkan dengan yang tidak diinginkan sulit dipisahkan saat melakukan persilangan.
Penanda molekuler merupakan alat yang sangat baik bagi pemulia dan ahli genetik untuk menganalisis genom tanaman. Sistem ini telah merepolusi bidang pemetaan genetik dan dapat digunakan untuk menjawab pertanyaan-pertanyaan yang berkaitan dengan keragaman genetik, klasifi kasi dan fi logeni dalam pengelolaan plasma nutfah, dan sebagai alat bantu dalam pemuliaan dan seleksi melalui penanda gen. Penanda molekuler juga dapat digunakan untuk pengklonan gen yang difasilitasi oleh Penanda molekuler.
Kegiatan seleksi pada pemuliaan secara konvensional dapat dipercepat jika disinergikan dengan teknologi penanda molekuler yang dikenal dengan nama Marker Assisted
Selection (MAS). Dengan MAS, kegiatan seleksi menjadi
lebih efektif dan efi sien karena seleksi hanya didasarkan pada sifat genetik tanaman, tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan.
Penggunaan penanda molekuler mikrosatelit pada program pemulian tanaman merupakan salah cara untuk mendapatkan kultivar unggul baru, yang berdaya hasil dan berkualitas tinggi pada kondisi lingkungan tertentu (Mayo, 1980; Guzhov, 1989 dalam Azrai, 2005). Kegiatan eksploitasi potensi genetik tanaman semakin gencar setelah dicetuskannya revolusi hijau. Sejak itu, dengan teknik pemulian konvensional, pemulia tanaman
berhasil memperbaiki sifat kualitatif maupun kuantitatif tanaman. Walaupun teknologi pemuliaan konvensional terbukti berhasil meningkatkan produksi tanaman dan mampu memenuhi pangan penduduk bumi sampai saat ini, teknologi tersebut memiliki keterbatasan seiring dengan bertambahnya jumlah penduduk, berkurangnya luas lahan produktif, dan semakin melandainya produktivitas hasil pertanian.
Dengan semakin banyaknya data urutan DNA yang dapat dihasilkan setiap harinya, kecenderungan ini mengarah pada
cross-referencing genes dan genom dengan menggunakan
alat berbasis peta dan urutan DNA. Karena polimorfi sme merupakan batasan utama bagi sebagian besar spesies. Jelaslah, aplikasi yang paling signifi kan dari EST-SSRs adalah untuk pemetaan komparatif, dengan contoh-contoh yang baik pada spesies graminaceous dan leguminous.
Database dari pasangan primer EST-SSR yang memperkuat lokus orthologous antar spesies dan yang didistribusikan secara merata pada padi, genom Medicago dan Arabidopsis
akan sangat bermanfaat bagi pemulia tanaman dan ahli genetika, terutama untuk spesies tanaman minoritas dan
underfunded.
Untuk jangka panjang, perkembangan penanda alel-spesifi k untuk gen yang mengontrol ciri/sifat agronomi sangatlah penting untuk memajukan ilmu pengetahuan dalam bidang pemuliaan tanaman. Dalam konteks ini, penanda gen mikrosatelit merupakan satu kelas penanda yang dapat digunakan, bersama dengan satu nukleotida polimorfi sme dan jenis penanda lain yang mentargetkan polimorfi sme fungsional dalam gen. Pilihan akan sistem penanda yang paling tepat dalam analisis genetik harus segera ditentukan dengan mempertimbangkan: tujuan yang diinginkan, sumber dana yang dimiliki, fasilitas yang tersedia, serta kelebihan dan kekurangan masing-masing tipe penanda. Menurut Ambionet (1998) dalam Azrai, (2005), bahwa keberhasilan penggunaan suatu penanda penyeleksi dalam kegiatan pemuliaan bergantung pada tiga syarat utama yang harus dipenuhi yaitu: (1) Tersedianya peta genetik dengan jumlah penanda polimorfis yang cukup memadai sehingga dapat mengidentifi kasi QTL atau gen-gen mayor target secara akurat, (2) Penanda terkait erat dengan QTL atau gen mayor target pada peta genetik yang sudah dikontruksi, dan (3) Kemampuan menganalisis sejumlah besar tanaman secara efektif.
Analisis Komparatif Penanda-Penanda Gen dan Genom Mikrosatelit
Analisis komparatif pada genom mikrosatelit dan gen mikrosatelit sama-sama menguntungkan, karena
polimorfi sme yang lebih rendah, EST-SSRs tidak seefi sien genom SSRs untuk membedakan genotip yang erat kekerabatannya. Lebih lanjut, perkembangan gen SSRs terbatas pada spesies yang memiliki data urutan yang cukup (untuk ESTs atau gen) karena SSRs hanya ada antara 2% sampai 5% dari unigenes yang diuji. Namun begitu, penanda EST-SSR yang dikembangkan untuk spesies tertentu berhasil dipakai dalam spesies yang terkait untuk berbagai tujuan, termasuk fi ngerprinting atau studi mengenai perbedaan, pemetaan komparatif dan penyeleksian dengan bantuan penanda gen SSR dan penanda genom SSR cenderung menjadi komplementer untuk pemetaan genom dengan gen mikrosatelit yang kurang bersifat polimorfi k tapi terpusat pada daerah yang kaya akan gen. Untuk menilai perbedaan fungsional, gen SSR memang sangat berguna, karena polimorfi sme yang lebih tinggi, genom SSRs cukup unggul untuk studi fi ngerprinting atau studi identifi kasi variasi.
Penanda Simple Sequence Repeats (SSRs) atau mikrosatelit, merupakan penanda molekuler yang dapat digunakan untuk mempelajari variasi genetik tanaman yang kedepannya sangat berguna untuk pengembangan pengetahuan dalam bidang pemuliaan tanaman. Semuanya telah dikembangkan dan dipetakan pada beberapa spesies tanaman dan terbukti bermanfaat dalam penyeleksian dengan penanda tersebut, karena penanda mikrosatelit berada pada tingkat gen yang bertanggung jawab terhadap ciri/sifat fenotip.
KEPUSTAKAAN
Azrai M, 2005. Pemanfaatan Markah Molekuler dalam Proses Seleksi Pemuliaan Tanaman. Jurnal AgroBiogen 1(1): 26–37.
Gupta PK, and RK Varshney, 2000. The Development and Use of Microsatellite Markers for Genetic Analysis and Plant Breeding with Emphasis on Bread Wheat. Euphytica 113: 163–185.
Park YJ, Lee JL, and Kim NS, 2009. Simple Sequence Repeat Polymorphisms (SSRPs) for Evaluation of Moleculer Diversity and Germplasm Classifi cation of Minor Crops. Molecules 14: 4546–4569.
Rita RC, A Yunus, E Purwanto, 2004. Analisis Keragaman Genetik Beberapa Varietas Kedelai. Jurnal Agrosain 6 (2): 96–104.
Rudd S, 2003. Expressed Sequence Tags Alternative or Complement to Whole Genome Sequences. Trend Plant Sel. 8: 321–329.
Varshney RK, A Graner, ME Sorrells, 2005. Genic Microsatellite Markers in Plants: Feature and Applications. Trends in Biotechnology 23 (1): 48–56.
Weising K, H Nybon, K Wolft and W Meyer, 1995. DNA Finger Printing in Plants and Fungi. CRC Press.London. 175–201.
Yunus A, 2007a. Studi Morfologi dan Isozim Jarak Pagar Sebagai Bahan Baku energi Terbarukan Di Jawa Tengah. Jurnal Enviro. 9 (1): 73–82.
Yunus A. 2007b. Identifi kasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) di Jawa Tengah Berdasarkan Penanda Isozim, Jurnal Biodiversitas 8 (3): 249–252.
Yunus A, Parjanto E, Yuniastuti, DW, Djohar, SJ Fajarwati, 2008. Chromosome Analysis of Jarak Pagar (Jatropha curcas L.). Asia Pacifi c Conference II on Art, Science, Engineering,and Technology.
