i KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, berkat karunia serta nikamat kesehatan yang telah diberikan sehingga buku ini dapat diselesaikan. Ucapan terimakasih disampaikan buat tim kerja Rizkito Bay Halimu,S.Pi dan Febripikar Lakoro S.Pi telah bersama sama turut merampungkan isi buku ini. Buku ini mengulas hasil penelitian tentang kandungan tanin dan flavonoid yang terdapat pada buah, batang dan daun tumbuhan manggrove (Sonneratia alba) melalui proses ekstraksi. Tumbuhan ini banyak diperoleh di habitat pesisir Kabupaten Gorontalo Utara. Informasi yang diperoeh pada buku ini semoga dapat bermanfaat bagi masyarakat khususnya mahasiswa, peneliti sebagai sumber komponen bioaktif.
ii DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ... i
DAFTAR ISI ... ii
DAFTAR GAMBAR ... Error! Bookmark not defined. DAFTAR TABEL ... Error! Bookmark not defined. BAB IMENGENAL TUMBUHAN MANGROVE ... 1
1.1 Klasifikasi dan Morfologi Mangrove S.alba ... 1
2.1Habitat Mangrove dan Karateristik Biologi S.alba ... 3
BAB IIMANFAAT MANGGROVE S.alba ... 6
BAB IIISENYAWA BIOAKTIF MANGGROVE ... 9
3.1 Potensi Senyawa Aktif Mangrove... 9
3.2 Senyawa Tanin ... 10
3.3 Senyawa Flavonoid ... 12
BAB IVTEKNIK EKSTRAKSI... 15
4.1 Ekstraksi Senyawa Tanin ... 15
4.2 Ekstraksi Senyawa Vlavonoid ... 24
BAB VKANDUNGAN BIOAKTIF MANGGROVE S.alba ... 28
1 BAB I
MENGENAL TUMBUHAN MANGROVE
1.1 Klasifikasi dan Morfologi Mangrove S.alba
Indonesia merupakan negara kepulauan yang terdiri dari 17.000 pulau dengan luas laut sekitar 5,8 juta km2 dan bentangan garis pantai sepanjang 81.000 km (NCB, 2012). Sebagian besar pulau tersebut merupakan pulau-pulau kecil yang tersebar di seluruh wilayah Indonesia. Pulau-pulau kecil merupakan ekosistem pesisir yang memiliki keunikan dan sumberdaya alam yang beragam salah satunya yaitu hutan mangrove. Dalam tiga dekade belakangan ini telah terjadi penurunan secara drastis luas kawasan hutan mangrove di Indonesia dari seluas 4,25 juta ha menjadi 3,7 juta ha, dan bahkan hanya sekitar 2,1 juta ha dalam keadaan utuh (Susmianto dan Anwar, 2014).
Pesisir pantai Indonesia banyak terdapat tanaman mangrove. Hutan mangrove tumbuh subur dan luas di daerah aliran sungai yang besar dengan muara yang lebar. Sonneratia alba merupakan salah satu jenis tanaman mangrove yang tumbuh pada lapisan kedua setelah Rhizophora, S.albaini tumbuh pada substrat dari kombinasi antara batu, lumpur dan pasir dengan kedalaman berkisar antara 18-22 cm (Katili, 2009). Suhu tempat hidup S.albaberkisar 24,4 – 27,9oC dan kelembaban udara sekitar 80 – 95 % (Onrizal, 2009). Derajat keasaman (pH) tanah pada tegakan S.alba berkisar antara 6-7. Faktor lingkungan yang mempengaruhi
2 Mangrove merupakan tumbuhan yang hidup di daerah antara level pasang naik tertinggi sampai level di sekitar atau di atas permukaan laut rata-rata. Komunitas (tumbuhan) hutan mangrove hidup di daerah pantai terlindung daerah tropis dan subtropis. Hampir 75% tumbuhan mangrove hidup antara 35oLU-35oLS dan terbanyak terdapat di kawasan Asia Tenggara, seperti Malaysia dan Indonesia yang mempunyai curah hujan tinggi dan bukan musiman (Supriharyono, 2009
dalam Iman, 2014). Menurut Fatiqin (2015), mangrove adalah tipe hutan yang khas dan terdapat di daerah pantai tempat pertemuan muara daratan dan lautan.
Tumbuhan mangrove memiliki kemampuan khusus untuk beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang ekstrim, seperti kondisi tanah yang tergenang, kadar garam yang tinggi serta kondisi tanah yang kurang stabil. Dengan kondisi lingkungan seperti itu, beberapa jenis mangrove mengembangkan mekanisme yang memungkinkan secara aktif mengeluarkan garam dari jaringan, sementara yang lainnya mengembangkan sistem akar napas untuk membantu memperoleh oksigen bagi sistem perakarannya (Noor, 2012).
Mangrove memiliki beberapa fungsi diantaranya yaitu tempat pembangunan lahan, pengendapan lumpur, habitat fauna terutama fauna laut, lahan pertanian dan kolam garam, melindungi ekosistem pantai secara global, keindahan bentang darat, tempat pendidikan dan pelatihan. Berdasarkan beberapa fungsi yang ada, dapat dikatakan mangrove sangat bermanfaat bagi masyarakat sekitar, masyarakat luas serta fauna laut (Puspayanti, 2013).
Jenis mangrove Sonneratia yang sering dijumpai adalah S.alba dan
S.caseolaris dan umumnya pohon ini tinnginya mencapai 15 m. Bentuk daun pada
Sonneratia berbentuk bulat dan berpasangan pada cabangnya, dengan panjang sekitar 7 cm. Pada bagian ujung daun agak melengkung ke bawah (Bengen, 2002
3 menggantung. Formasinya sendiri-sendiri dengan daun mahkota berjumlah 10-14 berwarna putih dan coklat jika sudah tua dengan panjang 13-16 mm. Kelopak bunga berjumlah 10-14 dengan warna merah muda hingga merah dan panjangnya berkisar antara 30-50 mm, bentuk buah yang khas yaitu buah melingkar spiral, bundar melingkar dengan panjang antara 2-2,5 cm. Hipokotil lurus, tumpul dan berwarna hijau tua keunguan. Panjang hipokotil antara 12-30 cm dan diameternya 1,5 – 2 cm. (Pursetyo, 2013).
2.1 Habitat Mangrove dan Karateristik Biologi S.alba
Mangrove adalah tumbuhan halofit yang hidup di sepanjang areal pantai yang dipengaruhi oleh pasang tertinggi sampai daerah mendekati ketinggian rata-rata air laut yang tumbuh di daerah tropis dan sub-tropis (Aksornkoae, 1993
dalam Oktavianus, 2013). Dengan demikian secara ringkas hutan mangrove dapat didefinisikan sebagai suatu tipe hutan yang tumbuh di daerah pasang surut (terutama di pantai yang terlindung, laguna, muara sungai) yang tergenang pada saat pasang dan bebas dari genangan pada saat surut yang komunitas tumbuhannya bertoleransi terhadap garam (Oktavianus, 2013).
Berdasarkan zonasi mangrove, jenis S. alba mendominasi areal yang benar-benar dipengaruhi oleh air laut. Dimana jenis ini tidak toleran terhadap air tawar dalam periode yang lama. S. alba yang memiliki komposisi floristik dari komunitas di zona terbuka ini sangat bergantung pada jenis substrat yang ada, dimana substrat yang dibutuhkan oleh jenis ini adalah cendrung pada daerah tanah yang bercampur lumpur dan pasir. Selain itu, jenis mangrove S. alba Sering ditemukan di lokasi pesisir yang terlindung dari hempasan gelombang, juga di muara dan sekitar pulau-pulau lepas pantai (Noor, 2012).
4 (pneumatophore) sehingga pada vegetasinya mangrove jenis ini termasuk dalam vegetasi mangrove inti. S. alba sering dijumpai tumbuh bersama dengan
Sonneratia caseolaris, sehingga sulit dibedakan. Salah satu yang membedakan adalah bunganya. Secara umum tumbuhan mangrove tumbuh subur di daerah estuari dengan salinitas 10-30 ppt. Namun beberapa dapat tumbuh dengan salinitas tinggi seperti Sonneratia sp. yang dapat hidup hingga salinitas 44 ppt. Sedangkan suhu yang dibutuhkan tumbuhan mangrove ini adalah 28-30oC (Saparinto, 2007
dalam Kurniaji, 2014).
Klasifikasi tumbuhan mangrove (S. alba) menurut Ruslia (2006) dalam
Kurniaji (2014) sebagai berikut: Kingdom : Plantae
Phyllum : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Order : Myrtales Family : Sonneratiaceae Genus : Sonneratia
5 Gambar 1. Manggrove Sonneratia alba
Sumber : Dokumentasi Pribadi
Menurut Tjitrosoepomo (2009), S.alba memiliki kulit kayu berwarna putih hingga coklat. Akar berbentuk kabel di bawah tanah dan muncul ke permukaan sebagai akar nafas yang berbentuk kerucut tumpul dan tingginya mencapai 25 cm. Daun S.alba berbentuk bulat ukuran panjang 5-10 cm. Bunga biseksual; gagang bunga tumpul panjangnya 1 cm; terletak di ujung atau pada cabang kecil. Buah
6 BAB II
MANFAAT MANGGROVE S.alba
Mangrove memiliki beberapa fungsi diantaranya yaitu tempat pembangunan lahan, pengendapan lumpur, habitat fauna terutama fauna laut, lahan pertanian dan kolam garam, melindungi ekosistem pantai secara global, keindahan bentang darat, tempat pendidikan dan pelatihan. Berdasarkan beberapa fungsi yang ada, dapat dikatakan mangrove sangat bermanfaat bagi masyarakat sekitar, masyarakat luas serta fauna laut (Puspayanti, 2013).
Tumbuhan mangrove terdiri dari buah, daun dan batang. Buah dari jenis mangrove ini telah dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai tepung yang akan digunakan untuk produk olahan makanan. Dalam pembuatan tepung, buah mangrove tersebut harus direbus terlebih dahulu karena pada buah tersebut mengandung senyawa tanin yang dapat menyebabkan rasa sepat pada tepung (Perdana, 2012). Pemanfaatan daun mangrove jenis S.alba hanya menjadi pakan ternak dan batang mangrove hanya untuk dimanfaatkan sebagai tiang dalam pembuatan rumah, tangga dan kayu bakar untuk dibuat arang tanpa menggunakan kulitnya. Kulit batang mangrove S.alba dianggap sebagai limbah yang tak berguna dan belum dimanfaatkan hanya sebagian kecil saja digunakan untuk bahan bakar (Hamidah, 2006).
7 antioksidan, sehingga sangat baik untuk pencegahan kanker. Manfaat lain flavonoid antaranya melindungi struktur sel, meningkatkan efektifitas Vitamin C, anti inflamasi, mencegah keropos tulang, dan sebagai Antibiotik. Pernyataan ini didukung berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Santi dan Sukada (2015) tentang aktivitas antioksidan flavonoid dari kulit batang gayam (Inocaprus fagiferus).
Flavonoid dalam tubuh manusia berfungsi sebagai antioksidan, sehingga sangat baik untuk pencegahan kanker. Manfaat lain flavonoid antaranya melindungi struktur sel, meningkatkan efektifitas Vitamin C, anti inflamasi, mencegah keropos tulang, dan sebagai Antibiotik (Herawati, 2011). Menurut Shah dan Hossain (2014), flavonoid dapat melindungi membran lipid dari oksidasi.
Flavonoid juga berperan secara langsung sebagai antibiotik dengan mengganggu fungsi dari mikroorganisme seperti bakteri atau virus. Menurut Jawetz et al (2001) dalam Darminto dkk (2009), pertumbuhan bakteri yang terhambat atau kematian bakteri akibat suatu zat antibakteri dapat disebabkan oleh penghambatan terhadap sintesis dinding sel, penghambatan terhadap fungsi membran sel, penghambatan terhadap sintesis protein, atau penghambatan terhadap sintesis asam nukleat. Hal ini didukung oleh hasil penelitian Dewi dkk (2014) yang menunjukan bahwa, flavonoid dari ekstrak etanol biji terong belanda (Solanum betaceum) memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 1.162,60 ppm dalam menghambat reaksi peroksidasi lemak pada plasma darah tikus wistar. Selanjutnya hasil penelitian dari Sukadana (2010) menunjukkan bahwa, flavonoid dari akar awar-awar (Ficus septica) mempunyai aktivitas sebagai antibakteri terhadap
8
Density Lipoproteins (LDL) dengan cara menangkap radikal bebas dan menghelat ion logam transisi (Waji dan Sugrani, 2009).
Flavonoid dalam tubuh manusia berfungsi sebagai antioksidan, sehingga sangat baik untuk pencegahan kanker. Manfaat lain flavonoid antaranya melindungi struktur sel, meningkatkan efektifitas Vitamin C, anti inflamasi, mencegah keropos tulang, dan sebagai Antibiotik (Herawati, 2011). Menurut Shah dan Hossain (2014), flavonoid dapat melindungi membran lipid dari oksidasi.
Flavonoid juga berperan secara langsung sebagai antibiotik dengan mengganggu fungsi dari mikroorganisme seperti bakteri atau virus. Menurut Jawetz et al (2001) dalam Darminto dkk (2009), pertumbuhan bakteri yang terhambat atau kematian bakteri akibat suatu zat antibakteri dapat disebabkan oleh penghambatan terhadap sintesis dinding sel, penghambatan terhadap fungsi membran sel, penghambatan terhadap sintesis protein, atau penghambatan terhadap sintesis asam nukleat. Hal ini didukung oleh hasil penelitian Dewi dkk (2014) yang menunjukan bahwa, flavonoid dari ekstrak etanol biji terong belanda (Solanum betaceum) memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 1.162,60 ppm dalam menghambat reaksi peroksidasi lemak pada plasma darah tikus wistar. Selanjutnya hasil penelitian dari Sukadana (2010) menunjukkan bahwa, flavonoid dari akar awar-awar (Ficus septica) mempunyai aktivitas sebagai antibakteri terhadap
9 BAB III
SENYAWA BIOAKTIF MANGGROVE 3.1 Potensi Senyawa Aktif Mangrove
Potensi senyawa metabolit sekunder pada tumbuhan mangrove sangat beragam. Senyawa metabolit sekunder yang sering ditemukan pada tumbuhan mangrove yaitu alkaloid, tannin, flavonoid, steroid, fenolat dan terpenoid. Senyawa-senyawa bahan alam ini digolongkan berdasarkan empat kriteria yang berbeda yaitu; struktur kimia, keaktifan fisiologis, taksonomi dan biogenesis (Harborne, 1987 dalam Ummah, 2010). Jika ditinjau secara umum, tanaman mangrove merupakan tumbuhan yang kaya akan senyawa bioaktif. Menurut Bandaranayake (2002) dalam Herawati (2011), metabolit sekunder yang ditemukan pada tumbuhan mengrove meliputi senyawa golongan alkaloid, tannin, fenolat, steroid, flavonoid, dan terpenoid. Hasil penelitian Darminto dkk (2009), tentang identifikasi metabolit sekunder pada jenis mangrove avicennia sp menunjukkan adanya kandungan golongan senyawa metabolit sekunder alkaloid, terpenoid, steroid dan flavonoid pada tumbuhan mangrove.
10 3.2 Senyawa Tanin
Tanin adalah nama umum untuk satu kelompok subtansi fenolik polimer yang mampu menyamak kulit atau mempresipitasi gelatin dari cairan, suatu sifat yang dikenal dengan astringent. Tanin terbentuk dari senyawa fenol yang berikatan atau bergabung dengan senyawa fenol-fenol yang lain sehingga membentuk polifenol dan akhirnya membentuk senyawa tanin (Pansera, 2004).
Senyawa tanin merupakan zat organik yang sangat kompleks dan terdiri dari senyawa fenolik. Istilah tanin pertama sekali diaplikasikan pada tahun 1796 oleh Seguil. Tanin terdiri dari sekelompok zat-zat kompleks terdapat secara meluas dalam dunia tumbuh-tumbuhan berpembuluh, antara lain terdapat pada bagian kulit kayu, batang, daun dan buah-buahan.
Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, tanin dapat bereaksi dengan protein membentuk polimer yang tidak larut dalam air. Tanin merupakan senyawa metabolit sekunder yang berasal dari tumbuhan yang terpisah dari protein dan enzim sitoplasma. Senyawa tanin tidak larut dalam pelarut non polar, seperti eter, kloroform dan benzena tetapi mudah larut dalam air, dioksan, aseton dan alkohol serta sedikit atau bahkan tidak larut dalam etil asetat (Harborne, 1987
11 Gambar 1. Struktur Tanin
Sumber: Harborne (1987)
Secara struktural tanin adalah suatu senyawa fenol yang memiliki berat molekul besar yang terdiri dari gugus hidroksi dan beberapa gugus yang bersangkutan seperti karboksil untuk membentuk kompleks kuat yang efektif dengan protein dan beberapa makromolekul (Horvartrf, 1981). Sebagai salah satu tipe dari senyawa metabolit sekunder, tanin mempunyai karakteristik sebagai berikut (Giner-Chavez, 2001):
-Senyawa oligomer dengan satuan struktur yang bermacam-macam dengan gugus fenol bebas
-Berat molekul 500-20.000
-Larut dalam air, dengan pengecualian beberapa struktur yang mempunyai berat molekul besar
-Mampu berikatan dengan protein dan terbentuk kompleks tanin-protein yang larut dan tidak larut.
12 terhidrolisis mengandung ikatan ester yang dapat terhidrolisis jika di didihkan dalam asam klorida encer. Bagian alkohol dari ester ini biasanya berupa gula yaitu glukosa. Tanin terhidrolisis biasanya berupa senyawa amorf, higroskopis, berwarna coklat kuning yang larut dalam air membentuk larutan koloid, tanin mudah diperoleh dalam bentuk kristal. Tanin terhidrolisis juga larut dalam pelarut organik yang polar tetapi tidak larut dalam pelarut organik non polar misalnya kloroform dan benzena (Robinson,1995 dalam Ummah, 2010).
3.3 Senyawa Flavonoid
Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol terbesar yang ditemukan di alam. Menurut Waji dan Sugrani (2009) senyawa-senyawa fenol ini merupakan zat warna merah, ungu dan biru, dan sebagian zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoid mempunyai kerangka besar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantai propena (C3) sehingga membentuk suatu susunan C6-C3-C6. (Markham, 1988
dalam Hanifa dkk, 2015).
Gambar 2. Struktur Dasar Flavonoid Sumber : Hanifa (2015)
A
B
C
Rantai Propena Cincin Benzene
13
Istilah “Flavonoid” yang diberikan untuk senyawa-senyawa fenol ini berasal dari kata flavon, yakni nama dari salah satu jenis flavonoid terbesar jumlahnya dan juga lazim ditemukan (Waji dan Sugrani, 2009). Flavonoid terdiri dari beberapa sub kelas seperti flavone, flavonol, flavanonol, flavanon, flavan dan anthocyanin. Flavonon ditemukan pada famili jeruk. Biasanya mengandung gula yang berkontribusi pada karakteristik flavor. Flavone umumnya ditemukan pada daun, sedangkan isoflavon seringkali ditemukan pada kacang-kacangan (legume) terutama kacang kedelai. Isoflavon berbeda dengan flavon hanya pada penempatan cincin benzene. Isoflavon umumnya dikenal karena aktivitas estrogeniknya. Seperti halnya flavanon, flavonol umumnya juga mengandung gula. Flavonoid yang paling mudah ditemukan (ubiquitious) dalam makanan adalah kuersetin yang termasuk dalam kelas flavonol. Flavan adalah flavonoid yang mempunyai struktur kimia paling kompleks. Beberapa flavonoid yang termasuk dalam kelas flavan adalah
catechin, procyanidin, theaflavin dan flavonoid polimerik lainnya seperti
14 Gambar 3 Struktur Sub Kelas Flavonoid
Sumber : Gafur dkk (2014)
Flavonoid termasuk senyawa fenol alam yang terdapat di hampir semua tumbuhan. Menurut Rahmat (2009), flavonoid terdapat pada seluruh bagian tanaman, termasuk buah, tepung sari, dan akar. Namun, menurut Waji dan Sugrani (2009) senyawa-senyawa flavonoid terdapat pada semua bagian tumbuhan tinggi, seperti bunga, daun, ranting, buah, kayu, kulit kayu dan akar. Akan tetapi, senyawa tertentu seringkali terkonsentrasi dalam suatu jaringan tertentu, misalnya
antoisianidin adalah zat warna dari bunga, buah dan daun. Pada umumnya flavonoid di alam ditemukan dalam bentuk glikosida, dimana unit flavonoid terikat pada suatu gula (Herawati, 2011). Flavonoid merupakan senyawa polar karena memiliki sejumlah gugus hidroksil yang tidak tersubstitusi. Pelarut polar seperti etanol, metanol, etilasetat, atau campuran dari pelarut tersebut dapat digunakan untuk mengekstrak flavonoid dari jaringan tumbuhan (Rijke, 2005 dalam Hanifa
15 BAB IV
TEKNIK EKSTRAKSI 4.1 Ekstraksi Senyawa Tanin
Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan kelarutannya terhadap dua cairan tidak saling larut yang berbeda. Prinsip ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non polar dalam senyawa non polar. Secara umum ekstraksi dilakukan secara berturut-turut mulai dengan pelarut non polar lalu pelarut yang kepolarannya menengah kemudian pelarut yang bersifat polar (Harborne, 1987). Ekstraksi digolongkan ke dalam dua bagian besar berdasarkan bentuk fase yang diekstraksi yaitu ekstraksi cair-cair dan ekstraksi cair padat, ekstraksi cair padat terdiri dari beberapa cara yaitu maserasi,
perkolasi dan ekstraksi sinambung (Sa’adah, 2010).
16 oksidator akan bereaksi terlebih dahulu dengan asam askorbat yang lebih mudah teroksidasi (Abdurrohman, 1998).
Ekstrak tanin terdiri dari campuran senyawa polifenol sangat kompleks. Ekstraksi tanin dapat dilakukan dengan beberapa pelarut, antara lain pelarut polar yaitu air, aseton dan metanol (Robinson, 1995:75). Metanol merupakan pelarut yang baik untuk tanin. Sedangkan aseton merupakan pelarut yang lebih disukai dibanding air karena lebih dapat berinteraksi dengan tanin yang dapat dihidrolisis. Etil asetat juga dapat digunakan sebagai pelarut karena dapat digunakan untuk memindahkan komponen non tanin dari ekstrak kasar tanin dan kelemahannya dapat menghilangkan beberapa kadar tanin yang dapat dihidrolisis (Harborne, 1987
dalam Kristanto, 2013).
Dalam metode ekstraksi bahan alam, dikenal suatu metode maserasi. Maserasi merupakan metode ekstraksi yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam sampel dalam pelarut organik. Pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif sehingga zat aktif akan larut. Adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Keuntungan metode ekstraksi ini, adalah metode dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan (Cheong, et al, 2005).
17 temperatur ruangan, sehingga zat-zat yang terkandung di dalam simplisia relatif lebih aman jika dibandingkan dengan penggunaan ekstraksi panas (Cristina, 2008).
Metode maserasi adalah cara ekstraksi yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam pelarut. Pelarut akan menembus dinding sel dan masuk kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif sehingga zat aktif akan larut, karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan dengan zat aktif di dalam sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Pelarut yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain. Keuntungan cara ekstraksi ini, adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Kerugian penggunaan metode ini adalah waktu pengerjaannya lama (Ahmad, 2006).
Maserasi merupakan salah satu metode ektraksi bahan alam yang menggunakan lemak panas, akan tetapi lemak-lemak panas itu telah diganti dengan pelarut-pelarut organik yang mudah menguap. Penekanan utama pada maserasi adalah tersedianya waktu kontak yang cukup antara pelarut dan jaringan yang diekstraksi (Guether, 1987).
18 Jenis-Jenis Pelarut Ekstraksi
1. Metanol
Metanol sering disebut metil alkohol, mempunyai rumus kimia CH3OH. Metanol merupakan cairan polar yang dapat bercampur dengan air, alkohol-alkohol lain seperti, ester, keton, eter, dan sebagian besar pelarut organik. Metanol sedikit larut dalam lemak dan minyak. Titik didih metanol berada pada 64,7oC dengan panas pembentukan (cairan) -239,03 kJ/mol pada suhu25oC. Metanol mempunyai panas fusi 103 J/g dan panas pembakaran pada 25oC sebesar 22,662 J/g. Tegangan permukaan metanol adalah 22,1 dyne/cm sedangkan panas jenis uapnya pada 25oC sebesar 1,370 J/(gK) dan panas jenis cairannya pada suhu yang sama adalah 2,533J/(gK) (Marduansyah, 2013). Menurut sejarahnya, metanol disebut alkohol kayu (Fessenden dan Fessenden, 1997). Hasil penelitian Akroum et al. (2009) tentang aktifitas antimikrobia beberapa ekstrak tanaman, menunjukkan bahwa pelarut metanol merupakan pengekstrak yang baik untuk mengekstrak senyawa antimikroba pada tumbuhan teh (Widiati,2011).
19 2. Aseton
Aseton adalah senyawa berbentuk cairan yang tidak berwarna dan mudah terbakar, digunakan untuk membuat plastik, serat, obat-obatan dan senyawa-senyawa kimia lainnya. Selain dimanufaktur secara industri, aseton juga dapat ditemukan secara alami, termasuk pada tubuh manusia dalam kandungan kecil. Aseton memiliki gugus karbonil yang mempunyai ikatan rangkap dua
karbon-oksigen terdiri atas satu ikatan σ dan satu ikatan π.
3. Air
Air merupakan pelarut yang baik untuk senyawa ion seperti garam, karena daya tarik antara komponen ion dari molekul dan dipolar air cukup untuk mengatasi tarikan antara ion-ion itu sendiri. Senyawa polar non-ion, seperti gula dan alkohol sederhana juga sangat larut dalam air. Gugusan fungsional polar seperti gugus hidroksil, dari senyawa non-ionik dengan mudah mengikat hidrogen dengan molekul air. Sifat fisik air berbeda sekali dari pelarut lain.
20 4. Etil Asetat
Etil asetat merupakan senyawa organik berwujud cair, tidak berwarna dan titik didih 770C, indeks bias 1,372, berbau wangi (aroma), mudah menguap. Etil asetat dibuat melalui reaksi esterifikasi senyawa asam asetat dengan methanol pada asam dan dipanaskan (Abraham, 2007 ). Senyawa ini sering disingkat EtOAc, dengan Et mewakili gugus etil dan OAc mewakili asetat. Etil asetat diproduksi dalam skala besar sebagai pelarut. Etil asetat adalah pelarut polar menengah yang volatile (mudah menguap), tidak beracun, dan tidak higroskopis. Etil asetat merupakan penerima ikatan hidrogen yang lemah, dan bukan suatu donor ikatan hidrogen karena tidak adanya proton yang bersifat asam (yaitu hidrogen yang terikat pada atom elektronegatif seperti flor, oksigen, dan nitrogen. Etil asetat dapat melarutkan air hingga 3%, dan larut dalam air hingga kelarutan 8% pada suhu kamar. Kelarutannya meningkat pada suhu yang lebih tinggi. Namun demikian, senyawa ini tidak stabil dalam air yang mengandung basa atau asam.
4.1.1 Identifikasi Senyawa Tanin
A. Identifikasi dengan Uji Fitokimia
21 dipanaskan di atas pemanas air lalu diteteskan dengan larutan gelatin (1:1). Hasil positifnya yaitu terbentuknya endapan putih.
Tanin terhidrolisis dan terkondensasi menunjukkan reaksi yang berbeda dalam larutan garam Fe III, tanin terkondensasi meghasilkan warna hijau kehitaman sedangkan tanin terhidrolisis menghasilkan warna biru kehitaman. (Widowati, 2006).
B. Identifikasi dengan Kromatografi
22 Untuk mengetahui karakteristik ekstrak, maka identifikasi dilakukan dengan cara pengamatan secara visual meliputi bentuk, warna, aroma dan rasa ekstrak, juga terhadap kadar airnya. Sedangkan analisa ekstrak secara KLT dilakukan menurut metode Harborne yang telah dimodifikasi, dengan meggunakan eluen toluen : etil asetat (3:1) dengan media silika gel 60 GF 254 dan untuk pendeteksi menggunakan ferri Sulfat, dari hasil pengamatan terhadap hasil KLT dari ekstrak jambu biji diketahui bahwa ketiga tipe daun jambu biji mempunyai jumlah bercak yang berbeda.
4.1.2 Penentuan Kadar Tanin
A. Penentuan Kadar Tanin dengan Metode Lowenthal-Procter
Prinsip penentuan kadar tanin dengan metode Lowenthal-Procter
berdasarkan jumlah gugus fenol pada tanin. Tanin termasuk golongan senyawa yang memiliki gugus fenol, sehingga jumlah gugus fenol ini diasumsikan mewakili jumlah tanin secara keseluruhan. Titrasi dengan larutan kalium permanganat, gugus fenol pada tanin akan teroksidasi. Jumlah gugus fenol berbanding lurus dengan jumlah kalium permanganat yang diperlukan untuk titrasi. Sebagai indikator redoks digunakan larutan indigokarmin dan warna yang dihasilkan adalah kuning emas. Penentuan kadar tanin dengan menggunakan persamaan berikut (Sudarmadji, 1997
23 Kadar Tanin
Keterangan:
Perhitungan : 1 ml KmnO4 0,1 N = 0,00416 g tanin
(A dan B) : Banyaknya KmnO4 yang diperlukan untuk titrasi (A merupakan senyawa tanin dan B merupakan senyawa non tanin)
S : Berat sampel
B. Penentuan Kadar Tanin dengan Metode Stiansy test
24 4.2 Ekstraksi Senyawa Vlavonoid
Ekstraksi Metode Maserasi
Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar). Maserasi bertujuan untuk menarik zat-zat berkhasiat yang tahan
pemanasan maupun yang tidak tahan pemanasan. Secara teknologi maserasi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi
pada keseimbangan (Voight, 1995 dalam Istiqomah, 2013). Menurut Yuliatiningrum (2008) dalam Wibisono (2012), simplisia adalah bahan
baku alamiah yang digunakan untuk membuat ramuan obat yang belum mengalami pengolahan atau dapat juga telah melalui proses pengeringan. Simplisia dapat berupa tumbuhan, hewani dan simplisia mineral. Penggunaan pelarut sangat berpengaruh untuk mendapatkan senyawa yang diinginkan. Pernyataan ini didukung oleh Sucianti dkk. (2012), penggunaan pelarut dalam metode ekstraksi maserasi didasarkan pada tingkat kepolaran masing-masing pelarut, yakni polar, semi polar dan pelarut non polar. Dari pernyataan diatas maka pemilihan pelarut sangat penting untuk menarik lebih banyak jumlah metabolit sekunder. Suryanto dan Wehantouw (2009), menunjukkan bahwa pelarut metanol mampu menarik lebih banyak jumlah metabolit sekunder yaitu senyawa fenolik, flavonoid, dan tanin dalam daun Artocarpus altilis bila dibandingkan dengan pelarut etanol. 4.2.1 Identifikasi Senyawa Flavonoid
A. Metode Fitokimia
25 terutama kandungan metabolit sekunder yang merupakan senyawa bioaktif seperti alkanoid, flavonoid, tannin, antrakuinon dan glikosa (Harborne,J.B., 1987 dalam
Wachidah, 2013). Menurut Sangi, dkk (2008), analisis fitokimia secara kualitatif ini merupakan suatu metode analisis awal untuk meneliti kandungan senyawa aktif yang ada pada tumbuhan obat dan diharapkan hasilnya dapat memberikan informasi dalam mencari senyawa dengan efek farmakologi tertentu sehingga dapat membantu dalam penemuan obat baru.
B. Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Teknik kromatografi yang paling umum untuk analisis pendahuluan ekstrak tumbuhan untuk menguji adanya flavonoid adalah kromatografi kertas. Namun analisis dengan KLT memiliki beberapa keunggulan dibandingkan dengan kromatografi kertas, diantaranya kesebangunan dari plat KLT, kecepatan saat proses migrasi, serta sensitivitasnya sehingga dengan sampel yang sedikit sudah mampu memberikan hasil yang baik (K.R. Markham, 1988 dalam Pambudi dkk, 2014).
26 4.2.2 Uji Kadar Flavonoid Kolorimetri Komplementer
A. Metode Alumunium Klorida
Penentuan konsentrasi flavonoid dari ekstak buah, daun, dan kulit batang dilakukan dengan metode kolorimetri AlCl3 yang mempunyai prinsip pengukuran berdasarkan pembentukan warna. Metode ini dapat digunakan untuk menentukan jumlah flavonoid golongan flavon dan flavonol. Prinsip penetapan flavonoid dengan metode kolorimetri AlCl3 adalah terbentuknya kompleks antara AlCl3 dengan gugus keto pada atom C-4 dan juga dengan gugus hidroksi pada atom C-3 atau C-4 yang bertetangga dari flavon dan flavonol. Pada pembuatan kurva kalibrasi digunakan kuersetin sebagai pembanding dimana kuersetin merupakan flavonoid golongan flavonol yang mempunyai gugus keto pada C-4 dan memiliki gugus hidroksi pada atom C-3 atau C-5 yang bertetangga dari flavon dan flavonol (Chang et al, 2002). Metode kolorimetri alumuninum klorida menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis untuk menghitung absorbansi. Menurut Huda (2001), spektrofometer UV-Vis adalah alat yang umum digunakan di laboratorium kimia. Alat ini biasa digunakan untuk analisa kimia semi kualitatif. Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis didasarkan pada fenomena penyerapan sinar oleh spesi kimia tertentu di daerah lembayung (ultra violet) dan sinar tampak (visible). Spektrofotometer UV-tampak atau UV-visibe (UV = 200–400 nm, sedangkan visible = 400–800 nm) berhubungan dengan eksitasi elektronik antara beberapa tingkat energi dari orbital molekul dari sistem senyawa yang dianalisis (Bismo, 2006).
B. Metode 2,4 dinitrofenilhidrazin
28 BAB V
KANDUNGAN BIOAKTIF MANGGROVE S.alba 5.1 Ekstraksi Tanin
Persiapan Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk proses ekstraksi, identifikasi tanin dan penentuan kadar tanin dalam penelitian ini adalah kertas saring, seperangkat alat gelas, corong pisah, rotary evaporator dan buret.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun, buah dan kulit batang mangrove Sonneratia alba yang berdiameter 15cm. Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitiaan ini adalah metanol p.a, kloroform p.a, etil asetat p.a, FeCl3, larutan gelatin, larutan indigokarmin, KmnO4, NaCl.
Prosedur Kerja
29 metode fitokimia dan penentuan kadar tanin menggunakan metode lowenthal-procter.
Preparasi Sampel
Sampel tumbuhan mangrove diambil di Desa langge Kecamatan Anggrek kabupaten Gorontalo Utara. Sampel yang diambil kurang lebih sebanyak 5 kg. Proses preparasi sampel menurut Nuraini, (2002) yaitu:
a. Buah: dicuci dengan air mengalir kemudian dipotong kecil-kecil dan biji buah dipisahkan. Kemudian sampel dikeringkan dengan pengering
mekanik pada suhu 60ºC selama 6 jam, selanjutnya diangin-anginkan dan dihaluskan menggunakan blender sampai menjadi serbuk halus.
b. Daun: dicuci bersih dengan air mengalir kemudian dikeringkan
menggunakan pengering mekanik selama 6 jam pada suhu 60ºC. Sampel yang telah kering diangin-anginkan dan kemudian dihaluskan dengan blender sehingga diperoleh serbuk halus.
c. Kulit batang: dicuci bersih dengan air mengalir kemudian dipotong kecil-kecil dan selanjutnya diangin-anginkan. Kemudian sampel dikeringkan menggunakan pengering mekanik selama 7 jam pada suhu 60ºC. Sampel yang telah kering kemudian dihaluskan dengan blender sehingga
30 Ekstraksi (Metode Maserasi)
Sampel ditimbang sebanyak 250 gram serbuk buah, daun dan kulit batang mangrove S.alba dan direndam menggunakan 1,5 L pelarut metanol didiamkan selama 24 jam kemudiaan disaring. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary evaporator, kemudiaan ekstrak pekat diekstraksi kembali dengan 50 ml kloroform menggunakan corong pisah sehingga terbentuk dua lapisan dan dilakukan pengulangan 3 kali. Lapisan bawah (kloroform) dipisahkan dan lapisan air diekstraksi dengan etil asetat sebanyak 50 ml sehingga terbentuk dua lapisan. Lapisan etil asetat (atas) dipisahkan dan lapisan air (bawah) dipekatkan kembali dengan menggunakan rotary evaporator, sehingga diperoleh ekstrak tanin (Nuraini, 2002).
Identifikasi Tanin Dengan Metode Fitokimia
Uji tanin pada penelitian ini menggunakan FeCl3 dimana ekstrak direaksikan dengan FeCl3. Jika larutan mengandung senyawa tanin akan menghasilkan warna hijau kehitaman atau biru tua (Widowati, 2006).
Penentuan Kadar Tanin Dengan Metode Lowenthal-procter
31 jumlah gugus fenol ini diasumsikan mewakili jumlah tanin secara keseluruhan (Sudarmadji, 1997).
Gambar 6 Prosedur Kerja Prosedur Analisa
Identifikasi Tanin (Metode Fitokimia)
Ekstrak mangrove dari masing-masing sampel diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ekstrak direaksikan dengan 1 ml larutan FeCl3, jika larutan mengandung senyawa tanin akan menghasilkan warna hijau kehitaman atau biru tua (Widowati, 2006).
Pelarut metanol
Analisis Data
(Deskriptif kualitatif dan kuantitatif) Preparasi tumbuhan Mangrove S. alba
(daun, buah dan kulit batang)
Ekstraksi (metode maserasi)
Identifikasi senyawa tanin (metode fitokimia)
32 Uji Kadar Tanin (Metode Lowenthal-Procter)
Prosedur pengujian kadar tanin metode Lowenthal-Procter yaitu sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambah 100 ml aquades, kemudian diambil 50 ml ditambah dengan 2 ml larutan indigokarmin kemudian dititrasi dengan larutan KmnO4 0,1 N sampai warna kuning emas (A ml). Selanjutnya diambil 50 ml ditambah berturut-turut 5 ml larutan gelatin, 10 ml larutan NaCl jenuh, 1 gram serbuk kaolin kemudian dikocok selama beberapa menit dan dicampur dengan larutan indigokarmin sebanyak 2 ml dan selanjutnya titrasi dengan KmnO4 0,1 N (B ml) (Sudarmadji, 2007).
Kadar Tanin Keterangan:
Perhitungan : 1 ml KmnO4 0,1 N = 0,00416 g tanin
(A dan B) : Banyaknya KmnO4 yang diperlukan untuk titrasi (A merupakan senyawa tanin dan B merupakan senyawa non tanin)
S : Berat sampel
33 Hasil Preparasi Sampel Buah, Daun dan Kulit Batang Mangrove S.alba
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah tumbuhan mangrove jenis Sonneratia alba yang terdiri dari buah tanpa biji, daun muda dan kulit batang, karena pada ketiga bagian tumbuhan mangrove mengandung tanin (Akiyama et al, 2001 dalam Risnasari, 2012).
34 dapat menghasilkan mikroorganisme yang dapat merubah komposisi senyawa
kimia yang terkandung pada daun dan buah tersebut) (Sa’adah, 2010).
Berdasarkan hasil pengeringan, terjadi perubahan warna dan tekstur pada buah, daun dan kulit batang. Setelah dikeringkan, buah mangrove S.albayang tadinya berwarna hijau menjadi hijau kecoklatan dan memiliki tekstur yang kering. Daun mangrove setelah dikeringkan menjadi warna coklat dan memiliki tekstur kering. Kulit batang mangrove S.albasetelah dikeringkan tetap memiliki warna yang sama seperti yang sebelum dikeringkan dan memiliki tekstur yang kering dan keras.
Sampel yang telah kering dihaluskan menggunakan blender sehingga menghasilkan serbuk. Penghalusan sampel bertujuan untuk memperluas permukaan serta membantu pemecahan dinding dan membran sel, sehingga mempermudah
35 Pengambilan Sampel
Pemotongan Sampel Pengeringan Sampel
36 Hasil Ekstraksi Senyawa Tanin dari Buah, Daun dan Kulit Batang Mangrove S.alba
Prinsip ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non polar dalam senyawa non polar. Ekstraksi merupakan salah satu cara pemisahan satu atau lebih komponen yang terdapat dalam suatu bahan menggunakan pelarut yang sesuai. Tanin dapat diperoleh dari proses ekstraksi dengan cara maserasi. Maserasi merupakan proses perendaman bahan dalam suatu pelarut, tujuannya untuk mengekstrak senyawa-senyawa aktif yang ada dalam sampel. Proses ekstraksi ini tidak dilakukan dengan metode Soxhletasi karena dikhawatirkan ada golongan senyawa tanin yang tidak tahan panas, selain itu senyawa tanin mudah teroksidasi pada suhu yang tinggi yaitu 98,89-101,67 . Sampel yang digunakan adalah buah, daun dan kulit batang mangrove S.alba yang telah dihaluskan menggunakan blender dan diayak menggunakan ayakan 100mesh.
Masing-masing serbuk buah, daun dan kulit batang mangrove S.alba
37 sempurna (Lenny, 2006). Selain itu metanol mempunyai titik didih yang relatif rendah sehingga mudah diuapkan.
Setelah proses maserasi dilakukan selama 24 jam, sampel buah, daun dan kulit batang mangrove S.alba dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary evaporator pada suhu 30-45 sampai terbentuk ekstrak kental. Tujuan dari evaporasi adalah untuk menguapkan pelarut yaitu metanol sehingga yang tersisa hanya senyawa aktif atau ekstrak kental.Hukmah, (2007) dalam penelitiannya menyebutkan jika sampel tidak dipekatkan terlebih dahulu tidak akan terbentuk dua lapisan setelah difraksinasi dengan kloroform, karena jumlah pelarut masih terlalu banyak sehingga terbentuknya dua fase tidak terlihat. Ekstrak yang diperoleh dari masing-masing bagian tumbuhan mangrove S.alba memiliki warna yang sama. Hasil dari ekstrak buah, daun dan kulit batang mangrove S.alba dapat dilihat pada Gambar 7 berikut.
38 Proses ekstraksi Maserasi
Proses evaporasi
39 Fraksinasi etil asetat buah, daun dan kulit batang angrove
Hasil ekstrak tanin
Tabel 1. Warna dari ekstrak buah, daun dan kulit batang mangrove S.alba
Tumbuhan Mangrove Warna
Buah Coklat kehitaman
Daun Coklat kehitaman
Kulit batang Coklat kehitaman
40 pengambilan senyawa yang bersifat non polar seperti lemak, klorofil, triterpen (Ummah, 2010)
Setelah terbentuk dua lapisan, fase kloroform ditampung dan fase air difraksinasi kembali dengan etil asetat sebanyak 50 ml. Penambahan etil asetat berfungsi untuk mengambil senyawa flavonoid atau polifenol lainnya selain tanin karena tanin sangat sedikit bahkan tidak larut dalam etil asetat. Penambahan etil asetat diulang sebanyak 3 kali untuk memaksimalkan pengambilan senyawa polifenol lainnya yang larut dalam etil asetat. Langkah selanjutnya adalah fase etil asetat ditampung dan fase air dari masing-masing sampeldiambil.
Fase air yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary evaporator pada suhu 30-45°C untuk memisahkan pelarutnya yaitu etil asetat yang terlarut dalam ekstrak dan air, sehingga diperoleh ekstrak tanin. Warna dari masing-masing ekstrak dapat dilihat pada lampiran 3.
Tabel 1 Warna ekstrak tanin dari buah, daun dan kulit batang Mangrove S.alba
Tumbuhan MangroveSonneratia
alba
Warna
Buah Coklat
Daun Coklat
Kulit batang Coklat
41 2010) menyatakan bahwa tanin dapat larutpada pelarut yang bersifat polar dan menghasilkan warna coklat.
4.1Uji Fitokimia Senyawa Tanin
Uji fitokimia merupakanuji kualitatif untuk menduga adanya senyawa tanin pada ekstrak buah, daun dan kulit batang mangrove S.alba. Untuk pengujian fitokimia senyawa tanin terdapat 2 pengujian, yaitu dengan menambahkan larutan FeCl3 dan menggunakan larutan gelatin. Pada penelitian ini uji fitokimia senyawa tanin menggunakan FeCl3, dimana larutan FeCl3 sebanyak 1 ml ditambahkan pada sampel ekstrak buah, daun dan kulit batang mangrove hingga mendapatkan hasil positifnya dengan ditandai terbentuknya warna biru tinta atau hijau kehitaman. Dapat dilihat pada Gambar 8 berikut.
Uji Fitokimia senyawa Tanin
Gambar 8. Uji Fitokimia menggunakan FeCl3
42 dengan warna hijau kehitaman. Perubahan warna terjadi ketika penambahan FeCl3 bereaksi dengan senyawa tanin. Menurut Setyowati, dkk (2014), penambahan ekstrak tanin dengan FeCl3akan menimbulkan warna hijau, merah, ungu dan hitam yang kuat. Terbentuknya warna hijau kehitaman pada ekstrak setelah ditambahkan FeCl3karena tanin akan bereaksi dengan ion Fe3+ dan akan membentuk senyawa kompleks. Reaksi antara FeCl3 dengan tanin dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Reaksi dugaan antara FeCl3 dengan Tanin Sumber: Ummah, (2010)
43 FeCl3 karena tanin akan membentuk senyawa komplek dengan FeCl3.Hal ini sesuai denganpernyataan Sriwahyuni (2010), pada senyawatanin terdapat banyak gugus OH yang menyebabkan sifatnya polar maka senyawatanin dapat larutdalam pelarut polar sepertimetanol sehingga tanin dapat terekstrakdalam pelarut metanol. Hasil uji fitokimia masing-masing ekstrak dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 2 Hasil uji fitokimia tanin menggunakan FeCl3 Tumbuhan
Mangrove
Hasil uji dengan FeCl3
Buah +
Daun +
Kulit batang +
Keterangan: Tanda + : Terkandung senyawa tanin
4.2Uji Kuantitatif Senyawa Tanin dengan Metode Lowenthal-procter
44 Proses Titrasi KmnO4
Hasil titrasi KmnO4 pada buah
45 Hasil titrasi KMnO4 pada Batang
Gambar 10. Penentuan kadar Tanin menggunakan metode Lowenthal-procter
Ekstrak dari buah, daun dan kulit batang mangrove S.alba diambil sebanyak 0,5 gram dan dilarutkan dalam 100 ml aquades. Senyawa tanin bersifat polar, sehingga setiap ekstrak sangat mudah larut dalam air. Masing-masing ekstrak diambil 50 ml dan ditambahkan larutan indigokarmin kemudian dititrasi dengan kalium permanganat sampai warna kuning keemasan kemudiaan dicatatbanyaknya KmnO4 yang digunakan. Banyaknya KmnO4yang digunakan untuk menentukan senyawa tanin dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 3 Hasil titrasi senyawa tanin dengan KmnO4(A ml) Tumbuhan
Mangrov S.alba
Volume KmnO4yang digunakan
Rata-rata Ulangan I Ulangan II
Buah 1,3 1,3 1,3
Daun 1,4 1,4 1,4
46 Proses selanjutnya yaitu menentukan senyawa non tanin.Ekstrak yang telah dilarutkan dalam air diambil 50 ml dan ditambahkan larutan gelatin, NaCl, serbuk kaolin dan dikocok selama beberapa menit dan ditambahkan larutan indikator indigokarmin kemudian dititrasi dengan KmnO4 sampai berwarna kuning emas. Banyaknya KmnO4 yang digunakan untuk titrasi merupakan banyaknya gugus fenol selain tanin misalkan flavonoid yang masih terdapat dalam sampel.
Penambahan garam pada suasana asam adalah untuk mengendapkan tanin terkondensasi, sedangkan penambahan larutan gelatin adalah untuk mengendapkan senyawa tanin yang terdapat dalam ekstrak. Banyaknya KmnO4yang digunakan untuk menentukan senyawa non tanin dapat dilihat pada Tabel 5 dan hasil perhitungan kadar tanin menggunakan metode Lowenthal-procter dapat dilihat pada penjelasan berikut.
Perhitungan kadar tanin menggunakan metode Lowenthal-procter A. Buah mangrove S.alba
Kadar tanin = × 100%
= × 100%
= × 100%
47 B. Daun Mangrove S.alba
Kadar tanin = × 100%
= × 100%
= × 100%
= × 100% = 29,12%
C. Kulit Batang Mangrove S.alba
Kadar tanin = × 100%
= × 100%
48 Tabel 4 Hasil titrasi senyawa non tanin dengan KmnO4 (B ml)
Tumbuhan
Tabel 5 Hasil perhitungan kadar tanin dengan metode Lowenthal-procter. Cara perhitungan dapat dilihat pada lampiran 1.
Tumbuhan Mangrove
Sonneratia alba Kadar tanin (%)
Buah 41,6
Daun 29,12
Kulit batang 4,16
Berdasarkan hasil penelitian perhitungan kadar tanin dengan menggunakan metode Lowenthal-procter menunjukkan bahwa dari 50 ml larutan ekstrak buah mangrove S.alba memiliki kadar tanin 41,6%, daun 29,12% dan kulit batang 4,16%. Buah mangrove S.alba memiliki presentase tertinggi bila dibandingkan daun dan kulit batang. Hal ini sesuai dengan teori Lisdawati, dkk (2008), yang menyatakan bahwa buah tanaman pada umumnya memiliki kandungan metabolit sekunder yang lengkap dalam jumlah yang banyak bila dibandingkan dengan bagian tanaman lainnya.
49
dalamJayanegaraet al.,(2008), menyatakan bahwa kebanyakan
dedaunanmengandung senyawa fenolik dalamkonsentrasi yang tinggi, khususnya dalambentuk senyawa tanin.
Kandungan tanin yang terdapat dalam kulit kayu Mangrove S.alba adalah yang paling sedikit bila dibandingkan dengan buah dan daun. Hal ini dipengaruhi oleh ukuran diameter pohon yang dijadikan sampel penelitian karena semakin besar diameter pohon maka semakin lama proses pertumbuhan telah berlangsung, sehingga kulit yang telah dibentuk juga semakin banyak atau tebal dengan demikian tanin yang dibentuk juga semakin banyak. Menurut penelitian Hamidah (2007), diameter pohon berpengaruh sangat nyata terhadap kadar tanin. Semakin besar diameter pohon maka kadar tanin semakin meningkat, disebabkan meningkatnya diameter pohon diikuti oleh bertambahnya ketebalan kulit sehingga pada pohon yang berdiameter besar lebih banyak mengandung sel parenkim. Haygreen & Bowyer, (1989) dalam Hamidah, (2007), menyatakan bahwa diantara
xylem(jaringan kayu) dan floem (jaringan kulit kayu), terdapat kambium yang membelah berulang-ulang membentuk jaringan xylem dan floem baru. Dengan demikian pada pohon berdiameter besar akan menghasilkan lebih banyak jaringan
50 Menurut Gourama dan Bullerman (1995), produksi senyawa metabolit sekunder dipengaruhi oleh interaksi antara substrat dan lingkungan. Faktor yang mempengaruhi produksi senyawa metabolit sekunder dapat dibagi ke dalam tiga kategori, yaitu fisik (suhu, pH, kelembaban relatif dan kadar air, cahaya dan aerasi), nutrisi dan biologi.
51 5.2 Ekstraksi Flavonoid.
Persiapan Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian penentuan total flavonoid pada buah, daun dan kulit batang mangrove S.alba menggunakan metode fitokimia dan kolorimetri alumunium klorida adalah seperangkat alat gelas, vacum rotary evaporator (Eyela water bath 58-650), timbangan analitik PW 214, termometer, oven, stopwatch, toples, spektrofotometer UV-Vis T80.
Bahan yang digunakan pada penelitian penentuan total flavonoid pada buah, daun dan kulit batang mangrove S.alba menggunakan metode fitokimia dan kolorimetri alumunium klorida adalah buah, daun dan kulit batang mangrove (S.alba) berdiameter 15 cm. Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah metanol 75%, AlCl3 10%, NaOH 10%, H2SO4 0.25N, HCl pekat, kuersetin, serbuk magnesium. Bahan penunjang yang digunakan adalah kertas saring, alumunium foil, kapas dan tisu.
Prosedur Kerja
Sampel yang digunakan yaitu daun muda, buah tanpa biji dan kulit batang mangrove S. alba. Sampel dicuci sampai bersih menggunakan air mengalir kemudian diangin-anginkan dan dikeringkan menggunakan pengering mekanik pada suhu 50-60o C, kemudian dihaluskan lalu diekstraksi. Pelarut pengekstraksi flavonoid yang digunakan adalah pelarut polar (metanol). Hasil ekstrak diuji keberadaan flavonoid menggunakan metode fitokimia kemudian dilanjutkan dengan penentuan total flavonoid metode kolorimetri alumunium klorida.
52 Ekstraksi Menggunakan Metode Maserasi
A. Preparasi Sampel
Sampel tumbuhan mangrove S.alba diambil di Desa Katialada Kecamatan Kwandang Kabupaten Gorontalo Utara. Sampel yang diambil kurang lebih sebanyak 2 kg. Proses preparasi sampel menurut Nuraini, (2002) yang dimodifikasi suhu dan waktu pengeringan yaitu :
d. Buah: dicuci dengan air mengalir kemudian dipotong kecil-kecil dan biji buah dipisahkan. Kemudian sampel dikeringkan dengan pengering mekanik pada suhu 50-60ºC selama 6 jam, selanjutnya diangin-anginkan dan dihaluskan menggunakan blender sampai menjadi serbuk halus.
e. Daun: dicuci bersih dengan air mengalir kemudian dikeringkan menggunakan pengering mekanik selama 6 jam pada suhu 50-60ºC. Sampel yang telah kering diangin-anginkan dan kemudian dihaluskan dengan blender sehingga diperoleh serbuk halus.
f. Kulit batang: dicuci bersih dengan air mengalir kemudian dipotong kecil-kecil dan selanjutnya diangin-anginkan. Kemudian sampel dikeringkan menggunakan pengering mekanik selama 7 jam pada suhu 50-60ºC.
Sampel yang telah kering kemudian dihaluskan menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk dan diayak menggunakan ayakan 100 mesh.
B. Ekstraksi Metode Maserasi
53 Serbuk Kulit Batang Mangrove S.alba
Kulit Batang Mangrove S.alba
Sampel Kering Kulit Batang Mangrove S.alba
- Dicuci Sampai Bersih - Dipotong Kecil-kecil
- Dikeringkan Menggunakan Pengering Mekanik
54 Sampel mangrove akan ektraksi selama 1x24 jam menggunakan metanol 75% dan dilakukan perendaman dengan 2x ulangan, perendaman bertujuan untuk menarik senyawa metabolit sekunder pada tumbuhan mangrove. Hal ini diperkuat oleh pernyataan Istiqomah (2013), lama perendaman dan beberapa kali pengadukan pada ekstraksi maserasi bertujuan untuk menarik zat-zat berkhasiat yang tahan pemanasan maupun yang tidak tahan pemanasan. Proses untuk mendapatkan ekstrak dilakukan dengan cara, hasil perendaman disaring menggunakan kapas dan kertas saring sehingga didapatkan filtrat yang kemudian akan dipekatkan meggunakan vacum rotary evaporator pada suhu 40-45oC. Penggunaan suhu bertujuan untuk menguapkan metanol untuk mendapatkan ekstrak mangrove.
Gambar 11. Diagram Alir Ekstraksi Metode Maserasi Sumber : Nuraini (2002)
250 gram Serbuk Daun, Kulit dan Buah Mangrove S.alba masing-masing ditambahkan Metanol 75% sebanyak 1.5 L.
55 Menurut Hernani dan Nurdjanah (2009), suhu sangat berpengaruh terhadap kualitas bahan tanaman yang dihasilkan, terutama pada perubahan kadar fitokimia atau senyawa metabolit sekunder yang terkandung pada suatu tanaman.
Identifikasi Menggunakan Flavonoid Metode Fitokimia
Uji flavonoid pada penelitian ini menggunakan Mg + HCl, H2SO4, NaOH, dan metanol 75%. Masing-masing ekstrak direaksikan dengan Mg + HCl, H2SO4 dan NaOH. Tujuan penggunaan pereaksi adalah mereaksikan golongan flavonoid dengan pereaksi sehingga akan terbentuk perubahan warna. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna terhadap masing-masing ekstrak yang telah direaksikan dengan Mg + HCl, H2SO4 dan NaOH (Harborne, 1986).
0,1 gr dari masing-masing ekstrak kental
- Ditambahkan 10 mL metanol - Dibagi menjadi 4 tabung reaksi
Tabung I Kontrol
Tabung II Tabung III Tabung IV
-Tambahkan Mg-HCl -Tambahkan NaOH -Tambahkan H2SO4
(+) Flavonoid jika terjadi perubahan wana
56 Uji Kadar Flavonoid Menggunakan Metode Kolorimetri (AlCl3)
Metode ini dapat digunakan untuk menentukan jumlah flavonoid golongan flavon dan flavonol. Prinsip penetapan flavonoid dengan metode kolorimetri AlCl3 adalah terbentuknya kompleks antara AlCl3 dengan gugus keto pada atom C-4 dan juga dengan gugus hidroksi pada atom C-3 atau C-4 yang bertetangga dari flavon dan flavonol. Pada pembuatan kurva kalibrasi digunakan kuersetin sebagai pembanding dimana kuersetin merupakan flavonoid golongan flavonol yang mempunyai gugus keto pada C-4 dan memiliki gugus hidroksi pada atom C-3 atau C-5 yang bertetangga dari flavon dan flavonol (Chang et al, 2002).
a. Pembuatan Larutan Standar
Gambar 13. Diagram Alir Pembuatan Larutan Standar Sumber : Chang et al (2002)
57 b. Penentuan Total Flavonoid
Gambar 14. Diagram Alir Penentuan Total Flavonoid Sumber : Chang et al (2002)
Prosedur Analisa
Identifikasi Flavonoid Metode Fitokimia (Harborne, 1986)
Ekstrak mangrove dari masing-masing sampel diambil sebanyak 0,1 gram dilarutkan dengan 10 ml metanol 75%, masing-masing dibagi menjadi 4 tabung reaksi. Tabung reaksi pertama sebagai kontrol, tabung reaksi kedua di tambahkan NaOH, tabung reaksi ketiga ditambahkan H2SO4, keempat di tambahkan Mg + HCl. Perubahan dari masing-masing tabung yang ditambahkan pereaksi dibandingkan dengan kontrol, dan jika terjadi perubahan warna menunjukan bahwa positif mengandung flavonoid.
Tambahkan AlCl3 10%
Masukan dalam Tabung Reaksi
Diinkubasi selama 30 menit 1,5 mL Ekstrak dari masing-masing sampel
Diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis
58 Uji Total Flavonoid Metode Kolorimetri Alumunium Klorida (Chang dan When, 2002).
1. Pembuatan Larutan Standar
Kuersetin ditimbang sebanyak 10 mg, dimasukan dalam gelas piala 50 ml dan dilarutkan dengan 25 ml metanol 75%, kemudian diaduk hingga homogen. Setelah itu larutan dipindahkan kedalam labu takar 100 ml dan ditambahkan metanol 75% sampai pada garis eksa, lalu digojok hingga homogen. Encerkan larutan baku induk untuk mendapatkan larutan baku kerja dengan kosentrasi 0,1 ppm, 0,5 ppm, 1ppm, 1,5 ppm, 2 ppm dan 2,5 ppm.
2. Penentuan Total Flavonoid
Penentuan jumlah flavonoid dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis menggunakan larutan Alumunium klorida (AlCl3), optimasi panjang gelombang dilakukan untuk menentukan panjang gelombang maksimum yang akan digunakan dalam pengukuran menggunakan larutan standar. Sebanyak 1,5 ml larutan ekstrak dari masing-masing sampel diambil dengan kosentrasi 0,5% dan ditambahkan dengan AlCl3 10%. setelah itu di inkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum. Pembacaan absorbansi dilakukan dengan menggunakan kurva kalibrasi. Hasil dinyatakan sebagai rata-rata dari tiga kali pengukuran dan kandungan flavonoid dinyatakan dengan kesetaraan larutan standar flavonoid menggunakan pembanding baku kuersetin. Serapan diukur dengan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 300-400 nm.
3. Perhitungan Untuk Menentukan Total Flavonoid
Kadar flavonoid, dihitung berdasarkan kurva kalibrasi hasil pembacaan dari alat spektrofotometer UV-Vis, dan persamaan regresi linear dengan menggunakan hukum Lambert-Beer seperti pada persamaan dibawah :
59 Keterangan : y = Absorbansi
x = Konsentrasi (C) mg.L b = Slope (kemiringan) a = Intersep
Nilai a dan b diperoleh dari persamaan (Daijan, 1986 dalam Pakaya, 2015) :
Keakuratan hasil perhitungan, sebagai penetapan kadar suatu sampel, ditentukan melalui nilai koefisien korelasi (r2) yang mendekati 1 sehingga dapat dikatakan bahwa absorbansi merupakan fungsi yang besarnya berbanding lurus dengan konsentrasi dan mengikuti persamaan regresi linear. Persamaan yang digunakan untuk memperoleh nilai memperoleh nilai koefisien (r2) (Daijan, 1986 dalam Pakaya, 2015), sebagai berikut :
Setelah konsentrasi pengukuran diketahui, maka kandungan flavonoid total dalam sampel ditentukan dengan menggunakan persamaan di bawah : (Halvorsen, dkk, 2002) berikut ini :
Keterangan : M = Kandungan flavonoid total dalam sampel (μg/g)
C = Konsentrasi yang diperoleh dari kurva kalibrasi (mg/L) F = Faktor pengenceran
60 Hasil Rendemen Daun, Buah , dan Kulit Batang Mangrove S.alba
Sampel tumbuhan mangrove S.alba diambil di Desa Katialada, Kecamatan Kwandang, Kabupaten Gorontalo Utara sebanyak 2 kg. Sampel dibersihkan dan dipotong kecil-kecil, kemudian sampel daun dan buah dikeringkan menggunakan suhu 50-60oC selama 6 jam sedangkan kulit dikeringkan pada suhu 50-60oC selama 7 jam menggunakan pengering mekanik. Sampel kulit batang mangrove S.alba
lebih tebal dibanding sampel daun dan buah sehingga waktu pengeringan sedikit lebih lama dari sampel daun dan buah mangrove S.alba.
Tabel 7. Rendemen Sampel Kering Mangrove S.alba
Daun (g) Buah (g) Kulit Batang (g) ditunjukan pada Tabel 7. Sampel yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk halus kemudian diangin-anginkan.
Tabel 8. Rendemen Sampel Serbuk Mangrove S.alba
61 ditunjukan pada Tabel 8. Penurunan berat pada proses pengeringan dan proses penghalusan diakibatkan berkurangnya kadar air pada sampel ketika dilakukan pengeringan dan setelah proses penghalusan sampel. Menurut Pakaya (2015), pengeringan dimaksudkan untuk mengurangi kadar air, menghentikan reaksi enzimatis dan mencegah tumbuhnya jamur agar dapat disimpan lebih lama dan tidak rusak sehingga komposisi kimianya tidak mengalami kerusakan.
Daun, buah, dan kulit batang mangrove S.alba yang digunakan adalah daun, buah, dan kulit batang yang masih dalam keadaan segar, pemilihan sampel harus diperhatikan untuk menghindari kerusakan pada sampel karena sampel yang cacat telah mengalami kerusakan pada jaringan sel sehingga komposisi kimianya akan berbeda dengan sampel yang masih segar. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam preparasi sampel adalah harus terhindar dari zat pengotor, kontak dengan senyawa lain dan tidak terkena langsung dengan cahaya matahari.
Bahan tanaman yang dapat dikeringkan dengan cara dikeringkan langsung dibawah sinar matahari adalah simplisia dari akar, rimpang, kulit, dan biji-bijian. Pengeringan bahan dengan sinar matahari langsung dalam keadaan terbuka, seringkali menyebabkan bahan mengalami pencemaran dan bila terjadi perubahan cuaca secara tiba-tiba akan merupakan suatu masalah. Pada proses pengeringan dengan matahari langsung, kemungkinan akan terjadi kontaminasi dari lingkungan seperti debu, insekta, burung, dan lain-lain (Hernani dan Nurdjanah, 2009). Menurut Pramono (2006), Sinar ultra violet dari matahari juga dapat menimbulkan kerusakan kandungan kimia pada bahan yang dikeringkan.
Hasil Ekstraksi Menggunakan Metode Maserasi
62 dengan tujuan untuk menguapkan metanol sehingga didapatkan ekstrak kental. Menurut Voight (1995) dalam Istiqomah (2013), penggunaan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar), bertujuan untuk menarik zat-zat berkhasiat yang tahan pemanasan maupun yang tidak tahan pemanasan untuk mencapai kosentrasi pada keseimbangan. Rendemen ekstrak kental metanol yang diperoleh dari daun, buah, dan kulit batang mangrove
S.alba dapat ditunjukan pada Tabel 9.
Tabel 9. Rendemen Ekstrak Kental Metanol Mangrove
S.alba
Ektrak kental yang dihasilkan yaitu daun dengan berat ekstrak 14,73 gram dengan rendemen 5,89%, buah dengan berat ekstrak 3,59 gram dengan rendemen 1,43%, dan kulit batang dengan berat ekstrak 9,67 gram dengan rendemen 4,83%.
Menurut Sani, dkk (2014), rendemen ekstrak dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut :
63
Gambar 15. Sampel Serbuk dan Ekstrak Kental Mangrove S.alba
Hasil Identifikasi Flavonoid Menggunakan Metode Fitokimia
Uji Flavonoid dapat dilakukan dengan menambahkan beberapa pereaksi diantaranya adalah H2SO4, NaOH, dan Mg + HCl. Hasil uji skrining flavonoid dari masing-masing ekstrak dapat ditunjukan pada Tabel 10.
Tabel 10. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Daun, Buah dan Kulit Batang Mangrove
S.alba
Keterangan : (+) = Teridentifikasi (Jika terjadi perubahan warna) (-) = Tidak teridentifikasi (tidak terjadi perubahan warna) Berdasarkan Tabel 4, ekstrak daun, buah dan kulit batang mangrove S.alba
positif mengandung senyawa flavonoid dengan indikasi beberapa perubahan warna setelah ditambahkan pereaksi NaOH, Mg+HCl, dan H2SO4.
Sampel Ekstrak Kontrol
Batang Cokelat Kuning Jingga
Kuning Kecoklatan +
64 a. Warna Ekstrak Mangrove Setelah Ditambahkan Pereaksi NaOH
Pada identifikasi flavonoid menggunakan pereaksi NaOH, warna yang dihasilkan dari sampel daun mangrove S.alba yaitu kuning, warna yang dihasilkan dari sampel buah mangrove S.alba yaitu kuning kemerahan dan warna yang dihasilkan dari sampel kulit batang mangrove S.alba yaitu kuning. Hasil perubahan menunjukan sampel mangrove S.alba positif terdapat flavonoid ditunjukan pada Gambar 19.
Berdasarkan hasil yang didapatkan maka dugaan reaksi yang terjadi antara flavonoid dan pereaksi NaOH adalah sebagai berikut :
Gambar 16. Dugaan Reaksi Flavonoid dengan NaOH Sumber : Achmad, 1986 dalam Pakaya, 2015
Achmad (1986) dalam Pakaya (2015) menjelaskan bahwa senyawa krisin yang merupakan turunan dari seyawa-senyawa flavon pada penambahan NaOH mengalami penguraian oleh basa menjadi molekul seperti asetofenon yang berwarna kuning karena adanya pemutusan ikatan pada struktur isoprene. b. Warna Ekstrak Mangrove Setelah Ditambahkan Pereaksi Mg+HCl
Pada identifikasi flavonoid menggunakan pereaksi Mg+HCl, warna yang dihasilkan dari sampel daun mangrove S.alba yaitu hijau kecoklatan, warna yang dihasilkan dari sampel buah mangrove S.alba yaitu kuning kehijauan dan warna yang dihasilkan dari sampel kulit batang mangrove S.alba yaitu jingga. Hasil perubahan menunjukan sampel mangrove S.alba positif terdapat flavonoid ditunjukan pada Gambar 19.
65 Berdasarkan hasil yang didapatkan maka dugaan reaksi yang terjadi antara flavonoid dan pereaksi Mg+HCl adalah sebagai berikut :
Gambar 17. Dugaan Reaksi Flavonoid dengan Mg+HCl Sumber : Setyowati dkk (2014)
Setyowati dkk (2014) menjelaskan bahwa penambahan logam Mg dan HCl pekat pada uji flavonoid berfungsi untuk mereduksi inti benzopiron yang terdapat pada struktur flavonoid sehingga terbentuk perubahan warna menjadi merah atau jingga. Jika dalam suatu ekstrak tumbuhan terdapat senyawa flavonoid akan terbentuk garam flavilium saat penambahan Mg dan HCl yang berwarna merah atau jingga.
c. Warna Ekstrak Mangrove Setelah Ditambahkan Pereaksi H2SO4
Pada identifikasi flavonoid menggunakan pereaksi H2SO4, warna yang dihasilkan dari sampel daun mangrove S.alba yaitu kuning kemerahan, warna yang dihasilkan dari sampel buah mangrove S.alba yaitu kuning dan warna yang dihasilkan dari sampel kulit batang mangrove S.alba yaitu kuning
+Cl -HCl
Cl-+ Cl
-Flavonon
66 kecoklatan. Hasil perubahan menunjukan sampel mangrove S.alba positif terdapat flavonoid ditunjukan pada Gambar 19.
Berdasarkan hasil yang didapatkan maka dugaan reaksi yang terjadi antara flavonoid dan pereaksi H2SO4 adalah sebagai berikut :
Gambar18. Dugaan Senyawa Flavonoid dengan NaOH Sumber : Achmad, 1986 dalam Pakaya, 2015
Terbentuknya warna merah karena penambahan H2SO4 pekat mengakibatkan terjadinya reaksi substitusi elektrofilik dimana posisi atom OH pada flavonoid terdistribusi oleh atom H dan H2SO4 (Markham dan Andersen, 2006). Menurut Usman (2003) dalam Pakaya (2015), sebagaimana senyawa aromatik, flavon juga mengalami reaksi substitusi elektrofilik, gugus hidroksi pada flavon mengarahkan reaksinya seperti senyawa fenol.
SO42 -H+
OH
67 Gambar19. Hasil Uji Flavonoid Metode Fitokimia
Flavonoid pada tanaman mempunyai pigmen warna dan juga berfungsi sebagai antioksidan serta dapat berfungsi sebagai pertahanan diri terhadap organisme perusak dan lingkungan yang ekstrim (Shah dan Hossain, 2014). Menurut Prabowo (2008), adanya flavonoid pada suatu tumbuhan dilihat dengan terbentuknya warna saat direaksikan dengan senyawa yang dapat bereaksi dengan pigmen warna pada flavonoid.
Total Flavonoid Menggunakan Metode Kolorimetri AlCl3 Kurva Kalibrasi Kuersetin
Penentuan total flavonoid dilakukan dengan membuat serangkaian standar senyawa kuersetin dengan variasi 0,1 ppm, 0,5 ppm, 1 ppm, 1,5 ppm, 2 ppm, dan 2,5 ppm. Kuersetin merupakan salah satu jenis flavonoid yang umum digunakan sebagai standar dalam penentuan kadar flavonid, yang secara biologis amat kuat, memiliki aktifitas antioksidan yang sangat tinggi (Waji dan Sugrani, 2009) dan glikosidanya berada dalam jumlah sekitar 60-70% dari flavonoid (Kelly, 2011). Selanjutnya, diukur absorbansinya pada panjang gelombang 300-400 nm sehingga diperoleh serapan maksimum panjang gelombang 374 nm dan kurva kalibrasi larutan standar senyawa kuersetin.
