i
KARAKTERISASI SPEKTROSKOPI TERHADAP ISOLAT AKTIF TANAMAN ETNOMEDISIN DARI DESA
SIPAENRE KABUPATEN BULUKUMBA UNTUK PENGOBATAN INFEKSI
SPECTROSCOPY CHARACTERIZATION OF ISOLATE ACTIVE ETHNOMEDISIN PLANT FROM SIPAENRE VILLAGE, BULUKUMBA DISTRICT FOR TREATMENT
OF INFECTION
NURUL ILMI YUSUF N111 14 508
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
ii
KARAKTERISASI SPEKTROSKOPI TERHADAP ISOLAT AKTIF TANAMAN ETNOMEDISIN DARI DESA SIPAENRE KABUPATEN
BULUKUMBA UNTUK PENGOBATAN INFEKSI
SPECTROSCOPY CHARACTERIZATION OF ISOLATE ACTIVE ETHNOMEDISIN PLANT FROM SIPAENRE VILLAGE, BULUKUMBA
DISTRICT FOR TREATMENT OF INFECTION
SKRIPSI
untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana
Nurul Ilmi Yusuf N111 14 508
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
iii
KARAKTERISASI SPEKTROSKOPI TERHADAP ISOLAT AKTIF TANAMAN ETNOMEDISIN DARI DESA SIPAENRE KABUPATEN
BULUKUMBA UNTUK PENGOBATAN INFEKSI
Nurul Ilmi Yusuf N111 14 508
Disetujui oleh : Pembimbing Utama,
Subehan, S.Si., M.Pharm.Sc., Ph.D.,Apt NIP. 19750925 200112 1002
Pembimbing Pertama, Pembimbing Kedua,
Dra. Rosany Tayeb, M.Si.,Apt. Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si.,Apt.
NIP. 19561011 198603 2 002 NIP. 19771125 200212 2 003
Pada tanggal : Mei 2018
iv SKRIPSI
KARAKTERISASI SPEKTROSKOPI TERHADAP ISOLAT AKTIF TANAMAN ETNOMEDISIN DARI DESA SIPAENRE KABUPATEN
BULUKUMBA UNTUK PENGOBATAN INFEKSI
SPECTROSCOPY CHARACTERIZATION OF ISOLATE ACTIVE ETHNOMEDISIN PLANT FROM SIPAENRE VILLAGE, BULUKUMBA
DISTRICT FOR TREATMENT OF INFECTION Disusun dan diajukan oleh :
NURUL ILMI YUSUF N111 14 508
Telah Dipertahankan di depan Panitia Ujian Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Pada Tanggal: 21 Mei 2018
Dan dinyatakan telah memenuhi syarat Panitia Penguji Skripsi
1. Ketua : Dra. Ermina Pakki, M.Si., Apt ………
2. Sekretaris : Ismail, S.Si., M.Si., Apt ……...…....
3. Ex. Officio : Subehan, S.Si., M.Pharm.Sc.,Ph.D., Apt. ………...
4. Ex. Officio : Dra. Rosany Tayeb, M.si.,Apt. ………...
5. Ex. Officio : Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt.. ………
6. Anggota : Muh. Aswad, S.Si., M.Si., Ph.D., Apt ………
Mengetahui :
Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt.
NIP. 19641231 199002 1 005
v
PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini adalah karya saya sendiri, tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila dikemudian hari terbukti bahwa pernyataan saya ini tidak benar, maka skripsi dan gelar yang diperoleh, batal demi hukum.
Makassar, 21 Mei 2018 Yang menyatakan
Nurul Ilmi Yusuf N111 14 508
vi
UCAPAN TERIMAKASIH
Bismillahirrahmanirrahim
َنيِمَلاَعْلا ِّبَر ِ ه ِلِلَ ُدْمَحْلا
Puji syukur yang tak terhingga penulis haturkan kepada Allah Subhanahu Wata‟ala Yang Maha Berkuasa atas segalanya, karena hanya dengan ridho, hidayah, anugerah dan limpahan rahmat-Nya kepada penulis sehingga skripsi ini bisa terselesaikan. Shalawat serta salam selalu tercurahkan kepada junjungan kita, Nabiyullah Muhammad Shallallahu „alaihi Wasallam.
Banyak rintangan yang penulis hadapi selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. Namun segala do‟a dan usaha dari berbagai pihak penulis dapat melewati rintangan tersebut dan menyelesaikan skripsi ini. Untuk itu, penulis ingin menyampaikan rasa hormat dan terimakasih yang sebesar-besarnya : 1. Kepada Kedua orang tuaku yang tercinta yaitu Ayahanda H. Muh. Yusuf
Tahir dan Ibunda Hj. Bangsuhari S.Pd atas segala pengorbanan selama ini, baik itu pengorbanan moril maupun materil, yang selama ini selalu berusaha demi melihat penulis bisa meraih keberhasilan. Penulis sadar bahwa tidak ada yang dapat penulis lakukan untuk membalas pengorbanan tersebut, selain memanjatkan do‟a yang tiada henti kepada Allah SWT untuk ayah dan ibu.
2. Kepada saudaraku Muh. Yusri Yusuf, Muh. Nurfachrullah Yusuf dan terkhusus untuk almarhum adik saya tercinta Muh. Ardillah Yusuf serta seluruh keluarga yang telah memberiku semangat demi keberhasilanku dalam dunia perkuliahan dan menggapai cita-cita yang penulis inginkan, penulis ucapkan banyak terima kasih.
3. Kepada bapak Subehan, S.Si. M.Pharm.Sc. Ph.D., Apt, ibu Dra. Rosany tayeb, M.Si., Apt, dan ibu Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt selaku dosen pembimbing yang telah meluangkan waktu, tenaga, dan ilmunya dalam memberikan bimbingan, bantuan, dan perhatian mulai dari perencanaan sampai terselesainya skripsi ini.
4. Kepada Tim Penguji, Ibu Dra. Ermina Pakki, M.Si., Apt selaku ketua penguji, bapak Ismail, S.Si., M.Si., Apt., selaku selaku sekertaris penguji, dan bapak Muh. Aswad, S.Si., M.Si., Ph.D., Apt., atas masukan-masukan yang sangat bermanfaat untuk perbaikan skripsi ini dan atas ilmu yang telah dibagikan kepada penulis.
5. Kepada Dekan, wakil dekan dan bapak/ibu dosen Fakultas Farmasi UNHAS, terima kasih atas ilmu, nasehat, saran serta pengalaman yang telah diberikan selama penulis menjalani perkuliahan ini, serta seluruh staf Fakultas Farmasi UNHAS yang telah banyak membantu penulis.
6. Kepada bapak Sukamto S. Mamada, S.Si., M.Sc., Apt selaku penasehat akademik yang selama perkuliahan telah membantu dan membimbing penulis hingga memperoleh gelar kesarjanaan.
7. Kepada seluruh laboran Fakultas Farmasi UNHAS terkhusus untuk ibu Adri, kak Lia dan kak Abdi yang sangat membantu atas segala kebutuhan penulis pada saat penelitian hingga selesai.
8. Kepada sahabat perjuangan penelitian Ika sartika, Riri Nurfita Sari yang selalu mendengarkan segala jenis masalah yang saya alami pada saat penelitian dan tetap memberikan semangat. Terima kasih atas bantuannya selama ini. Semoga kebaikan kalian bernilai ibadah di sisi Allah SWT.
9. Kepada sahabat se-perjuangan dari penulis menginjakkan kaki di Fakultas Farmasi UNHAS, Chaerunnisa indra, Muhlisa, Hajirah, Nurfatmasari dan Ridha Amaliah Alwi untuk semangatnya selama penelitian dan penyusunan skripsi ini, terima kasih atas persaudaraan yang terjalin selama masa-masa perkuliahan hingga saat detik-detik akhir studi.
10. Kepada teman se-perjuangan penelitian hikma, dala, koy, nute, asmi, atika, evi, herlina, indahpooh, raya, fitri rustam, astria, lisa, fimo atas semangat yang telah diberikan, semoga Allah membalas kebaikan kalian.
11. Kepada Korps. Asisten Kimia Farmasi khusunya Dike, Firda, Vio, Fiji, kak Anti, Marzel, Vian dan Atan yang banyak memberikan pengalaman,
bantuan dan pengarahan kepada penulis sehingga penulis bisa menyelesaikan penelitian.
12. Kepada teman-teman angkatan HIOSI4MIN “2014” yang selalu kompak, dan memberikan semangat satu sama lain, semoga selamanya akan seperti ini.
13. Kepada Awal Kharisanto yang selalu memberikan semangat tak henti- henti kepada penulis, sebagai pendengar yang baik atas segala kendala yang penulis alami selama penelitian dan penyusunan skripsi ini serta seluruh pihak yang tidak sempat disebut namanya. Semoga Allah membalas semua kebaikan kita selama ini
Penulis menyadari bah wa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, banyak kekurangan dan kelemahan. Di dunia tak ada satupun yang sempurna karena kesempurnaan hanya milik-Nya. Maka dari itu saran dan kritik membangun sangat penulis harapkan guna tambahan wawasan agar dalam pengerjaan penelitian selanjutnya dapat lebih baik.
Akhir kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pengembangan
ilmu pengetahuan terutama di bidang farmasi, amin.
Makassar, 21 Mei 2018 Penulis,
Nurul Ilmi Yusuf
ABSTRAK
NURUL ILMI YUSUF. Karakterisasi Spektroskopi Terhadap Isolat Aktif Tanaman Etnomedisin Dari Desa Sipaenre Kabupaten Bulukumba Untuk Pengobatan Infeksi (Dibimbing oleh Subehan, Rosany tayeb dan Herlina rante)
Infeksi karena bakteri merupakan salah satu penyakit yang paling sering terjadi, sehingga para ilmuan berupaya untuk mencari alternatif lain sebagai obat antibakteri dengan menggunakan tanaman etnomedisin. Tujuan dilakukan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari beberapa tanaman etnomedisin yang berasal dari kabupaten bulukumba terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli serta karakterisasi senyawa terhadap isolat aktif yang memiliki aktivitas terbesar. Dilakukan uji daya hambat menggunakan metode difusi dengan paper disc dan didapatkan tanaman yang memiliki aktivitas terbesar adalah ekstrak metanol daun tembelekan (Lantana camara L.), dilanjutkan dengan melihat profil KLT dengan menggunakan fase gerak metanol:kloroform (1:12) yang menunjukkan adanya 11 noda yang muncul setelah penyemprotan H2SO4
10% , lalu diuji dengan metode KLT-bioautografi secara kontak dan langsung yang menunjukkan adanya zona hambat yang terbentuk pada noda 7 dengan nilai Rf 0,46. Kemudian senyawa aktif dipisahkan dari senyawa lain menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP). Isolat yang diperoleh kemudian diuji kemurnian senyawa menggunakan KLT 2 dimensi dan dikarakterisasi menggunakan spektrofotometer UV-VIS dan FT- IR yang menunjukkan hasil panjang gelombang maksimum 215 nm serta adanya gugus N-H (amin primer), C-H (alkana), C-H aromatik, C=O (aldehid), C=N (imina) dan C=C (alkena)
Kata kunci : KLT-Bioautografi, KLT 2-dimensi, Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP), Spektrofotometer UV-VIS, Spektrofotometer FT-IR.
x ABSTRACT
NURUL ILMI YUSUF. Spectroscopy Characterization of Isolate Active Ethnomedisin plant from Sipaenre Village, Bulukumba district for treatment of infection (Supervised by Subehan, Rosany tayeb and Herlina rante)
Bacterial infection is one of the most common diseases, so scientists are trying to find another alternative as an antibacterial drug by using ethnomedicine plants. The purpose of this study to investigate the antibacterial activity of some ethnomedicin plants originating from bulukumba district against Staphylococcus aureus and Escherichia coli bacteria and characterization of compounds in the most active isolates that had the greatest activity. The inhibitory test was performed using a diffusion method with a paper disc and the largest plant obtained was tembelekan leaf methanol extract (Lantana camara L.), followed by looking at the TLC profile using the methanol phase: chloroform (1:12) showed 11 blemishes after H2SO4 10 % spraying, and then tested on TLC-bioautographic methods that show the zone of active formed on stain 7 with Rf value of 0.46. Then the active compound is separated from other compounds using preparative thin chromatography method (PTLC). The obtained isolate was then tested for the purity of the compound using 2-D TLC and characterized using UV-VIS and FT-IR spectrophotometers showing maximum wavelength yield of 215 nm and presence of N-H (primary amine), C-H (alkane), aromatic C-H, C = O (aldehyde), C = N (imine) and C = C (alkene)
Keywords: TLC-Bioautography, 2-D TLC, Preparative Thin Layer Chromatography (PTLC), UV-VIS Spectrophotometer, FT-IR Spectrophotometer
xi
DAFTAR ISI
Halaman
UCAPAN TERIMA KASIH vi
ABSTRAK ix
ABSTRACT x
DAFTAR ISI xi
DAFTAR TABEL xv
DAFTAR GAMBAR xvi
DAFTAR LAMPIRAN xvii
BAB I PENDAHULUAN 1
I.1 Latar Belakang 1
I.2 Rumusan Masalah 3
I.3 Tujuan Penelitian 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 4 II.1 Uraian Tumbuhan 4 II.2 Uraian Mikroba 16
II.3 Metode Ekstraksi 19
II.3.1 Maserasi 20
II.3.2 Remaserasi 20
II.3.3 Perkolasi 20
II.3.4 Sokletasi 21
II.4. Antibakteri 22
II.4.1 Pengertian Antibakteri . 22
II.4.2 Sifat Antibakteri 22
II.4.3 Mekanisme Antibakteri 23
II.5 Uji Aktivitas Antibakteri 24
II.6 KLT- Bioautografi 26
II.7 Pemisahan Senyawa dengan Kromatografi 28
II.7.1 Kromatografi Lapis Tipis 28
II.7.2 Kromatografi Kolom 30
II.7.3 Kromatografi Cair Vakum 30
II.7.4 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 31
II.8 Uji Kemurnian Senyawa 31
II.8.1 KLT- 2 Dimensi 31
II.9 Karakterisasi Senyawa . 32
II.9.1 Spektrofotometer UV-VIS 32
II.9.1.1 Prinsip Dasar 32
II.9.1.2 Instrumen Spektrofotometer UV-VIS 33
II.9.2 Spektrofotometer FT-IR 35
II.9.2.1 Prinsip Dasar 35
II.9.2.2 Instrumen Spektrofotometer FT-IR 37
BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN 38
III.1 Alat dan Bahan ` 38
III.2 Metode Penelitian 39 III.2.1 Pengambilan dan Pengolahan Sampel 39
III.2.2 Ekstraksi Sampel 39
III.2.3 Uji Aktivitas Antimikroba 40
III.2.3.1 Sterilisasi Alat 40
III.2.3.2 Pembuatan Medium 40
III.2.3.2.1 Medium Nurtien Agar Miring 40 III.2.3.2.2 Pembuatan Medium MHA 41
III.2.3.3 Penyiapan Mikroba Uji 41
III.2.3.4 Pembuatan Suspensi Bakteri 41
III..3.4.1 Pembuatan Mc Farland 0,5 41
III.2.3.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri Metode Difusi Agar 42
III.2.3.6 Pengujian KLT-Bioautografi 43 III.2.3.7 Isolasi Senyawa Aktif 43
III.2.3.7.1 KLT Preparatif 43
III.2.3.7.2 KLT Dua Dimensi 44 III.2.3.8 Karakterisasi Senyawa Antibakteri 44
III.2.3.8.1 Identifikasi Spektrofotometer UV-VIS 44
III.2.3.8.2 Identifikasi Spektrofotometer FT-IR 44 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 46
IV.1 Ekstraksi Sampel 46
IV.2 Uji Daya Hambat menggunakan metode difusi agar 47
IV.3 Pemisahan Senyawa dengan kromatografi lapis tipis 50 IV.4 Uji antibakteri menggunakan KLT-Bioautografi 51
IV.5 Isolasi dan Karakterisasi Senyawa 53
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 59
V.1 Kesimpulan 59
V.2 Saran 59
DAFTAR PUSTAKA 60
LAMPIRAN 65
xv
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Hasil Ekstraksi Sampel 46
2. Hasil Pengukuran Zona Hambat Bakteri S.aureus 47
3. Hasil Pengukuran Zona Hambat Bakteri E.coli 48
4. Interpretasi data FT-IR 57
xvi
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Bakteri Staphlococcus aureus 17
2. Bakteri Escherichia coli 19
3. Alat Perkolasi 21
4. Alat Sokletasi 21
5. Instrumen Spektrofotometer UV-VIS 33
6. Instrumen Spektrofotometer FT-IR 37
7. Profil KLT 51
8. Uji Aktivitas Antibakteri Menggunakan KLT-Bioautografi 52
9. Hasil KLTP 53
10. Hasil KLT Isolat 54
11. Hasil KLT Dua Dimensi 55
12. Spektra Serapan UV-VIS Pada Sampel Isolat 56
13. Spektra Serapan FT-IR Pada Sampel Isolat 57
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Skema Kerja 65
2. Gambar Tanaman 68
3. Hasil Ekstraksi 69
4. Uji Aktivitas Antibakteri 72
5. Dokumentasi Penelitian 73
6. Hasil Pengukuran Spektrofotometer UV-VIS 74
7. Hasil Pengukuran Spektrofotometer FT-IR 75 8. Komposisi Medium 76
9. Peta Kabupaten Bulukumba 77
1
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Berbagai macam tanaman di Indonesia telah digunakan secara turun- temurun berdasarkan empirik sebagai tanaman obat tradisional hal ini dikenal dengan istilah Etnomedisin. Berdasarkan (Media Indonesia, 2016) Indonesia memiliki lebih dari 30.000 jenis tanaman obat. Namun, hingga saat ini baru sekitar 2.000 jenis yang telah dimanfaatkan sebagai bahan baku obat-obatan herbal. Hingga 2016, baru terdapat 36 jenis obat herbal terstandar dan 8 jenis fitofarmaka (obat herbal yang teruji klinis) yang beredar di pasaran (Dalimarth, 2006 ; Hariana, 2008).
Berdasarkan hal tersebut dengan melihat berbagai macam tanaman Etnomedisin di Indonesia yang belum dimanfaatkan sebagai bahan baku obat-obatan herbal, menjadi salah satu potensi yang sangat besar bagi para peneliti untuk memanfaatkan tanaman tersebut dan mengisolasi senyawa aktif yang bermanfaat bagi kesehatan karena telah diketahui bahwa Indonesia masih memiliki banyak permasalahan dalam bidang kesehatan karena munculnya berbagai macam penyakit, salah satunya adalah infeksi (Anonim, 2012) Infeksi dapat disebabkan oleh bakteri (Neal, 2006). Bakteri penyebab infeksi diantaranya Staphylococcus aureus dan Eschericia coli (Adam, 1995).
Penggunaan antibiotik sangat berperan penting untuk mengatasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri. Antibiotik ini diharapkan dapat menghambat atau membunuh bakteri yang membahayakan bagi manusia (Neal, 2006).
Tetapi, penggunaan antibiotik yang tidak rasional memiliki dampak negatif, salah satunya ialah resistensi bakteri (Kee, 1996). Untuk mengatasi masalah tersebut, maka usaha penemuan antibiotik sangatlah penting.
Beberapa tanaman yang biasa digunakan oleh masyarakat Desa Sipaenre, Kabupaten Bulukumba sebagai obat tradisional untuk mengatasi infeksi diantaranya daun tembelekan (Lantana camara L.), daun kopasanda (Chromolaena odorata), daun dan batang kiti-kiti balanda (Cassia alata L.), herba urang-aring (Eclipta prostrata L.), daun yodium (Jathropha multifida L.), daun pecut kuda (Stachytarpheta jamaicensis L.), daun bandotan (Agaratum conyzoides L.). Menurut Badasa,dkk (2015) ekstrak daun tembelekan (Lantana camara L.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus, Pseudominas aeuruginosa, Eschericia coli. Menurut Oko, dkk (2017) ekstrak etanol dan air daun kopasanda (Chromolaena odorata) memiliki aktivitas antibakteri yang efektif. Penelitian Nayak, dkk (2015) ekstrak daun kiti-kiti balanda (Cassia alata L.) menggunakan metode ekstraksi soxhlet memiliki aktivitas antibakteri. Menurut Santhosh, dkk (2015) herba urang-aring (Eclipta prostrata L.) mengandung senyawa alkaloid, flavanoid, tanin, terpenoid, steroid, glikosida dan juga memiliki aktivitas antimikroba. Menurut Aiyelaagbe, dkk (2008) fraksi ekstrak daun yodium (Jathropha multifida L.) memiliki aktivitas antibakteri dengan nilai KHM dari
0,75 sampai 12,5 μg/mL. Menurut Suneetha, dkk (2013) ekstrak daun pecut kuda (Stachytarpheta jamaicensis L.) memiliki aktivitas antibakteri dan antijamur yang efektif pada konsentrasi 70-300 μg/mL. Dan menurut Garg, dkk (2015) ekstrak daun bandotan (Agaratum conyzoides L.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap S.aureus dan E.coli.
I.2 Rumusan Masalah
1. Manakah dari kedelapan tanaman etnomedisin yang berasal dari Desa Sipaenre kabupaten Bulukumba yang memiliki aktivitas antibakteri terbesar terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Eschericia coli?
2. Bagaimana karakterisasi senyawa terhadap isolat aktif dari tanaman etnomedisin yang memiliki aktivitas antibakteri terbesar?
I.3 Tujuan Penelitian
1. Untuk mengetahui aktivitas antibakteri terbesar dari beberapa tanaman etnomedisin yang berasal dari Desa Sipaenre, Kabupaten Bulukumba terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Eschericia coli
2. Untuk mengetahui karakterisasi dari isolat aktif tanaman etnomedisin yang memiliki aktivitas antibakteri berdasarkan Spektrofotometer FT-IR.
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Uraian tumbuhan II.1.1 Lantana camara L.
II.1.1.1 Klasifikasi tumbuhan Kerajaan : Plantae
Divisi : Spermatophyta Anak Divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae/ Magnoliopsida Anak kelas : Sympetalae/ Asteridae
Bangsa : Lamiales Suku : Verbenaceae Marga : Lantana L
Jenis : Lantana camara L. (Jumriani, 2017) II.1.1.2 Nama Daerah
Makassar : Tembelekan
Bulukumba : Patiwala (Jumriani, 2017) II.1.1.3 Morfologi tumbuhan
Daun tembelekan (lantana camara L.) merupakan tumbuhan perdu, tegak atau agak memanjat, tingginya 0,5 – 4 m, berbau. Batang berkayu, bercabang banyak, ranting berbentuk segi empat, berduri, berambut. Daun tunggal, berhadapan, bundar telur, ujung runcing, pangkal tumpul, tepi
bergerigi, pertulangan menyirip, kedua permukaan berambut, permukaan daun kasar, panjang 5 – 8 cm, lebar 3,5 – 5 cm, warnanya hijau tua.
Perbungaan majemuk bentuk bulir, mahkota bagian dalam berambut, warnanya putih, merah muda, jingga, kuning, dan sebagaianya. Buah buni, tangkai berambut, masih muda hijau, bila masak akan mengkilap. Biji bulat, hitam. Akar tunggang, bulat, kuning kecoklatan (Dalimarth, 2006).
II.1.1.4 Kandungan kimia
Daunnya mengandung minyak atsiri, disamping itu alkaloid, saponin, flavanoid, dan tanin (Dalimarth, 2006).
II.1.1.5 Kegunaan
Bagi masyarakat bulukumba, daun tembelekan (lantana camara L.) berguna untuk menyembuhkan luka, mempercepat proses koagulasi.
Disamping itu, tumbuhan ini juga berkhasiat menghilangkan gatal, menghilangkan bengkak, dan sebagai perangsang muntah (Dalimarth , 2006).
II.1.2 Chromolaena odorata II.1.2.1 Klasifikasi tumbuhan Kerajaan : Plantae
Divisi : Spermatophyta Anak Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Dicotyledoneae/ Magnoliopsida Anak Kelas : Dialypetalae/ Asteridae
Bangsa : Asterales
Suku : Asteraceae Marga : Chromolaena
Jenis : Chromolaena odorata (Tjitrosoedirdjo, 1991) II.1.2.2 Nama daerah
Jawa barat : Babanjaran Jawa tengah : Kinyiru Makassar : Kopasanda
Flores : Sensus (Tjitrosemito,1998) II.1.2.3 Morfologi tumbuhan
Chromolaena odorata adalah tumbuhan memiliki bentuk daun oval dan bagian bawahnya lebih lebar, makin ke ujung makin runcing. Panjang daun 6–10 cm dan lebarnya 3–6 cm. Tepi daun bergerigi, menghadap ke pangkal, letaknya berhadapan, daun berwarna merah kecoklatan waktu muda dan hijau pada waktu dewasa. Bentuk daun bulat telur dengan ujung meruncing, bergerigi kasar atau hampir rata, permukaan daun berbulu halus, pada waktu masih muda daun berbau jika diremas. Terdiri dari 3–5 bongkol bunga yang masing-masing terdapat 30–36 unit bunga. Bunga berukutan kecil, mahkota bunga berwarna putih keunguan. Waktu berbunga serentak pada musim kemarau selama 3–4 minggu, dapat tumbuh pada ketinggian 1.000-2.800 mdpl, sedangkan di Indonesia banyak ditemukan di dataran rendah seperti di perkebunan (Tjitrosoedirdjo, 1991).
II.1.2.4 Kandungan Kimia
Daun kopasanda (Chromolaena odorata) mengandung pryrrolizidine alkaloids yang bersifat racun. Kandungan senyawa ini menyebabkan tanaman berbau menusuk dan berasa pahit, sehingga bersifat repellent dan juga mengandung alelopati (Tjitrosemito, 1998).
II.1.2.5 Kegunaan
Masyarakan bulukumba memanfaatkan sebagai obat luka.
II.1.3 Cassia alata L.
II.1.3.1 Klasifikasi tumbuhan Kerajaan : Plantae
Divisi : Spermatophyta Anak Divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae/ Magnoliopsida Anak kelas : Sympetalae/ Rosidae
Bangsa : Fabales Suku : Fabaceae Marga : Cassia
Jenis : Cassia alata L. (Tantiado, 2012) II.1.3.2 Nama Daerah
Makassar : Kiti-kiti balanda
Bulukumba : Kiti-kiti balanda (Tantiado, 2012)
II.1.3.3 Morfologi tumbuhan
Cassia alata L. adalah tumbuhan perdu dengan sistem perakaran tunggang. Batang berkayu, berbentuk jorong sampai bulat telur sungsang, menyirip genap, berbentuk bulat panjang 5-15 cm dan lebar 2,5-9 cm, dengan ujung tumpul, pangkal daun membulat, tepi daun rata, pertulangan daun menyirip, daun majemuk menyirip genap yang berpasang pasangan sebanyak 5-12 baris. Bunga majemuk, berbentuk tandan dan berwarna kuning. Buah polong, pada saat masih muda berwarna hijau, namun pada saat sudah tua warnanya hitam kecokelatan, biji berbentuk segi tiga lancip dan pipih. Penyebarannya mulai dari dataran rendah sampai daerah pegunungan (Deore, 2013).
II.1.3.4 Kandungan kimia
Daun kiti-kiti balanda (Cassia alata L.) memiliki kandungan antimikrobia seperti tanin, alkaloid dan flavonoid, mengobati penyakit panu.
Jenis tumbuhan tersebut dapat tumbuh secara alamiah. Kandungan kimia yang terdapat di dalamnya seperti rein aloe emodina, rein aloe emodina diantron, rein aloe emodina asam krisofanat (dehidroksi metil antroquinone) dan tannin. Selain itu, alkaloida, flavonoida, dan antrakuinon juga terdapat di dalamnya. Tiga kandungan antrakuinon memiliki sifat antifungi yang bekerja secara fungistatik dengan cara menghambat pertumbuhan hifa jamur, sehingga pertumbuhan jamur terhenti (Deore, 2013).
II.1.3.5 Kegunaan
Masyarakat bulukumba memanfaatkan sebagai obat panu, obat kurap, kudis, panu, eksim, dan radang kulit bertukak.
II.1.4 Eclipta prostata L.
II.1.4.1 Klasifikasi tumbuhan Kerajaan : Plantae
Divisi : Spermatophyta Anak Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Dicotyledoneae/ Magnoliopsida Anak kelas : Dialypetalae/ Asteridae
Bangsa : Asterales Suku : Asteraceae Marga : Eclipta
Jenis : Eclipta prostata L. (Cronquist, 1981) II.1.4.2 Nama daerah
Maluku : Daun tinta Bulukumba : Urang-aring Jawa : Urang-aring Makassar : Urang-aring
Madura : Telenteyan (Kasahara, 1995) II.1.4.3 Morfologi tumbuhan
Tumbuhan urang-aring (Eclipta prostata L.) berupa herba tahunan atau menahun, tegak-condong atau merayap, berakar, memiliki banyak
cabang, tinggi sekitar 1 m. Batangnya agak membulat, berambut halus warna putih. daun berhadapan, pangkan menyempit, ujung runcing atau gundul, bulat telur memanjang, bergerigi atau hampir rata. Bunga berbentuk bongkol agak membulat, tangkai karangan tipis, menebal dibagian ujung, berambut 0,5-7 cm. Mahkota bunga berwarna putih, bunga tepi berbentuk tabung tipis. Tabung kepala sari mula-mula berwarna kuning hingga warna tua. Tangkai putik dengan dua cabang tumpul. Buah putik keras memanjang hingga bentuk baji pendek. Penyebaran di daerah pada ketinggian 1 hingga 1500 di atas permukaan laut, juga di tempat basah, padang rumput, sawah hingga perkebunan (Lily, 1980)
II.1.4.4 Kandungan kimia
Mengandung alkaliod, nikotin dan ekliptin, selain itu juga mengandung asam fenolik karboksilat sederhana, flavanoid, wedelakton dan demetilwedelakton (Lily, 1980)
II.1.4.5 Kegunaan
Masyarakan bulukumba memanfaatkan sebagai obat gatal selain itu, tumbuhan ini juga berguna untuk mengobati sesak napas, sakit kepala, penyubur rambut, penyakit gigi, bronkitis, gangguan haid dan semua bagian tanaman juga bisa digunakan untuk mengobati eksim dan nyeri hati (Lily, 1980)
II.1.5 Jatropha multifida L.
II.1.5.1 Klasifikasi tumbuhan Kerajaan : Plantae
Divisi : Spermatophyta Anak Divisi : Gymnospermae
Kelas : Dicotyledoneae/ Magnoliopsida Anak kelas : Dialypetalae/ Rosidae
Bangsa : Euphorbiales Suku : Euphorbiaceae Marga : Jatropha
Jenis : Jatropha multifida L.(Cronquist, 1981) II.1.5.2 Nama Daerah
Jawa : Jarak cina, pohon yodium, jarak tintir Sunda : Jarak gurita
Ternate : Balacai batai
Bulukumba : Yodium basah (Hariana, 2006) II.1.5.3 Morfologi Tumbuhan
Pohon yodium ini merupakan tumbuhan tahunan, berbentuk semak, dengan akar tunggang. Tinggi tanaman bisa sampai sekitar 2 meter dengan batang bulat, berkayu, pangkalnya membesar, bergetah dan tampak jelas bekas menempelnya daun. Ketika masih muda batang berwarna hijau dan setelah tua menjadi putih kehijauan. Jika masih muda bentuk gerigi diujung daun belum nampak. Pohon Yodium berdaun tunggal berwarna hijau dan
tersebar, berbentuk hati dengan ujungnya runcing, pangkal membulat, panjangnya 15-20 cm, lebar 2,5-4 cm, bercangap, pertulangan menjari dan tepi rata. Berbunga majemuk berbentuk malai, bertangkai, tumbuh di ujung cabang, jika masih muda berwarna hijau, setelah tua berwarna coklat.
Kelopak warna merah. Bijinya bulat, jika masih muda berwarna putih, dan setelah itu menjadi coklat. Dapat tumbuh pada dataran rendah maupun dataran tinggi (Odugbemi, 2008).
II.1.5.4 Kandungan Kimia
Mengandung flavanoid, alkaloid, saponin dan tanin (Hariana, 2006) II.1.5.5 Kegunaan
Masyarakat bulukumba memanfaatkan untuk mengobati luka, selain itu ini juga digunakan untuk menurunkan bengkak, terkilir, patah tulang (Odugbemi, 2008).
II.1.6 Stachytarpheta jamaicensis L.
III.1.6.1 Klasifikasi tumbuhan Kerajaan : Plantae
Divisi : Spermatophyta Anak divisi : Magnoliophyta
Kelas : Dicotyledoneae/ Magnoliopsida Anak Kelas : Dialypetalae/ Asteridae
Bangsa : Lamiales Suku : Verbenaceae Marga : Stachytarpheta
Jenis : Stachytarpheta jamaicensis (L.) Vahl (Backer, 1965; Steenis, 1997)
II.1.6.2 Nama Daerah
Sunda : Jarongan, sangketan Bulukumba : Barakka
Jawa : Biron
Sulawesi : Sangko hidung
Maluku : Rai-rai (Backer, 1965) II.1.6.3 Morfologi Tumbuhan
Stachytarpheta jamaicensis (L.) Vahl adalah tumbuhan mencapai 1m dan tumbuh melebar sampai 2 m. Batang mula-mula tegak kemudian bercabang-cabang, batang utama berwarna hijau, bentuk batang bersegi empat, cabang batang yang dekat dengan tanah berwarna hijau keabu- abuan sampai hijau kecoklatan. Daun tunggal berhadapan bentuk helaian daun bulat telur sampai lanset, pertulangan daun menyirip, dan sedikit melengkung diujung tulang daun. Panjang daun 1 - 4,5 inchi dan lebar daun 0,75 – 2,5 inchi, pangkal runcing, tepi bergerigi, ujung runcing sampai meruncing. Bunga majemuk bulir, panjang ibu tangkai bunga sampai 30 cm.
Setiap bunga duduk pada ibu tangkai bunga dengan tangkai bunga yang sangat pendek. Ibu tangkai bunga berbentuk panjang dan melengkung.
Kelopak bunga terdiri atas lima helai berbentuk tabung yang menempel pada ibu tangkai bunga, berwarna hijau. Mahkota bunga berlekatan membentuk tabung mahkota, berwarna biru-ungu, dengan bagian tengah tabung
berwarna putih, ujung tabung mahkota bunga terbagi menjadi 5 lobus (cuping). Tinggi tabung 0,5–1,0 cm. Benang sari 5 berseling dengan lobusnya, kepala sari berwarna kuning kecokelatan. Putik berjumlah 1, terletak di bagian tengah helaian mahkota bunga. Berbunga sepanjang tahun (Brown, 2012).
II.1.6.4 Kandungan kimia
Daun pecut kuda (Stachytarpheta jamaicensis (L.) Vahl ) mengandung alkaloid, tanin, senyawa folifenol (asam galat), flavanoid quersitrin, ksanthorhamnin, asam-asam organik palmitat dan oleat, asam lanoat, terpenoid eufosterol, tarakserol serta kautszhuk (Redaksi agromedia, 2008).
II.1.6.5 Kegunaan
Masyarakat bulukumba menggunakannya sebagai obat luka dan gatal-gatal. Tanaman ini juga berkhasiat sebagai penghilang nyeri, obat lambung, obat cacing, obat bengkak-bengkak, pelancar air seni, penurun tekanan darah, pencahar, pelancar laktasi, penenang, obat sakit perut, dan obat sesak nafas (Schapoval, 1998).
II.1.7 Ageratum conyzoides L.
II.1.7.1. Klasifikasi tumbuhan Kerajaan : Plantae
Divisi : Spermatophyta Anak Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Dicotyledoneae/ Magnoliopsida Anak Kelas : Sympetalae/ Asteridae
Bangsa : Asterales Suku : Asteraceae Marga : Ageratum
Jenis : Ageratum conyzoides L. (Hidayat, 2015) II.1.7.2 Nama Daerah
Sunda : Bandotan, wedusan
Sumatra : Rumput tahi ayam, daun tombak Jawa : Bandotan, berokan, wedusan
Sulawesi : Dan dawet, lawet, sopi (Redaksi agromedia, 2008) II.1.7.3 Morfologi tumbuhan
Ageratum conyzoides L. tumbuh di ladang tandus, padang rumput juga kebun. Tumbuhan terna semusim, tumbuh tegak atau bagian bawahnya berbaring tinggi 30-990 cm, dan bercabang. Batang bulat, berambut panjang dan akan mengeluarkan akar saat menyentuh tanah. Daun bulat telur dengan pangkal membulat, bertangkai, ujung runcing, tepi bergerigi, panjang 1-10 cm, lebar 0,5-6 cm, dan tumbuh berhadapan atau bersilangan. Kedua permukaan daun berambut panjang, memiliki kelenjar yang terletak di permukaan bawah daun, dan berwarna hijau. Bunga majemuk berkumpul tiga atau lebih, berbentuk malai rata, keluar dari ujung tangkai, warna putih dan ungu, panjang bonggol bunga antara 6-8 mm, dan tangkai berambut.
Buah berwarna hitam dan berbentuk kecil (Redaksi agromedia, 2008).
II.1.7.4 Kandungan kimia
Mengandung asam amino, organacid, pactic substance, minyak atsiri, kumarin, ageratochromene, friedelin, ß-sitosterol, stigmasterol, tanin, sulfur, dan pottasium klorida. Akar mengandung minyak atsiri, alkaloid, dan kumarin (Redaksi agromedia, 2008).
II.1.7.5 Kegunaan
Masyarakat bulukumba menggunakan tumbukan ini untuk mengurangi rasa gatal-gatal pada kulit. Tumbuhan ini juga berkhasiat sebagai stimulan, tonik, pereda demam, antitoksin, menghilangkan pembengkakan, menghentikan pendarahan, memperlancar haid (Redaksi agromedia, 2008).
II.2 Uraian mikroba
II.2.1 Staphylococcus aureus II.2.1.1 Klasifikasi bakteri Domain : Bacteria Kerajaan : Eubacteria Filum : Firmicutes Kelas : Bacilli Ordo : Bacillales
Famili : Staphylococcaceae Genus : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus aureus (Rosenbach,1884)
Gambar 1. Bakteri Staphylococcus aureus (Kenneth, 2008)
II.2.1.2 Morfologi bakteri
Bakteri gram positif yang menghasilkan pigmen kuning, bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 µm.
Staphylococcus aureus tumbuh dengan optimum pada suhu 37°C dengan waktu pembelahan 0,47 jam. S. aureus merupakan mikroflora normal manusia. Bakteri ini biasanya terdapat pada saluran pernapasan atas dan kulit. Keberadaan Staphylococcus aureus pada saluran pernapasan atas dan kulit pada individu jarang menyebabkan penyakit, individu sehat biasanya hanya berperan sebagai karier. Infeksi serius akan terjadi ketika resistensi inang melemah karena adanya perubahan hormon; adanya penyakit, luka, atau perlakuan menggunakan steroid atau obat lain yang memengaruhi imunitas sehingga terjadi pelemahan inang (Madigan, 2008 ; Prescott, 2002).
Staphylococcus aureus membentuk paket-paket sel yang pipih, bakteri ini sering menghuni kulit, saluran pernafasan dan saluran pencernaan. Staphylococcus hidup dengan subur dalam makanan dan dapat mengeluarkan toksin (Djide, 2008) Bakteri ini juga ditemukan di udara dan lingkungan sekitar. Staphylococcus aureus yang patogen dapat
menyebabkan radang di kulit atau di bawah kulit dan menimbulkan bisul yang bernanah. Bisul berisi nanah ini disebut abses, abses dapat menembus masuk ke dalam darah bisa menimbulkan sepsis dan menimbulkan abses di tempat lain (Adam, 1995). Staphylococcus aureus merupakan salah satu bakteri yang dapat memproduksi enzim β-laktamase. Enzim ini akan menghilangkan daya antibakteri terutama golongan penisilin seperti metisilin, oksasilin, penisilin G dan ampisilin. Adanya enzim tersebut akan merusak cincin β-laktam sehingga antibiotik menjadi tidak aktif. Strain S. aureus yang telah resisten terhadap antibiotik metisilin disebut Metichilin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) (Sulistyaningsih, 2010)
II.2.2 Escherichia coli II.2.2.1 Klasifikasi mikroba Kingdom : Eubacteria Divisio : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria Ordo : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Esherichia coli (Todar, 2002)
Gambar 2. Bakteri Esherichia coli (Todar, 2002)
Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif yang normalnya hidup sebagai flora normal di sistem pencernaan manusia, dan juga bisa menjadi patogen yang menyebabkan infeksi, berbentuk batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 µm, diameter 0,7 µm, lebar 0,4-0,7 µm dan bersifat anaerob fakultatif. Escherichia coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus dengan tepi yang nyata (Smith, 1988 ; Jawetz, 1996) Escherichia coli adalah golongan bakteri mesofilik yaitu bakteri yang suhu pertumbuhan optimumnya 15-45°C dan dapat hidup pada pH 5,5-8. Dinding sel bakteri gram negatif tersusun atas membran luar, peptidoglikan dan membran dalam. Peptidoglikan yang terkandung dalam bakteri gram negatif memiliki struktur yang lebih kompleks dibandingkan gram positif. Membran luarnya terdiri dari lipid, liposakarida dan protein. Peptidoglikan berfungsi mencegah sel lisis, menyebabkan sel kaku dan memberi bentuk kepada sel (Purwoko, 2007).
II.3 Metode Ekstraksi
Ekstraksi merupakan salah satu teknik pemisahan untuk memisahkan atau menarik satu atau lebih komponen senyawa (analit) dari suatu sampel dengan menggunakan pelarut tertentu yang sesuai. Pada ekstraksi ini,
prinsip pemisahan didasarkan pada kemampuan atau daya larut analit dalam pelarut tertentu, dengan demikian pelarut yang digunakan harus mampu menarik kompunen analit dari sampel secara maksimal (Leba, 2017).
II.3.1 Maserasi
Maserasi merupakan salah satu cara ekstraksi yang paling sederhana.
Proses ini dilakukan dengan cara merendam sampel pada suhu kamar menggunakan pelarut yang sesuai sehingga dapat melarutkan analit dalam sampel. Pelarut akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Waktu maserasi umumnya 3-5 hari sambil diaduk sesekali untuk mempercepat proses pelarutan analit (Leba, 2017).
II.3.2 Remaserasi
Remaserasi merupakan metode ekstraksi yang terjadi pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya. Pelarut kedua ditambahkan dengan perbandingan 1:5 (Leba, 2017).
II.3.3 Perkolasi
Perkolasi merupakan ekstraksi yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari secara perlahan dalam wadah silinder atau kerucut (perkolator). Pada ekstraksi jenis ini, pelarut ditambahkan secara terus
menerus dengan menggunakan pola penetesan pelarut, proses ini dilakukan hingga analit dalam sampel terekstraksi sempurna (Leba, 2017).
Gambar 3. Alat perkolasi (Leba, 2017)
II.3.4 Sokletasi
Sokletasi merupakan salah satu jenis ekstraksi menggunakan alat soklet. Pada ekstraksi ini pelarut dan sampel ditempatkan secara terpisah.
Hal ini dilakukan dengan cara pemanasan pelarut. Uap pelarut yang dihasilkan mengalami pendinginan dalam kondensor dan secara kontinyu akan membasahi sampel dan secara teratur pelarut dimasukkan kembali kedalam labu dengan membawa analit. Pelarut yang digunakan diuapkan kembali dan dipisahkan dari analit (Leba, 2017).
Gambar 4. Alat sokletasi (Leba, 2017)
II.4 Antibakteri
II.4.1 Pengertian antibakteri
Antibakteri adalah bahan atau obat yang digunakan untuk mengatasi infeksi bakteri pada manusia atau mengendalikan pertumbuhan bakteri yang bersifat merugikan. Pengendalian pertumbuhan mikroorganisme bertujuan untuk mencegah penyebaran penyakit dan infeksi, membasmi mikroorganisme pada inang yang terinfeksi, dan mencegah pembusukan serta perusakan bahan oleh mikroorganisme. Hal ini harus bersifat toksik terhadap mikroorganisme penyebab penyakit tetapi relatif tidak toksik terhadap jasad atau inang (Djide, 2014).
II.4.2 Sifat antibakteri
1. Bakteriostatik adalah zat atau bahan yang dapat menghambat pertumbuhan tetapi tidak membunuh. Senyawa bakterostatik seringkali menghambat sintesis protein atau mengikat ribosom. Hal ini ditunjukkan dengan penambahan antimikroba pada kultur mikroba yang berada pada fase logaritmik. Setelah penambahan zat antimikrobia pada fase logaritmik didapatkan jumlah sel total maupun jumlah sel hidup adalah tetap(Djide, 2014)
2. Bakteriosidal zat atau bahan yang dapat membunuh sel tetapi tidak terjadi lisis sel atau pecah sel. Hal ini ditunjukkan dengan penambahan antimikroba pada kultur mikroba yang berada pada fase logaritmik. Setelah penambahan zat antimikrobia pada fase logaritmik
didapatkan jumlah sel total tetap sedangkan jumlah sel hidup menurun (Djide, 2014).
3. Bakteriolitik menyebabkan sel menjadi lisis atau pecah sel sehingga jumlah sel berkurang atau terjadi kekeruhan setelah penambahan antimikrobia. Hal ini ditunjukkan dengan penambahan antimikrobia pada kultur mikrobia yang berada pada fase logaritmik. Setelah penambahan zat antimikrobia pada fase logaritmik, jumlah sel total maupun jumlah sel hidup menurun.
II.4.3 Mekanisme Antibakteri
1. Menghambat pembentukan enzim
Bakteri pada umumnya memerlukan para amino benzoic acid (PABA) untuk membentuk asam folat dan mensintesis purin dan pirimidin.
Purin dan pirimidin adalah prekursor pembentukan rantai DNA dan RNA. Zat antibakteri ini bekerja dengan memblok enzim tertentu agar tidak terbentuk asam folat dan sel-sel tidak akan tumbuh ataupun membelah (Pelczar, 1988).
2. Menghambat sintesis dinding sel
Peptidoglikan merupakan dinding sel yang ada pada bakteri. Struktur dinding sel dapat di ubah dengan cara menghambat reaksi pembentukannya atau mengubahnya setelah selesai terbentuk.
Antibakteri dapat menghambat aktivitas enzim, contohnya enzim transpeptidase yang dapat menimbulkan kerusakan dinding sel yang berakibat sel mengalami lisis (Pelczar, 1988).
3. Perubahan permeabilitas membran sitoplasma
Membran sitoplasma akan mempertahankan bahan tertentu yang ada didalam sel dan mengatur aliran keluar masuknya bahan-bahan lain.
Jika membran ini rusak, akan menyebabkan keluarnya bahan berupa makromolekul dan ion dari sel secara tidak teratur yang kemudian sel akan menjadi rusak (Pelczar, 1988).
4. Menghambat sintesis protein
Ribosom adalah salah satu organel sel yang berfungsi sebagai tempat sintesis protein. Antibakteri akan mengganggu organel ini dengan cara berikatan dengan ribosom 30S sehingga salah menerjemahkan mRNA dan menghasilkan rantai polipeptida yang abnormal. Selain itu, zat antibakteri juga berikatan dengan ribosom 50S yang dapat menghambat ikatan asam amino baru pada rantai peptida sehingga mengganggu proses translasi (Pelczar, 1988).
5. Menghambat sintesis asam nukleat
DNA dan RNA sangat penting dalam kehidupan sel bakteri.
Penghambatan sintesis asam nukleat akan berpengaruh pada proses transkripsi dan translasi mikroorganisme sehingga kerja enzim DNA girase dan RNA polimerase, tampa adanya enzim-enzim ini bakteri tidak dapat berkembang biak dan akan mati (Pelczar, 1988).
II.5 Uji Aktivitas Antibakteri 1. Metode difusi
Difusi merupakan proses perpindahan molekul atau berpindahnya suatu zat dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah. Beberapa metode difusi yang biasa digunakan dalam penetapan potensi antibakteri diantaranya :
a. Metode lempeng bujur sangkar
Metode ini menggunakan lempeng yang terbuka sehingga mudah untuk terkontaminasi bakteri, untuk itu penggunaan penyaring udara (Laminar Air Flow) saat mengerjakan sangat membantu mengurangi penyebab kontaminasi bakteri. Pada metode ini, ketebalan medium, homogennya medium hingga kondisi lingkungan sangat mempengaruhi proses pertumbuhan bakteri yang digunakan pada penetapan potensi akan mendapatkan hasil yang sama, sehingga efek yang muncul atau besarnya zona hambat tergantung dari jumlah dosis uji yang digunakan (Djide, 2008).
b. Metode lempeng pada cawan petri
Metode ini memiliki keuntungan karena menggunakan beberapa cawan petri untuk menempatkan inokulum, maka kemungkinan kontaminasi akan lebih kecil dibandingkan dengan menggunakan lempeng bujur sangkar. Disamping itu juga ada kerugian yaitu kondisi setiap cawan petri akan berlainan karena adanya variasi inokulum dalam beberapa cawan petri. Kondisi tersebut akan mempengaruhi
difusi antibiotika yang diuji dari pencadang ke medium agar sekitarnya (Djide, 2008).
c. Pencadang atau reservoir
Metode ini menggunakan silinder dari kaca, logam tahan karat, silinder kapiler, cetak lubang (punche hole), cakram kertas (paper disc). Penggunaan pencadang tersebut memiliki kekurangan dan kelebihan masing-masing. Penggunaan silinder gelas dan logam tahan karat sebagai pencadang mempunyai keuntungan yaitu jumlah larutan uji di dalam silinder dapat diperbanyak untuk menjamin ketersediaannya. Jumlah larutan antibiotika yang digunakan biasanya diatur sesuai kapasitas. Pencadang tersebut mempunyai ukuran diameter luas 8 mm, diameter dalam 6 mm dan tinggi 10 mm. Jika menggunakan cakram kertas (paper disc) maka harus disesuaikan dengan ketebalan serta jari-jari kertas cakram tersebut. Tetapi memiliki kerugian karena adanya heterogenitas komposisi serat kertas, sehingga sebagian zat akan terikat pada kertas dan diameter daerah hambatan yang terjadi akan bervariasi (Djide, 2008).
II.6 Klt- Bioautografi
Bioautografi merupakan suatu metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis tipis( KLT), hal ini didasarkan atas teknik difusi agar, dimana senyawa antibakterinya dipindahkan dari lapisan KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan dengan bakteri uji lalu diinkubasi, dari hasil inkubasi akan terlihat zona
hambatan disekeliling noda dari KLT yang telah ditempelkan pada media agar. Zona hambatan tersebut ditampakkan oleh aktivitas senyawa aktif yang terdapat di dalam bahan yang diperiksa terhadap pertumbuhan bakteri (Djide, 2008). Metode bioautografi ini juga cepat, mudah untuk dilakukan, biaya yang murah karena hanya membutuhkan peralatan sederhana dan interpretasi hasilnya relatif mudah dan akurat. (Stahl, 1985) Bioautografi dalam uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan berbagai metode, yaitu bioautografi langsung, bioautografi kontak, bioautografi agar overlay/pencelupan.
a. Bioautografi langsung
Bioautografi langsung dimana mikroorganismenya tumbuh secara langsung di atas lempeng Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Suspensi mikroorganisme uji yang peka dalam medium cair disemprotkan pada permukaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang telah dihilangkan sisa- sisa eluen yang menempel pada lempeng kromatogram. Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengeringan kromatogram dilakukan secara hati-hati dengan menggunakan “hair dryer” untuk menghilangkan sisa eluen. Zona hambat yang terbentuk divisualisasikan dengan menyemprot lempeng kromatogram dengan tetrazolium dye (Djide, 2008).
b. Bioautografi kontak
Bioautografi kontak dilakukan dengan meletakkan lempengan kromatogram hasil elusi dari senyawa uji di atas media padat yang telah
diinokulasi dengan bakteri uji. Prinsip kerja dari metode ini didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Lempeng kromatografi ini disemprotkan di atas permukaan medium nutrient agar yang telah diinokulasikan dengan mikroorganisme yang sensitif terhadap senyawa antimikroba yang dianalisa. Setelah 15- 30 menit lempeng kromatografi kemudian dipindahkan dari permukaan medium. Senyawa antibakteri yang telah berdifusi dari kromatogram ke dalam medium agar akan menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi pada waktu dan tempat temperatur yang tepat, hingga noda yang menghambat tampak pada permukaan (Djide, 2008). Adanya aktivitas antibakteri dari senyawa uji ditandai dengan adanya zona bening.
c. Bioautografi agar overlay/ pencelupan
Bioautografi agar overlay dilakukan dengan lempeng kromatografi yang telah dielusi diletakkan dalam cawan petri sehingga permukaan tertutupi oleh medium agar yang berfungsi sebagai based layer. Setelah medium agar memadat, selanjutnya dituang medium agar yang telah diinokulasi dengan mikroorganisme yang berfungsi sebagai seed layer dan diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai (Djide, 2008).
II.7 Pemisahan Senyawa dengan Kromatografi II.7.1 Kromatografi lapis tipis
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan metode kromatografi dengan cara pemisahan yang baik, sederhana, penggunaannya telah
meluas, khususnya untuk kegunaan analisis kualitatif. KLT dapat digunakan untuk memisahkan berbagai senyawa seperti ion-ion anorganik, senyawa organik baik yang terdapat di alam dan senyawa organik sintetik (Gritter, 1991). Kromatografi juga merupakan suatu teknik yang digunakan untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase (Khopkar, 2010) Pada kromatografi lapi tipis, lapisan memiliki ketebalan sekitar 0,1 sampai 0,3 mm zat padat adsorben pada lempeng kaca, plastik, atau aluminium. Fase diam yang digunakan adalah alumina, silika gel dan selulosa. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar, 2007 ; Rohman, 2009).
Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis ialah karena dapat menghasilkan pemisahan yang baik, tingkat kepekaan yang tinggi, dapat dikerjakan dengan cepat karena menggunakan peralatan yang sederhana.
(Adnan, 1997).
Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf (Retardation factor) . Nilai Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak yang ditempuh senyawa dengan jarak yang ditempuh eluen (Gandjar, 2007).
II.7.2. Kromatografi Kolom
Senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi kolom memiliki mekanisme yang berkaitan dengan perbedaan antara gaya-gaya antar molekul dalam sampel. Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda- beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair-padat. Substrat padat (adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair. Fase bergeraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Apabila mengalirkan cairan ( elutor ) secara kontinyu, maka yang pertama–tama dihanyutkan elutor ialah komponen yang paling lemah terikat kepada adsorben. Komponen–komponen lainnya akan dihanyutkan menurut urutan afinitasnya terhadap adsorben, sehingga terjadi pemisahan dari komponen-komponen tersebut (Rubiyanto, 2017).
II.7.3 Kromatografi Cair Vakum
Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum. Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksida (Ghisalberti, 2008).
II.7.4 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Kromatografi lapis tipis preparatif merupakan metode yang relatif sederhana, murah, cepat dan memiliki daya pisah yang cukup baik. Metode ini tidak dianjurkan untuk pemisahan awal, tetapi digunakan untuk pemurniaan akhir dalam prosedur isolasi senyawa (Harborne, 1987). Hal yang harus diperhatikan pada Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) adalah pembuatan pelat kaca dengan penyerap. Pelat kaca harus dibersikan hati-hati dengan aseton untuk menghilangkan lemak. Kemudian bubur silica gel atau penyerap lainnya dalam air harus dikocok kuat-kuat selam jangka waktu tertentu, Setelah pembuatan, pelat harus dikeringkan pada suhu kamar dan kemudian diaktifkan dengan pemanasan pada suhu 100-110⁰C selama 30 menit (Harborne, 1987).
II.8 Uji Kemurnian Senyawa II.8.1 Klt 2 dimensi
Uji kemurnian bertujuan untuk melihat apakah hasil isolasi berhasil.
Metode yang dapat digunakan untuk uji kemurnian ini adalah penggunaan kromatografi lapis tipis dua dimensi. Penggunaan metode ini sering digunakan untuk menguji kemurnian dari suatu senyawa, dimana senyawa yang dikatakan murni adalah senyawa yang menghasilkan satu bercak setelah dillakukan proses elusi menggunakan eluen tertentu. Menurut (Giddings, 1984) langkah dari metode ini yaitu menotolkan sampel pada bagian ujung fase diam dan dilakukan proses elusi. Selanjutnya lempeng
diangkat, dikeringkan, diputar 90°C, dan dilakukan elusi kembali (Waksmundzka-Hajnos, 2008).
II.9 Karakterisasi Senyawa II.9.1 Spektrofotometer UV-Vis II.9.1.1 Prinsip Dasar
Spekrofotometri merupakan metode analisa kualitatif dan kuantitatif yang didasarkan pada interaksi antara molekul terlarut dengan energi yang dipancarkan, energi ini akan menyebabkan transisi elektron. Absorbsi sinar tampak atau sinar ultra violet oleh molekul menyebabkan perpindahan elektron ketingkat energi yang lebih tinggi (Khopkar, 2010).
Sinar ultraviolet (UV) berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampak (VIS) berada pada panjang gelombang 400-800 nm. Spektrum UV disebut juga spektrum elektronik karena terjadi sebagai hasil interaksi radiasi UV terhadap molekul sehingga mengakibatkan molekul tersebut mengalami transisi elektronik. Apabila radiasi elektromagnetik dikenakan pada suatu molekul atau atom, maka sebagian dari radiasi tersebut diserap oleh molekul atau atom tersebut sesuai dengan strukturnya yang memiliki gugus kromofor (Day, 2002 ; Ewing, 1975).
Cahaya yang dilewatkan dari monokromartor pada bagian sampel yang homogen dapat dituliskan :
Io = Ia+Ir+It
Keterangan : Io= Intensitas cahaya yang datang Ia= Intensitas cahaya yang diabsorbsi
Ir= Intensitas cahaya yang dipantulkan It= Intensitas cahaya yang diteruskan
Hukum Lambert Bear adalah hubungan linearitas antara absorban dengan konsentrasi larutan analit, yakni (Ewing, 1975).
Log (Io/It)= A= a.b.c
Dimana : Io = Intensitas cahaya yang masuk It = Intensitas cahaya yang diteruskan A = Absorbansi
a = Absorbsivitas b = Tebal kuvet
c = Konsentrasi zat terlarut.
II.9.1.2 Instrumen Spektrofotometer UV-VIS
Gambar 5. Instrumen spektrofotometer uv-vis (Dachriyanus, 2004)
Sebagai sumber cahaya / lampu biasanya digunakan lampu hidrogen atau deuterium untuk pengukuran uv dan lampu tungsten untuk pengukuran pada cahaya tampak. Panjang gelombang dari sumber cahaya akan dibagi oleh pemisah panjang gelombang (wavelength separator) seperti prisma atau monokromator. Spektrum didapatkan dengan cara scanning oleh wavelength separator sedangkan pengukuran kuantitatif bisa dibuat dari spektrum atau
pada panjang gelombang tertentu. Ketika suatu atom atau molekul menyerap cahaya maka energi tersebut akan menyebabkan tereksitasinya elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Tipe eksitasi tergantung pada panjang gelombang cahaya yang diserap. Sinar ultraviolet dan sinar tampak akan menyebabkan elektron tereksitasi ke orbital yang lebih tinggi.
Sistem yang bertanggung jawab terhadap absorbsi cahaya disebut dengan kromofor (Dachriyanus, 2004).
Beberapa istilah penting yang harus diketahui diantaranya :
1. Kromofor; merupakan gugus tak jenuh (pada ikatan kovalen) yang bertanggung jawab terhadap terjadinya absorbsi elektronik (misalnya C=C, C=O, dan NO2).
2. Auksokrom; merupakan gugus jenuh dengan adanya elektron bebas (tidak terikat), dimana jika gugus ini bergabung dengan kromofor, akan mempengaruhi panjang gelombang dan intensitas absorban.
3. Pergeseran Batokromik; merupakan pergeseran absorban ke daerah panjang gelombang yang lebih panjang karena adanya substitusi atau efek pelarut.
4. Pergeseran Hipsokromik; merupakan pergeseran absorban ke daerah panjang gelombang yang lebih pendek karena adanya substitusi atau efek pelarut.
5. Efek Hiperkromik; merupakan peningkatan intensitas absorban.
6. Efek Hipokromik; merupakan penurunan intensitas absorban (Dachriyanus, 2004).
II.9.2 Spektrofotometer FT – IR (Fourier Transform Infra Red) II.9.2.1 Prinsip dasar
Spektroskopi FT-IR adalah interaksi energi dengan suatu materi yang didasarkan pada vibrasi suatu molekul. Spektroskopi FT-IR berfokus pada radiasi elektromagnetik pada rentang frekuensi 400-4000cm-1, di mana cm-1 yang dikenal sebagai wavenumber (1/wavelength), yang merupakan ukuran unit untuk frekuensi. Untuk menghasilkan spektrum inframerah, radiasi yang mengandung semua frekuensi di wilayah IR dilewatkan melalui sampel.
Mereka frekuensi yang diserap muncul sebagai penurunan sinyal yang terdeteksi. Informasi ini ditampilkan sebagai spektrum radiasi dari % yang ditransmisikan (Dachriyanus, 2004).
Setiap molekul memiliki harga energi tertentu. Bila suatu senyawa menyerap energi dari sinar IR maka tingkatan energi didalam molekul itu akan tereksitasi ketingkatan energi yang lebih tinggi. Sesuai dengan energi yang diserap maka yang akan terjadi pada molekul itu adalah perubahan energi vibrasi yang diikuti dengan perubahan energi rotasi. Interksi ini terjadi dengan syarat adanya perubahan momen dipol sebagai akibat dari vibrasi.
Radiasi medan listrik berubah–ubah akan berinteraksi dengan molekul dan akan menyebabkan perubahan amplitudo salah satu gerakan molekul. Selain itu energi yang dihasilkan oleh sinar IR harus sesuai dengan energi yang dibutuhkan oleh atom untuk bervibrasi (Earnshaw, 1997).
Spektroskopi inframerah sangat berguna untuk analisis kualitatif (identifikasi) dari senyawa organik karena spektrum yang unik yang
dihasilkan oleh setiap organik zat dengan puncak struktural yang sesuai dengan fitur yang berbeda. Selain itu, masing-masing kelompok fungsional menyerap sinar inframerah pada frekuensi yang unik. Atom-atom didalam suatu molekul tidak diam melainkan bervibrasi (bergetar). Ikatan kimia yang menghubungkan dua atom dapat dimisalkan sebagai dua bola yang dihubungkan oleh suatu pegas. Bila radiasi inframerah dilewatkan melalui suatu cuplikan maka molekul-molekulnya dapat menyerap (mengabsorpsi) energi dan terjadilah transisi di antara tingkat vibrasi dasar dan tingkat tereksitasi. Contoh suatu ikatan C-H yang bervibrasi 90 triliun kali dalam satu detik harus menyerap radiasi inframerah pada frekuensi tersebut untuk pindah ketingkat vibrasi tereksitasi pertama. Pengabsorpsian energi pada frekuensi dapat dideteksi oleh spektrofotometer infra merah yang memplot jumlah radiasi infra merah yang akan memberikan informasi penting tentang tentang gugus fungsional suatu molekul. Daerah radiasi sinar inframerah diantaranya daerah IR dekat (13000-4000 cm-1), daerah IR tengah (4000- 200 cm-1) dan daerah IR jauh (200-10 cm-1) (Silverstein, 2002).
Kebanyakan analisis kimia berada pada daerah IR tengah. IR jauh digunakan untuk menganalisis “m” zat organik, anorganik dan organologam yang memiliki atom berat (massa atom diatas 19). Sedangkan IR dekat menganalisis kuantitatif dengan kecepatan tinggi. Karena panjang gelombang IR lebih pendek dari panjang gelombang sinar tampak ataupun sinar UV maka energi IR tidak mampu mentransisikan elektron ,melainkan hanya menyebabkan molekul hanya bergetar (Silverstein, 2002).
II.9.2.2 Instrumen Spektrofotometer FT-IR
Gambar 6. Instrumen spektrofotometer FT-IR (Dachriyanus, 2004)
Jika suatu frekuensi tertentu dari radiasi inframerah dilewatkan pada sampel suatu senyawa organik maka akan terjadi penyerapan frekuensi oleh senyawa tersebut. Detektor yang ditempatkan pada sisi lain dari senyawa akan mendeteksi frekuensi yang dilewatkan pada sampel yang tidak diserap oleh senyawa. Banyaknya frekuensi yang melewati senyawa (yang tidak diserap) akan diukur sebagai persen transmitan. Persen transmitan 100 berarti tidak ada frekuensi IR yang diserap oleh senyawa. Pada kenyataannya, hal ini tidak pernah terjadi. Selalu ada sedikit dari frekuensi ini yang diserap dan memberikan suatu transmitan sebanyak 95%. Transmitan 5% berarti bahwa hampir seluruh frekuensi yang dilewatkan diserap oleh senyawa. Serapan yang sangat tinggi ini akan memberikan informasi penting tentang ikatan dalam senyawa ini (Dachriyanus, 2004).
38
BAB III
PELAKSANAAN PENELITIAN
III.1 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat gelas (Pyrex®), autoklaf (ALL American Model 25X-2®), blender (penghalus listrik), chamber, desikator, inkubator (Memmert®) , laminar air flow (Envirco®), lampu UV 254 & 366 nm, mikropipet (Nesco®), oven (Ecocell®), pembakar bunsen, pipa kapiler, rotavapor (Buchii®), silika gel GF 254, seperangkat alat spektrofotometer FT-IR (Shimadzu®), seperangkat alat spektrofotometer UV- VIS, Timbangan analitik (Sartorius®), vial.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah aluminium foil, amoksisilin 0,01%, aquades, Bakteri Escherichia coli ATCC 10536, Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 29737, benang godam, catton swab (Nesco®), daun tembelekan (Lantana camara L.), daun kopasanda (Chromolaena odorata), daun dan batang kiti-kiti balanda (Cassia alata L.), daun yodium (Jathropha multifida L.), daun pecut kuda (Stachytarpheta jamaicensis L.), daun bandotan (Agaratum conyzoides L.), DMSO 10%, H2SO4 10%, herba urang-aring (Eclipta prostrata L.), Kalium bromida (Merck®), kertas saring, kloroform (Merck®), lempeng GF 254, medium Nutrient Agar (NA) (Merck®) (Difco), medium Mueller Hinton Agar (MHA) (Merck®) (Difco), metanol (Merck®), NaCl 0,9%, paper disc.
III.2 Metode Penelitian
III.2.1 Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Sampel daun tembelekan (Lantana camara L.), daun kopasanda (Chromolaena odorata), daun dan batang kiti-kiti balanda (Cassia alata L.), herba urang-aring (Eclipta prostrata L.), daun yodium (Jathropha multifida L.), daun pecut kuda (Stachytarpheta jamaicensis L.), daun bandotan (Agaratum conyzoides L.) diperoleh dari Desa Sipaenre kecamatan Kindang, Kabupaten Bulukumba. Sampel diambil lalu dimasukkan ke dalam polybag dan dibawa ke laboratorium. Sampel disortasi basah kemudian dicuci sampai bersih menggunakan air mengalir dan ditiriskan, lalu dikeringkan dalam oven simplisia hingga daun kering. Sampel diasumsikan kering, apabila sampel tersebut diremas dan sampel dapat hancur. Setelah kering, sampel diserbukkan.
III.2.2 Ekstraksi Sampel
Sebanyak ±100 gram masing-masing serbuk daun tembelekan (Lantana camara L.), daun kopasanda (Chromolaena odorata), daun dan batang kiti-kiti balanda (Cassia alata L.), herba urang-aring (Eclipta prostrata L.), daun yodium (Jathropha multifida L.), daun pecut kuda (Stachytarpheta jamaicensis L.), daun bandotan (Agaratum conyzoides L.) dimasukkan ke dalam wadah maserasi, sampel dibasahkan terlebih dahulu dengan metanol 500 mL selama 15 menit, kemudian ditambahkan sebanyak 500 mL dan dibiarkan selama 24 jam sambil diaduk sesekali. Filtrat disaring dan residu direndam lagi dengan 500 mL cairan penyari yang sama. Hal ini dilakukan
