TESIS
EFEK EKSTRAK ETANOL DAN FRAKSI AKTIF DAUN KELOR (Moringa oleifera. L) TERHADAP SIKLUS SEL, APOPTOSIS DAN
EKSPRESI COX-2 PADA SEL KANKER MCF-7
OLEH:
AZIZAH DAULAY NIM. 167014001
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
EFEK EKSTRAK ETANOL DAN FRAKSI AKTIF DAUN KELOR (Moringa oleifera. L) TERHADAP SIKLUS SEL, APOPTOSIS DAN
EKSPRESI COX-2 PADA SEL KANKER MCF-7
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Magister dalam Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
AZIZAH DAULAY NIM. 167014001
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS
EFEK EKSTRAK ETANOL DAN FRAKSI AKTIF DAUN KELOR (Moringa oleifera. L) TERHADAP SIKLUS
SEL, APOPTOSIS DAN EKSPRESI COX-2 PADA SEL KANKER MCF-7
OLEH:
AZIZAH DAULAY NIM 167014001
Medan, 22 Januari 2019 Menyetujui:
Komisi Pembimbing, Komisi Penguji,
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt. Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
NIP.195707231986012001 NIP.195103261978012201
Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, M.Si., Apt. Dr. Aminah Dalimunthe, M. Si., Apt.
NIP.197506102005012003 NIP. 197806032005012004 Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP.195707231986012001
Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, M.Si., Apt.
NIP.197506102005012003
Mengetahui: Disahkan Oleh:
Ketua Program Studi, Dekan,
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP.195301011983031004 NIP.195707231986012001
LEMBAR PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa : Azizah Daulay Nomor Induk Mahasiswa : 167014001
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Efek Ekstrak Etanol dan Fraksi Aktif Daun Kelor (Moringa oleifera L.) Terhadap Siklus Sel, Apoptosis dan Ekspresi Cox-2 Pada Sel Kanker MCF-7
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Komisi Penguji Tesis pada hari Selasa tanggal dua puluh dua bulan Januari tahun dua ribu sembilan belas.
Mengesahkan:
Komisi Penguji Tesis
Ketua Komisi Penguji : Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
Sekretaris Komisi Penguji : Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, M. Si., Apt.
Anggota Komisi Penguji : Prof. Dr. Rosidah, Apt.
Dr. Aminah Dalimunthe, M.Si., Apt.
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama Mahasiswa : Azizah Daulay Nomor Induk Mahasiswa : 16014001
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Efek Ekstrak Etanol dan Fraksi Aktif Daun Kelor (Moringa oleifera L.) Terhadap Siklus Sel, Apoptosis dan Ekspresi Cox-2 Pada Sel Kanker MCF-7
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah asli karya saya sendiri, bukan plagiat dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat karena kesalahan saya sendiri maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU.
Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikian surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dan dalam keadaan sehat.
Medan, 22 Januari 2019 Yang membuat pernyataan,
Azizah Daulay NIM 167014001
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kepada Allah Yang Maha Kuasa atas rahmatNya yang tak terhingga sehingga penulis bisa menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis dengan judul “Efek Ekstrak Etanol dan Fraksi Aktif Daun Kelor (Moringa oleifera L.) Terhadap Siklus Sel, Apoptosis dan Ekspresi Cox-2 Pada Sel Kanker MCF-7”, sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun materil, untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang tiada terhingga kepada:
1. Bapak Prof. Dr. Runtung Sitepu, SH., M.Hum., selaku Rektor Universitas Sumatera Utara.
2. Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang sekaligus sebagai pembimbing yang mengarahkan, memberikan dorongan dan semangat sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan tesis ini.
3. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., selaku Ketua Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara.
4. Ibu Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, M.Si., Apt., selaku Pembimbing yang selalu membimbing, mengarahkan, memberikan dorongan dan semangat sehingga penulis terpacu untuk menyelesaikan penelitian dan tesis ini.
5. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan Ibu Dr. Aminah Dalimunthe, M.Si., Apt., sebagai penguji yang telah banyak memberikan saran dan masukan bagi penulis dalam penyelesaian tesis ini.
6. Ibu Dr. Marline Nainggolan , M.S., Apt., sebagai Kepala Departemen Biologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
7. Bapak Prof. Dr. Supargiyono, DTM&H., SU, Ph.D., Sp. Park., Kepala Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada beserta staf.
Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tiada hentinya kepada keluarga tercinta yang tiada hentinya berkorban dengan tulus ikhlas bagi kesuksesan penulis. Serta buat saudara Denny Satria dan rekan Sherly, Datin, Ainil, Haris dan semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah banyak membantu dalam penelitian tesis ini.
Kiranya Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan, sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun. Akhir kata semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.
Medan, Januari 2019 Penulis,
Azizah Daulay NIM 167014001
EFEK EKSTRAK ETANOL DAN FRAKSI AKTIF DAUN KELOR (Moringa oleifera. L) TERHADAP SIKLUS SEL, APOPTOSIS DAN
EKSPRESI COX-2 PADA SEL KANKER MCF-7
ABSTRAK
Prevalensi penyakit kanker tertinggi pada perempuan adalah kanker payudara dan kanker leher rahim. Kemoterapi pada pasien kanker dengan menggunakan obat kimia banyak menimbulkan efek samping. Daun kelor (Moringa oleifera) telah terbukti dapat berfungsi sebagai antimikroba, antioksidan dan antikanker. Kandungan flavonoid dan isotiosianat dalam daun Kelor telah terbukti dapat menjadi agen kemopreventif pada sel kanker. Tujuan penelitian ini untuk membuktikan bahwa pemberian ekstrak etanol dan fraksi aktif daun kelor menurunkan aktivitas sel kanker MCF-7.
Ekstraksi daun kelor dilakukan dengan metode perkolasi menggunakan etanol 96%, selanjutnya dilakukan fraksinasi dengan pelarut n-heksana, etil asetat, sehingga diperoleh fraksi n- heksana (FHDK), fraksi etilasetat (FEDK) dan fraksi sisa (FSDK). Nilai IC50 ekstrak dan fraksi diperoleh melalui uji sitotoksik terhadap sel MCF-7 dan sel Vero menggunakan metode MTT [3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] assay untuk selanjutnya ditentukan nilai Indeks Selektivitas (IS) masing-masing fraksi. Fraksi yang paling aktif dilanjutkan untuk uji mekanisme penghambatan siklus sel dan apoptosis dengan metode flowsitometri serta efek penekanan ekspresi Cox-2 pada sel MCF-7 dengan metode imunositokimia.
Aktivitas antikanker ekstrak etanol daun Kelor (EEDK) dan beberapa fraksi dari EEDK menunjukkan nilai IC50 dari EEDK, FHDK, FEDK, dan FSDK berturut-turut sebesar 94,44 µg/mL; 97,60 µg/mL; 2 3 4 , 5 7 µg/mL dan 5354,38 µg/mL. Nilai indeks selektivitas yang diperoleh 3,95 menunjukkan EEDK selektif terhadap sel MCF-7. EEDK dan FHDK memiliki aktivitas antikanker melalui penghambatan siklus sel pada fase G0-G1 dengan perolehan nilai akumulasi sel sebesar 63,52% dan 62,69%, dan mampu menekan ekspresi Cox-2 pada sel MCF-7 tetapi tidak menginduksi terjadinya apoptosis.
Berdasarkan beberapa parameter di atas dapat disimpulkan bahwa EEDK dan FHDK memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker payudara MCF-7 melalui penghambatan siklus sel dan penekanan ekspresi Cox-2.
Kata kunci : Daun kelor, sel kanker MCF-7, Siklus sel, Apoptosis dan Cox-2
EFFECT OF ETHANOLIC EXTRACT AND ACTIVE FRACTION MORINGA LEAVES (Moringa oleifera. L) AGAINTS CELL CYCLE,
APOPTOSIS AND EXPRESSION OF COX-2 MCF-7 CELL LINES ABSTRACT
Breast and cervical cancers are two of the most common cancer cause in women worldwide. Anticancer drugs in cancer patient may cause several side effects. Moringa leaves (Moringa oleifera. L) has been found to exhibit antimicrobial, antioxidant and anticancer activities. Flavonoids, isothiocyanate of Moringa oleifera leaves are chemical constituents which reported as chemopreventive agent in cancer cells. The aim of this study was to prove that the administration of ethanol extract and fraction active of Moringa leaves decreased the activity of MCF-7 cell lines.
Moringa leaf extraction is done by percolation method using ethanolic 96%, then liquid-liquid extraction was used n-hexana and ethylacetate solution.
From the extraction, the n-hexane fraction was obtained, the ethylacetate fraction and the water (residual) fraction. The IC50 fraction value was obtained through cytotoxic assay on MCF-7 cell lines and Vero cell lines using the MTT [3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] assay for the selectivity index (SI) values of each fraction. The next investigation of extract and active fraction was continued to prove effect of inhibition cell cycle and apoptosis using flowsitometry method and the suppression of Cox-2 expression on MCF-7 cell lines by immunocytochemistry method.
Cytotoxic activity of EEDK and some fractions of Moringa oleifera leaves was showed through IC50 values of FHDK, FEDK, and FSDK to MCF-7 cell lines, respectively 94.44 µg/mL; 97.60 µg/mL; 234.57 µg/mL and 5354.38 µg/mL. Selectivity Index of 3.95 indicates the ethanolic extract selective against MCF-7 cell lines. EEDK and FHDK giving results inhibitory the cell cycle at G0-G1 phase with a percentage of 63.52% and 62.69% and can suppress the Cox- 2 expression of MCF-7 cell lines but cannot stimulate apoptosis.
Based on the results, we had conclusive that EEDK and FHDK can inhibit activity of MCF- 7 againts cell cycle and suppressing of Cox-2 expression.
Keywords: Moringa leaf, MCF-7 cell line, Cell cycle, Apoptosis and Cox-2
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS ... iii
LEMBAR PENGESAHAN TESIS ... iv
SURAT PERNYATAAN ... v
KATA PENGANTAR ... vi
ABSTRAK ... viii
ABSTRACT ... ix
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR TABEL ... xiv
DAFTAR GAMBAR ... xv
DAFTAR LAMPIRAN ... xvi
DAFTAR SINGKATAN ... xviii
BAB 1 PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Kerangka Pikir Penelitian ... 4
1.3 Perumusan Masalah ... 5
1.4 Hipotesis ... 6
1.5 Tujuan Penelitian ... 6
1.6 Manfaat Penelitian ... 7
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ... 8
2.1 Uraian Tanaman ... 8
2.1.1 Tanaman Kelor... 8
2.1.2 Komposisi Zat Gizi Daun Kelor ... 10
2.1.3 Penelitian Daun Kelor ... 11
2.2 Ekstraksi ... 12
2.2.1 Ekstraksi Cair-Cair... 14
2.3 Siklus Sel Dan Pertumbuhan Sel Kanker ... 14
2.3.1 Siklus Sel ... 14
2.4 Kanker ... 16
2.4.1 Kanker Payudara ... 19
2.4.2 Sel MCF-7 ... 20
2.4.3 Sel Vero ... 21
2.4.4 Enzim Siklooksigenase-2 (Cox-2) ... 21
2.5 Proliferasi dan Apoptosis Sel... 23
2.6 Penanganan Kanker ... 25
2.6.1 Penanganan Kanker Payudara ... 27
2.6.2 Metode Pengujian Aktivitas Antikanker ... 27
BAB 3 METODE PENELITIAN ... 32
3.1 Alat dan Bahan ... 32
3.1.1 Alat-alat ... 32
3.1.2 Bahan-bahan ... 33
3.2 Penyiapan Bahan Tumbuhan ... 34
3.2.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan ... 34
3.2.2 Identifikasi Tumbuhan ... 34
3.2.3 Pengolahan Bahan ... 34
3.3 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia Dan Ekstrak ... 34
3.3.1 Pemeriksaan Makroskopik ... 35
3.3.2 Pemeriksaan Mikroskopik ... 35
3.3.3 Penetapan Kadar Air ... 35
3.3.4 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air ... 36
3.3.5 Penetapan Kadar Sari Yang Larut Dalam Etanol ... 36
3.3.6 Penetapan Kadar Abu Total ... 37
3.3.7 Penetapan Kadar Abu Yang Tidak Larut Dalam Asam .. 37
3.4 Skrining Fitokimia ... 37
3.4.1 Pemeriksaan Alkaloida... 37
3.4.2 Pemeriksaan Flavonoid ... 38
3.4.3 Pemeriksaan Glikosida ... 38
3.4.4 Pemeriksaan Antrakuinon ... 39
3.4.5 Pemeriksaan Saponin ... 39
3.4.6 Pemeriksaan Tanin ... 39
3.4.7 Pemeriksaan Steroida/Triterpenoida ... 39
3.5 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kelor (EEDK) ... 40
3.6 Pembuatan Fraksi-Fraksi EEDK ... 40
3.7 Sterilisasi Alat Dan Bahan ... 41
3.8 Pembuatan Media ... 41
3.8.1 Pembuatan Media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) . 41 3.8.2 Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK-RPMI) ... 42
3.8.3 Pembuatan Media M199 ... 42
3.8.4 Pembuatan Media MK-M199 ... 43
3.9 Penumbuhan Sel MCF-7 Dan Sel Vero ... 43
3.9.1 Penumbuhan Sel ... 43
3.9.2 Subkultur ... 44
3.9.3 Panen Sel ... 44
3.9.4 Penghitungan Sel ... 45
3.10 Pembuatan Larutan Uji ... 46
3.11 Pengujian Sitotoksik ... 46
3.12 Analisis Hasil ... 47
3.13 Indeks Selektivitas ... 47
3.14 Pengujian Apoptosis Dan Siklus Sel Dengan Metode Flowsitometri . 48 3.15 Uji Penekanan Ekspresi Cox-2 Dengan Metode Imunositokimia 48 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 50
4.1 Identifikasi Tumbuhan ... 50
4.2 Karakteristik Simplisia Dan Ekstrak ... 50
4.3 Ekstraksi ... 52
4.4 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia, Ekstrak Etanol Dan Fraksi Daun Kelor ... 53 4.5 Efek Sitotoksik Dan Penentuan Indeks Selektivitas Ekstrak Etanol Dan Fraksi N-Heksana Daun Kelor Terhadap Sel MCF-7 Dan Sel Vero ... 56 4.6 Uji Penghambatan Siklus Sel Dengan Metode Flowsitometri ... 60
4.7 Uji Apoptosis ... 65
4.8 Uji Penekanan Ekspresi Enzim Cyclooxygenase-2 (Cox-2) Dengan Media Sel MCF-7 ... 70 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ... 75
5.1 Kesimpulan ... 75
5.2 Saran ... 75
DAFTAR PUSTAKA ... 77
LAMPIRAN ... 87
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
2.1 Kandungan Nutrisi Tepung Daun Kelor per 100 g ... 10 4.1 Hasil Karakterisasi Simplisia Daun Kelor ... 51
4.2 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia, Ekstrak Etanol Dan Fraksi Daun Kelor ...
54
4.3 Nilai IC50 Sampel Uji Pada Sel MCF-7 dan Sel Vero ... 57 4.4 Nilai Akumulasi Sel MCF-7 Setelah Pemberian Sampel ... 64 4.5 Hasil Pengujian Apotopsis EEDK FHDK Pada Sel MCF-7 ... 66
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1.1 Diagram Kerangka Pikir Penelitian ... 5
2.1 Tanaman Kelor ... 9
2.2 Karakteristik Sel Kanker ... 17
2.3 Mekanisme Cox-2 Dalam Regulasi Sel Kanker ... 22
4.1 Gambaran Siklus Sel MCF-7 Kontrol ... 62
4.2 Gambaran Siklus Sel MCF-7 Yang Diberi ½ IC50 EEDK ... 62
4.3 Gambaran Siklus Sel MCF-7 Yang Diberi ⅟₁₀ IC50 EEDK ... 62
4.4 Gambaran Siklus Sel MCF-7 Yang Diberi ½ IC50 FHDK ... 63
4.5 Gambaran Siklus Sel MCF-7 Yang Diberi ⅟₁₀ IC50 FHDK ... 63
4.6 Gambaran Siklus Sel MCF-7 Yang Diberi ½ IC50 Doksorubisin 63 4.7 Apoptosis Sel MCF-7 Kontrol ... 66
4.8 Apoptosis Sel MCF-7 Diberi ½ IC50EEDK ... 67
4.9 Apoptosis Sel MCF-7 Diberi ⅟₁₀ IC50 EEDK... 67
4.10 Apoptosis Sel MCF-7 Diberi ½ IC50 FHDK ... 67
4.11 Apoptosis Sel MCF-7 Diberi ⅟₁₀ IC50 FHDK ... 68
4.12 Apoptosis Sel MCF-7 Diberi ½ IC50 Doksorubisin ... 68
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1 Hasil Identifikasi Daun Kelor (Moringa oleifera. L) ... 86
2 Gambar Daun Kelor (Moringa oleifera.L) ... 87
3 Hasil Pemeriksaan Mikroskopik Serbuk Daun Kelor... 88
4 Bagan Ekstraksi Serbuk Simplisia Secara Perkolasi ... 89
5 Bagan Pembuatan Fraksi Dari Ekstrak Etanol Daun Kelor ... 90
6 Perhitungan Kadar Air Simplisia Daun Kelor ... 91
7 Perhitungan Kadar Sari Larut Air Simplisia Daun Kelor ... 92
8 Perhitungan Kadar Sari Larut Etanol Simplisia Daun Kelor ... 93
9 Perhitungan Kadar Abu Total Simplisia Daun Kelor ... 94
10 Perhitungan Kadar Abu Tidak Larut Asam Simplisia Daun Kelor ... 95 11 Perhitungan Absorbansi Persen Sel Hidup MCF-7 ... 96
12 Perhitungan IC50 Sampel Uji Terhadap Sel Vero ... 98
13 Perhitungan IC50 Sampel Uji Terhadap Sel MCF-7 ... 100
14 Bagan Pembuatan Media RPMI ... 104
15 Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK) RPMI ... 105
16 Bagan Penumbuhan Sel MCF-7 dan Vero ... 106
17 Bagan Panen Sel MCF-7 dan Vero... 107
18 Bagan Penghitungan Sel MCF-7 dan Vero ... 108
19 Bagan Pembuatan Larutan Uji ... 109
20 Bagan Pengujian Sitotoksik ... 110
21 Bagan Pengujian Flowsitometri ... 111
22 Bagan Pengujian Imunositokimia ... 112
23 Sel MCF-7 dan Perlakuan dengan EEDK Di Bawah Mikroskop ... 114 24 Sel Vero Di Bawah Mikroskop ... 115
25 Microplate-96 Sumuran ... 116
26 Alat-alat yang digunakan pada penelitian ... 117 27 Sertifikat Kultur Jaringan Dari Laboratorium Pusat
Kedokteran UGM ...
119
DAFTAR SINGKATAN
ATP Adenosine-Tri Phosphat Bcl-1 B cell Limphoma-1 CAK CDK Activating Kinase CDK Cyclin Dependent Kinase
CDKI Cyclin Dependent Kinase Inhibitor COX-2 Cyclooxygenase-2
Cyc Cyclin
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethyl Sulfoxide
DNA Deoxiribo Nukleid Acid Dox Doxorubicin
EEDK Ekstrak Etanol Daun Kelor ER Estrogen Reseptor
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FADD Fas-Asociated Death Domain FBS Fetal Bovine Serum
FEDK Fraksi Etilasetat Daun Kelor FHDK Fraksi n-Heksan Daun Kelor FSDK Fraksi Sisa Daun Kelor
HER-2 Human Epidermal growth factor Receptor 2 IS Indeks Selektivitas
MAPK Mitogen Activated Protein Kinase MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7
MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida]
NF-ĸB Nuclear Factor kappa B p21 Protein 21
p53 Protein 53 Pgp P-glikoprotein PI Propidium Iodida PKC Protein Kinase C
pRB Protein Retinoblastoma PS Phosphatidylserine RNA Ribo Nucleid Acid ROS Reactive Oxygen Species
RPMI Roswell Park Memorial Institute SDK Simplisia Daun Kelor
SDS Sodium Dodesil Sulfat SI Selectivity Index TNF Tumor Necrosis Factor
TNFR Tumor Necrosis Factor Receptor T47D Tumor 47 Ductal
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
BAB I
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Kanker adalah pertumbuhan sel yang yang tidak normal atau terus menerus dan tidak terkendali, dapat merusak jaringan sekitarnya serta dapat menjalar ke tempat lain yang disebut metastasis (Depkes, 2009). Pada tahun 2016, terdapat 1,68 juta kasus kanker baru dan 30% diantaranya akan meninggal dunia (National Cancer Institute, 2016).
Kanker merupakan penyebab kematian ketujuh di Indonesia. Penderita kanker tertinggi di Indonesia adalah kanker payudara dan kanker rahim.
Berdasarkan Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) 2013 jumlah pasien rawat jalan maupun rawat inap pada kanker payudara terbanyak yaitu 12.014 orang (28,7%), kanker serviks 5.349 orang (12,8%), leukemia sebanyak 4.342 orang (10,4%), lymphoma 3.486 orang (8,3%) dan kanker paru 3.244 orang (7,8%) (Kemenkes, 2015).
Sifat umum dari kanker payudara diantaranya adalah terjadi pertumbuhan berlebihan umumnya berbentuk tumor, adanya gangguan diferensiasi dari sel dan jaringan, bersifat invasive mampu tumbuh di jaringan sekitarnya, bersifat metastatis, yaitu menyebar ke tempat lain, memiliki hereditas bawaan (pergeseran metabolisme ke arah pembentukan makromolekul dari nukleosida dan asam amino) dan menyebabkan proliferasi sel kanker baru (Nurani, 2012). Penyebab kanker payudara sangat beragam, antara lain kerusakan pada DNA yang menyebabkan mutasi genetik.
Kerusakan ini dapat disebabkan oleh radiasi yang berlebihan. Selanjutnya
karena kegagalan immune surveillance dalam pencegahan proses malignan pada fase awal, faktor pertumbuhan yang abnormal, dan malfungsi DNA repairs seperti BRCA1, BRCA2, dan p53 (Torosian, 2002).
Proses metastasis kanker payudara diinisiasi oleh adanya aktivasi/ekspresi berlebih beberapa protein, seperti Estrogen Reseptor (ER) dan c-erbB-2 (HER- 2) yang merupakan protein predisposisi kanker payudara (Foster et al., 2001).
Timbulnya resistensi pada beberapa obat terapi kanker menjadi kendala utama dalam kemoterapi yakni menurunnya sensitivitas sel kanker terhadap agen kemoterapi. Oleh karena itu, berbagai penelitian untuk mengurangi resistensi obat terus dilakukan, sehingga dapat memperbaiki penerapan klinik agen kemoterapi kanker payudara (Anonim, 2007).
Telah banyak upaya yang dilakukan untuk mengatasi penyakit kanker, salah satu upayanya adalah memproduksi obat-obatan yang bersifat antikanker.
Pemberian kemoterapi pada penderita kanker sering menimbulkan efek samping berupa mual, muntah (Abdulmuthalib et al., 2006), diare, mukositis, anemia (Quinn et al., 2009), trombositopenia, perdarahan (Zeuner et al., 2007) dan kerontokan rambut (Wills et al., 2009). Beberapa efek samping ini muncul karena obat kemoterapi tidak membunuh sel kanker secara selektif, melainkan juga pada sel normal di sekitar sel kanker yang berproliferasi secara cepat, seperti pada sel folikel rambut, mukosa gastrointestinal dan sumsum tulang (Botchkarev et al., 2000).
Berdasarkan fakta di atas, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menemukan alternatif pengobatan pada penderita kanker payudara dengan efek penyembuhan maksimal dan efek samping minimal. Obat tradisional sering kali
digunakan dalam berbagai kasus penyakit serius antara lain kanker dengan alasan sebagai obat alternatif bila penggunaan obat antikanker modern belum menunjukkan hasil optimal (Wasita, 2011).
Salah satu tanaman herbal yang diduga mampu mengobati penyakit kanker payudara adalah Moringa oleifera atau dikenal dengan daun kelor. Pada penelitian sebelumnya, substansi kimia yang terkandung dalam daun kelor antara lain yaitu isotiosianat, glikosianat, karbamat, tiokarbamat glikosida, fenolik, niazimicin, dan flavonoid telah menunjukkan aktivitas biologis sebagai anti- inflamasi, antioksidan dan anti-tumor (Eilert et al., 1981; Sreelatha dan Padma, 2009; Cheenpracha et al., 2010). Isotiosianat pada daun Moringa oleifera secara khusus merupakan zat yang berguna sebagai agen kemopreventif pada sel kanker. Isotiosianat berada di alam dalam bentuk benzil isotiosianat (BITC), phenetil isotiosianat (PEITC), dan phenil isotiosianat (PITC (Cheenpracha et al., 2010).
Beberapa publikasi penelitian juga membuktikan potensi daun kelor sebagai agen anti kanker dengan menyebutkan bahwa benzil isotiosianat (BITC) secara in vitro mampu menginduksi apoptosis terhadap sel kanker ovarium (Bose, 2007), ekstrak etanolnya mampu menginduksi apoptosis dan menghambat radikal bebas pada human tumor cell line (Sreelatha et al., 2011). Ekstrak daun kelor dapat menurunkan aktifitas NF-KB pada sel MCF-7 (Andjani et al., 2016), juga pada sel kanker HepG2 dan Caco-2 (Charoensin, 2014). Kandungan flavonoid yang terdapat pada daun kelor berpotensi sebagai agen anti kanker dengan menghambat proliferasi dan menginduksi proses apoptosis dari sel kanker (Sreelatha dan Padma, 2009).
Penelitian yang dilakukan Yu et al., (2001) juga menjelaskan tentang kemampuan isotiosianat dalam menginduksi apoptosis melalui modulasi stress signaling pathway, pelepasan sitokrom C dengan aktivasi kaskade caspase, peningkatan ekspresi gen p53, penurunan ekspresi gen Bcl-2, dan peningkatan aktivasi gen Bax. Flavonoid telah teridentifikasi sebagai komponen yang mampu mempengaruhi regulasi Cox-2 (Perera et al., 2001).
Model sel kanker payudara yang sering digunakan dalam penelitian adalah sel MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7). Sel MCF-7 merupakan sel kanker payudara yang mengekspresikan reseptor estrogen (ER+) dan berasal dari pleural effusion breast adenocarcinoma seorang pasien wanita Kaukasian berumur 69 tahun, golongan darah O (Crawford dan Bowen, 2002). Sel ini mengekspresikan reseptor estrogen dan memiliki sifat resisten terhadap doksorubisin (Zampieri, et al., 2002) dan tidak mengekspresikan kaspase-3 (Bouker et al., 2005). Sel MCF-7, P-glikoprotein diekspresikan tinggi, sehingga sensitivitas terhadap agen kemoterapi seperti doksorubisin rendah (Wong et al., 2006).
Enzim siklooksigenase merupakan target aksi obat anti inflamasi non steroid terdapat dalam dua isoform, yaitu Cox-1 dan Cox-2. Kedua enzim tersebut mengkatalisis reaksi dan menghasilkan produk yang sama yaitu prostaglandin dengan fungsi biologis yang berbeda. Selain terinduksi pada proses inflamasi, overekspresi Cox-2 juga ditemukan pada banyak tipe pre- malignan dan malignan neoplasma pada manusia, seperti pada kanker prostat, payudara, liver (Hu et al., 2003). Prostaglandin hasil aktivasi Cox-2 terlibat dalam karsinogenesis melalui perangsangan proses proliferasi, angiogenesis dan penghambatan apoptosis (Koki dan Masferrer, 2002).
Berdasarkan uraian di atas, tujuan penelitian ini untuk melakukan uji aktivitas antikanker yang terkandung dalam EEDK dan fraksi-fraksi EEDK terhadap sel MCF-7 melalui uji sitotoksik, indeks selektivitas, penghambatan siklus sel, apoptosis dan pengujian ekspresi protein Cox-2.
1.2 Kerangka Pikir Penelitian
Berdasarkan uraian latar belakang maka kerangka pikir penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.1
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian
1.3 Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian di atas, maka permasalahan dalam penelitian ini adalah:
a. Apakah EEDK dan fraksi-fraksi EEDK memiliki aktivitas antikanker pada sel kanker MCF-7 ?
b. Apakah EEDK dan fraksi-fraksi EEDK mampu menghambat siklus sel pada sel kanker MCF-7?
c. Apakah EEDK dan fraksi-fraksi EEDK mampu menginduksi apoptosis sel kanker MCF-7?
d. Apakah EEDK dan fraksi-fraksi EEDK dapat menurunkan ekspresi Cox-2 sel kanker MCF-7?
1.4 Hipotesis
Berdasarkan rumusan masalah penelitian di atas, maka hipotesis penelitian ini adalah:
a. Ekstrak etanol daun kelor dan fraksi-fraksi EEDK memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker MCF-7.
b. EEDK dan fraksi aktif EEDK mampu menghambat siklus sel pada sel kanker MCF-7.
c. EEDK dan fraksi-fraksi EEDK mampu menginduksi apoptosis sel kanker MCF-7.
d. EEDK dan fraksi-fraksi EEDK dapat menurunkan ekspresi Cox-2 sel kanker MCF-7.
1.5 Tujuan Penelitian
Adapun tujuan penelitian ini untuk mengetahui efek antikanker EEDK dan fraksi aktif EEDK terhadap sel kanker MCF-7 melalui penghambatan siklus sel dan apoptosis serta penurunan ekspresi Cox-2.
1.6 Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan pada penelitian ini untuk memberikan informasi yang ilmiah kepada tenaga kesehatan, khususnya farmasis, bahwa daun kelor berfungsi sebagai agen kemoterapi antikanker, khususnya kanker payudara dan dapat dimanfaatkan sebagai salah satu obat tradisional yang bersifat antikanker.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Uraian Tanaman
Moringa oleifera (L) tumbuh di dataran rendah maupun dataran tinggi sampai di ketinggian ± 1000 dpl. Kelor banyak ditanam sebagai pagar di halaman rumah atau ladang, dipanen setelah tanaman tumbuh 1,5 hingga 2 meter yang biasanya memakan waktu 3 sampai 6 bulan. Namun dalam budidaya intensif yang bertujuan untuk produksi daunnya, kelor dipelihara dengan ketinggian tidak lebih dari 1 meter. Pemanenan dilakukan dengan cara memetik batang daun dari cabang atau dengan memotong cabangnya dengan jarak 20 sampai 40 cm di atas tanah (Kurniasih, 2013).
Daun kelor memiliki rasa yang khas, yang memiliki rasa langu. Selain dikonsumsi daun kelor juga dijadikan obat -obatan dan penjernih air.
2.1.1 Tanaman Kelor a) Sistematika tanaman kelor
Sistematika tanaman kelor adalah sebagai berikut:
Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Bangsa : Brassicales Suku : Moringaceae Marga : Moringa
Jenis : Moringa oleifera. Lam (Krisnadi, 2015) b). Nama daerah :
Sumatera : murong (Aceh), kelor (Melayu), munggai (Minang Kabau), kilor (Lampung)
Jawa : kelor (Sunda), kelor (Jawa Tengah) Nusa Tenggara : parongge (Bima), kawona (Sumba)
Maluku : kirol (Buru), kelo (Ternate), kelo (Tidore) Nama umum/dagang : kelor
c). Deskripsi tanaman kelor
Pohon bengkok, tinggi 3-10 m, dengan tajuk yang tidak rapat. Daun panjang 20- 60 cm, anak daun bulat telur, tepi rata, ujung bertekuk, menyirip ganjil, hijau. Bunga majemuk, bentuk malai, letak di ketiak daun, panjang 10-30 cm, daun kelopak hijau, benang sari dan putik kecil, mahkota putih. Buah polong, panjang, 20-45 cm, berisi 15-25 biji, coklat kehitaman. Biji bulat, bersayap tiga, hitam (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991).
Gambar 2.1 Tanaman kelor
2.1.2 Komposisi zat gizi daun kelor
Menurut Simbolan et al (2007), kandungan kimia yang dimiliki daun kelor yakni asam amino yang berbentuk asam aspartat, asam glutamat, alanin, valin, leusin, isoleusin, histidin, lisin, arginin, venilalanin, triftopan, sistein dan methionin. Daun kelor juga mengandung makro elemen seperti potasium, kalsium, magnesium, sodium, dan fosfor, serta mikro elemen seperti mangan, zink, dan besi.
Akar, batang dan kulit batang kelor mengandung saponin dan polifenol.
Selain itu kelor juga mengandung alkaloida, tannin, steroid, flavonoid, gula tereduksi dan minyak atsiri. Akar dan daun kelor juga mengandung zat yang berasa pahit dan getir. Sementara biji kelor mengandung minyak dan lemak (Simbolan et al, 2007).
Fuglie (1999) menyebutkan kandungan kimia daun kelor per 100 gram dapat dilihat pada Tabel 2.1
1 Kadar air (%) 7,5
2 Protein (g) 27,1
3 Lemak (g) 2,3
4 Karbohidrat (g) 38,2
5 Serat (g) 19,2
6 Kalori (Kcal/100g) 205
7 Kalsium (mg) 2003
8 Kalium (mg) 1324
9 Vitamin C (mg) 17,3
10 Vitamin A (mg) 16,3
11 Vitamin B1 (mg) 2,64
12 Vitamin B2 (mg) 20,5
13 Vitamin E (mg) 113
Tabel 2.1 Kandungan nutrisi tepung daun kelor per 100 g ( Fuglie et al, 1999) Komponen Nutrisi Tepung Daun Kelor
Daun kelor mengandung substansi kimia yang unik yaitu isotiosianat, glikosianat, karbamat, tiokarbamat glikosida, fenolik, niazimicin, dan flavonoid yang pada penelitian sebelumnya menunjukkan aktivitas biologis seperti anti-inflamasi, antioksidan dan anti-tumor (Eilert et al, 1981; Sreelatha dan Padma, 2009;
Cheenpracha et al., 2010). Isotiosianat pada daun Moringa oleifera secara khusus merupakan zat yang berguna sebagai agen kemopreventif pada sel kanker.
Isotiosianat berada di alam dalam bentuk benzil isotiosianat (BITC), phenitil isotiosianat (PEITC), dan phenil isotiosianat (PITC). Isotiosianat akan terbentuk melalui aksi enzim mirosinase setelah sel tanaman rusak ketika daun dipetik atau dikunyah (Cheenpracha et al., 2010). Berbagai penelitian juga menunjukkan bahwa mekanisme aksi isotiosianat adalah melalui induksi enzim pemetabolisme fase 1 dan enzim pemetabolisme fase 2 (Hetch, 1999). Efektifitas tanaman ini sebagai agen antikanker juga terbukti dari beberapa publikasi penelitian yang menyatakan bahwa benzyl isothiosianat (BITC) secara in vitro mampu menginduksi apoptosis terhadap sel kanker ovarium (Bose, 2007). Benzyl isothiosianat (BITC) juga dapat menginhibisi pertumbuhan sel kanker pankreas BxPC-3 secara signifikan dengan IC50 8 μM melalui penghambatan siklus sel pada fase G2/M serta induksi apoptosis (Srivastava dan Singh, 2004).
2.1.3 Penelitian daun kelor
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk membuktikan khasiat farmakologi daun kelor. Daun kelor mengandung substansi kimia yang unik yaitu isotiosianat, glikosianat, karbamat, tiokarbamat glikosida, fenolik, niazimicin, dan flavonoid yang pada penelitian sebelumnya menunjukkan aktivitas biologis seperti anti-inflamasi, antioksidan dan anti-tumor (Eilert et al, 1981; Sreelatha dan
Padma, 2009; Cheenpracha et al., 2010). Isotiosianat pada daun kelor secara khusus merupakan zat yang berguna sebagai agen kemopreventif pada sel kanker. Isotiosianat berada di alam dalam bentuk benzil isotiosianat (BITC), phenitil isotiosianat (PEITC), dan phenil isotiosianat (PITC). Isotiosianat akan terbentuk melalui aksi enzim mirosinase setelah sel tanaman rusak ketika daun dipetik atau dikunyah (Cheenpracha et al., 2010).
Beberapa publikasi penelitian juga membuktikan potensi daun kelor sebagai agen anti kanker dengan menyebutkan bahwa benzil isotiosianat (BITC) secara in vitro mampu menginduksi apoptosis terhadap sel kanker ovarium (Bose, 2007).
Ekstrak daun kelor dapat menurunkan aktifitas NF-KB pada sel MCF-7(Andjani et al., 2016), juga pada sel kanker HepG2 dan Caco-2 (Charoesnsin, 2014).
Kandungan flavonoid yang terdapat pada daun kelor berpotensi sebagai agen anti kanker dengan menghambat proliferasi dan menginduksi proses apoptosis dari sel kanker tersebut (Sreelatha dan Padma, 2009).
Penelitian yang dilakukan Yu et al, (2001) juga menjelaskan tentang kemampuan isotiosianat dalam menginduksi apoptosis melalui modulasi stress signaling pathway, pelepasan sitokrom C dengan aktivasi kaskade caspase, peningkatan ekspresi gen p53, penurunan ekspresi gen Bcl-2, dan peningkatan aktivasi gen Bax.
2.2 Ekstraksi
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair (Ditjen POM, 2000). Hasil ekstraksi disebut dengan ekstrak yaitu sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia
hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 1995).
Metode ekstraksi dipilih berdasarkan beberapa faktor seperti sifat dari bahan mentah obat dan daya penyesuaian dengan tiap macam metode ekstraksi serta kepentingan dalam memperoleh ekstrak yang sempurna atau mendekati sempurna. Sifat bahan mentah obat merupakan faktor utama yang dipertimbangkan dalam memilih metode ekstraksi (Ansel, 2008). Kelarutan dan stabilitas bahan kandungan tumbuhan merupakan sifat yang penting untuk memperoleh sediaan bahan obat yang tepat, karena banyak bahan tumbuhan larut dalam air atau alkohol sehingga air atau metanol atau etanol menjadi acuan cairan pengekstraksi (Voight, 1995).
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan.
Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya, dikurangi dengan gaya kapiler yang cenderung untuk menahan. Untuk menentukan akhir perkolasi, dilakukan pemeriksaan zat aktif secara kualitatif pada perkolat terakhir. Proses perkolasi terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (Depkes, 2000).
2.2.1 Ekstraksi cair-air
Ekstraksi cair-cair merupakan suatu teknik yang mana suatu larutan (biasanya dalam air) dibuat bersentuhan dengan suatu pelarut kedua (biasanya pelarut organik), yang pada hakikatnya tidak tercampurkan, pada proses ini terjadi pemindahan satu atau lebih zat terlarut (solute) kedalam pelarut yang kedua.
Pemisahan yang dapat dilakukan bersifat sederhana, bersih, cepat, dan mudah, yang dapat dilakukan dengan cara menggojok dalam sebuah corong pisah selama beberapa menit (Bassett, et al., 1994).
Analit-analit yang mudah terekstraksi dalam pelarut organik adalah molekul-molekul netral yang berikatan secara kovalen dengan substituen yang bersifat nonpolar atau semi polar. Sementara itu senyawa-senyawa yang mudah mengalami ionisasi dan senyawa polar lainnya akan tertahan dalam fase air.
Pelarut organik yang dipilih untuk ekstraksi ialah pelarut yang mempunyai kelarutan yang rendah dalam air (< 10%), dapat menguap sehingga memudahkan penghilangan pelarut organik setelah dilakukan ekstraksi, dan mempunyai kemurnian yang tinggi untuk meminimalkan adanya kontaminasi sampel (Rohman, 2007).
2.3 Siklus Sel dan Pertumbuhan Sel Kanker 2.3.1 Siklus Sel
Siklus sel merupakan proses perkembangbiakan sel yang memperantarai pertumbuhan dan perkembangan makhluk hidup. Setiap sel baik normal maupun kanker mengalami siklus sel. Siklus sel memiliki dua fase utama, yakni fase S (sintesis) dan fase M (mitosis). Fase S merupakan fase terjadinya replikasi DNA kromosom dalam sel, sedangkan pada fase M terjadi pemisahan 2 set
DNA kromosom tersebut menjadi 2 sel (Nurse, 2000). Fase yang membatasi kedua fase utama tersebut yang dinamakan Gap. G1 (Gap-1) terdapat sebelum fase S dan setelah fase S dinamakan G2 (Gap-2). Pada fase G1, sel melakukan persiapan untuk sintesis DNA yang merupakan fase awal siklus sel. Penanda fase ini adalah adanya ekspresi dan sintesis protein sebagai persiapan memasuki fase S. Pada fase G2, sel melakukan sintesis lebih lanjut untuk proses pembelahan pada fase M (Ruddon, 2007).
Siklus sel dikontrol oleh beberapa protein yang bertindak sebagai regulator positif dan negatif. Kelompok cyclin, khususnya cyclin D, E, A, dan B merupakan protein yang levelnya fluktuatif selama proses siklus sel. Cyclin bersama dengan kelompok cyclin dependent kinase (CDK), khususnya CDK 4, 6, dan 2, bertindak sebagai regulator positif yang memacu terjadinya siklus sel.
Pada mamalia ekspresi kinase (CDK4, CDK2, dan CDC2/CDK1) terjadi bersamaan dengan ekspresi cyclin (D, E, A, dan B) secara berurutan seiring dengan jalannya siklus sel (G1-S-G2-M) (Nurse, 2000). Aktivasi CDK dihambat oleh regulator negatif siklus sel, yakni CDK inhibitor (CKI), yang terdiri dari Cip/Kip protein (meliputi p21, p27, p57) dan keluarga INK4 (meliputi p16, p18, p19). Selain itu, tumor suppressor protein (p53 dan pRb) juga bertindak sebagai protein regulator negatif (Foster, et al., 2001).
Checkpoint pada fase G2 terjadi ketika ada kerusakan DNA yang akan mengaktivasi beberapa kinase termasuk ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase. Hal tersebut menginisiasi dua kaskade untuk menginaktivasi Cdc2- CycB baik dengan jalan memutuskan kompleks Cdc2-CycB maupun mengeluarkan kompleks Cdc-CycB dari nukleus atau aktivasi p21. Checkpoint
pada fase G1 akan dapat dilalui jika ukuran sel memadai, ketersediaan nutrien mencukupi, dan adanya faktor pertumbuhan (sinyal dari sel yang lain).
Checkpoint pada fase G2 dapat dilewati jika ukuran sel memadai, dan replikasi kromosom terselesaikan dengan sempurna. Checkpoint pada metaphase (M) terpenuhi bila semua kromosom dapat menempel pada gelendong (spindle) mitosis. Checkpoint ini akan menghambat progresi siklus sel ke fase mitosis, sedangkan checkpoint pada fase M (mitosis) terjadi jika benang spindle tidak terbentuk atau jika semua kromosom tidak dalam posisi yang benar dan tidak menempel dengan sempurna pada spindle. Kontrol checkpoint sangat penting untuk menjaga stabilitas genomik. Kesalahan pada checkpoint akan meloloskan sel untuk berkembang biak meskipun terdapat kerusakan DNA atau replikasi yang tidak lengkap atau kromosom tidak terpisah sempurna sehingga akan menghasilkan kerusakan genetik. Hal ini kritis bagi timbulnya kanker. Oleh karena itu, proses regulasi siklus sel mampu berperan dalam pencegahan kanker (Ruddon, 2007).
2.4 Kanker
Kanker merupakan penyakit yang disebabkan gangguan atau ketidaknormalan pertumbuhan sel, sering disebut juga neoplasma yaitu suatu pertumbuhan sel baru yang cenderung berlebihan dan tidak terkontrol (Greene, 2008; Underwood, 1999). Penyebaran sel kanker dapat dilakukan melalui aliran darah dan kelenjar getah bening (Winarto, 2007). Kanker dapat menimbulkan gejala berbeda, bergantung pada lokasi, keganasan dan ada atau tidaknya metastasis. Metastasis merupakan penyebab utama akibat kanker (WHO, 2010).
Diagnosis kanker biasanya dilakukan melalui pemeriksaan makroskopik jaringan
yang diperoleh dengan biopsi. Setelah didiagnosis penderita kanker biasanya mendapatkan perawatan seperti operasi, kemoterapi, atau radiasi (Winarto, 2007).
Pengobatan kanker dapat dibagi menjadi tiga, yakni terapi radiasi, operasi, dan terapi adjuvant (pendamping). Terapi adjuvant dapat dibagi menjadi terapi hormonal, kemoterapi dan imunoterapi (Hahn dan Payne, 2003).
Proses karsinogen merupakan proses terjadinya kanker yang diawali dengan adanya kerusakan DNA atau mutasi pada gen-gen pengatur pertumbuhan, seperti gen p53 dan ras. Proses menuju terjadinya kanker yang progresif umumnya berjalan lama dan melibatkan perubahan-perubahan genetik lanjut serta perubahan ekspresi gen yang dapat mempengaruhi sifat pertumbuhan sel. Secara keseluruhan proses karsinogen tersebut dibagi menjadi dua fase, yaitu fase inisiasi, yakni fase aktivasi senyawa karsinogen hingga terjadinya mutasi awal dan fase post inisiasi yang meliputi tahap promosi dan progresi (Hanahan dan Weinberg, 2011).
Menurut Hanahan dan Weinberg (2011), sel kanker mempunyai enam karakter khusus yang ditunjukkan oleh Gambar 2.2
Gambar 2.2 Karakteristik sel kanker (Hanahan dan Wemberg, 2011)
Karakter pertama dari sel kanker adalah mampu menjaga sinyal untuk
melakukan proliferasi terus menerus dimana sel normal memerlukan sinyal eksternal untuk pertumbuhan dan pembelahannya, sedangkan sel kanker mampu memproduksi growth factors dan growth factor receptor sendiri. Kedua, sel kanker mampu menghindari faktor inhibisi pertumbuhan (growth factor inhibition), sedangkan sel normal merespon sinyal penghambatan pertumbuhan untuk mencapai homeostasis. Sehingga ada waktu tertentu bagi sel normal untuk proliferasi dan istirahat. Sel kanker tidak mengenal dan tidak merespon sinyal penghambatan pertumbuhan. Keadaan ini banyak disebabkan adanya mutasi pada beberapa gen (proto-onkogen) pada sel kanker. Ketiga, sel normal memiliki kepatuhan untuk tidak berpindah ke lokasi lain di dalam tubuh. Perpindahan sel kanker dari lokasi primernya ke lokasi sekunder atau tertiernya merupakan faktor utama adanya kematian yang disebabkan karena kanker. Mutasi memungkinkan peningkatan aktivitas enzim-enzim yang terlibat invasi sel kanker Matrix metalloproteinases (MMPs). Mutasi juga memungkinkan berkurangnya atau hilang adhesi sehingga akan meningkatkan attachment, degradasi, migrasi dan invasi sel kanker ke sel normal (Hanahan dan Weinberg, 2011).
Keempat, sel kanker memiliki mekanisme tertentu untuk tetap menjaga telomer tetap panjang, hingga memungkinkan untuk tetap membelah diri.
Apabila terjadi kecacatan dalam regulasi pemendekan telomer memungkinkan sel kanker memiliki potensi replikasi yang tidak terbatas. Kelima, sel kanker mampu menginduksi angiogenesis, yaitu pertumbuhan pembuluh darah baru ini disekitar jaringan kanker. Pembentukan pembuluh darah baru ini diperlukan untuk survival sel kanker dan ekspansi ke bagian lain dari tubuh. Keenam, sel kanker tidak peka terhadap sinyal apoptosis. Kegagalan sel kanker dalam
merespon sinyal apoptosis lebih disebabkan karena mutasinya gen-gen regulator apoptosis dan gen-gen sinyal apoptosis (Hanahan dan Weinberg, 2011).
2.4.1 Kanker Payudara
Kanker payudara merupakan kanker yang paling umum diderita oleh wanita, di samping kanker serviks. Kanker payudara biasanya didiagnosis dengan adanya benjolan kecil berukuran kurang dari 2 cm. Pada tumor yang ganas, benjolan ini bersifat pad at, keras dan tidak beraturan. Tanda yang kurang umum adalah adanya abnormalitas pada puting dan retraksi.
Pada kasus yang lebih berat dapat terjadi edema kulit, kemerahan dan rasa panas pada jaringan payudara (Ruddon,2007).
Penyebab kanker payudara sangat beragam, antara lain kerusakan pada DNA yang menyebabkan mutasi genetik. Kerusakan ini dapat disebabkan oleh radiasi yang berlebihan. Selanjutnya karena kegagalan immune surveillance dalam pencegahan proses malignan pada fase awal, faktor pertumbuhan yang abnormal, dan malfungsi DNA repairs seperti BRCA1, BRCA2, dan p53 (Torosian, 2002).
Proses metastasis kanker payudara diinisiasi oleh adanya aktivasi/ekspresi berlebih beberapa protein, seperti Estrogen Reseptor (ER) dan c-erbB-2 (HER- 2) yang merupakan protein predisposisi kanker payudara. Aktivasi reseptor estrogen melalui ikatan kompleks dengan estrogen akan memacu transkripsi gen yang mengatur proliferasi sel. Estrogen dapat memacu ekspresi protein yang berperan dalam siklus sel seperti cyclin D1, CDK4, cyclin E, dan CDK2. Selain itu, aktivasi reseptor estrogen mampu mengaktivasi beberapa onkoprotein yang berperan dalam sinyal pertumbuhan, misalnya Ras, Myc, dan cycD1 (Foster, et
al., 2001). Aktivasi protein ini mengakibatkan adanya pertumbuhan yang berlebihan melalui aktivasi onkoprotein yang lain seperti P13K, AKT, Raf, ERK, dan MAP kinase (Hahn, et al., 2002). Di lain pihak, kompleks estrogen dengan reseptornya juga akan memacu transkripsi beberapa gen tumor suppressor, seperti BRCA1, BRCA2 dan p53. Namun, pada penderita kanker payudara (yang umumnya telah lewat masa menopause), gen tersebut telah mengalami perubahan (transformed) akibat dari hiperproliferasi sel payudara selama perkembangannya sehingga tidak berperan sebagaimana mestinya (Adelmann et al, 2000;
Ingvarsson et al, 2002).
2.4.2 Sel MCF-7
Sel ini merupakan sel kanker payudara yang mengekspresikan reseptor estrogen (ER+) dan berasal dari pleural effusionbreast adenocarcinoma seorang pasien wanita Kaukasian berumur 69 tahun, golongan darah O. Sel ini termasuk sel adherent (melekat) yang dapat ditumbuhkan dalam media penumbuh DMEM . Biakan sel MCF-7 memiliki beberapa karakteristik pada epitel mamari yang berbeda termasuk dalam kemampuannya untuk memproduksi estradiol via reseptor sitoplasma. Sel ini mengekspresikan reseptor estrogen alfa (ER-α), memiliki sifat resisten terhadap doksorubisin (Zampieri et al., 2002) dan tidak mengekspresikan caspase-3. Pada sel MCF-7, Pgp diekspresikan tinggi, sehingga sensitivitas terhadap agen kemoterapi seperti doksorubisin rendah (Wong, et al.,2006). Penurunan konsentrasi ini dapat mengurangi efektivitas senyawa kemoterapi pada sel MCF-7.
Cara untuk meningkatkan sensitivitas MCF-7 adalah dengan menghambat ekspresi dan aktivasi Pgp (Zhou et al., 2006).
2.4.3 Sel Vero
Sel Vero ATCC CCL-81 merupakan sel epitel non kanker (sel normal). Sel ini berasal dari organ ginjal monyet hijau asal Afrika. Sel Vero merupakan sel monolayer berbentuk poligonal dan pipih, immortal, non tumorigenic fibroblastic cell. Sel ini melekat erat pada substrat yang berbahan polistirena dengan membentuk ikatan kovalen. Pengujian sel Vero dilakukan untuk mempelajari pertumbuhan sel, diferensiasi sel, sitotoksisitas, dan transformasi sel yang diinduksi oleh berbagai senyawa kimia (Goncalves, et al., 2006).
2.4.4 Enzim Siklooksigenase-2 (COX-2)
Enzim siklooksigenase (COX) yang merupakan target aksi obat anti inflamasi non steroid terdapat dalam dua isoform, yaitu COX-1 dan COX-2.
Kedua enzim tersebut mengkatalisis reaksi dan menghasilkan produk yang sama yaitu prostaglandin tetapi dengan fungsi biologis yang berbeda.
Ekspresi COX-2 terinduksi oleh berbagai stimulan inflamasi atau mitogenik, dan bertanggungjawab pada biosintesis prostaglandin yang terlibat pada reaksi inflamasi dan rasa nyeri (Schror dan Meyer-Kirchrath, 2000). Selain terinduksi pada proses inflamasi, overekspresi COX-2 juga ditemukan pada banyak tipe pre-malignan dan malignan neoplasma pada manusia dan organism lain, seperti pada kanker prostat, payudara, liver (Hu et al, 2003). Prostaglandin hasil aktivasi COX-2 dinyatakan terlibat dalam karsinogenesis melalui perangsangan proses proliferasi, angiogenesis dan penghambatan apoptosis (Koki dan Masferrer, 2002). Mekanisme COX-2 menyebabkan keganasan sel dapat dilihat pada Gambar 2.3.
Gambar 2.3 Mekanisme COX-2 dalam regulasi sel kanker.
Dimodifikasi dari (Wang dan Dubois, 2004).
Siklooksigenase-2 (COX-2) memproduksi prostaglandin E2 (PGE2 ) yang merupakan jenis paling dominan ditemukan pada keganasan sel. PGE2 berikatan dengan reseptor pada permukaan sel yang merupakan jenis dari G protein-coupled reseptor yaitu EP1, EP2, EP3, dan EP4. Ikatan PGE2 dengan reseptor EP akan meningkatkan kadar Bcl-2, suatu gen anti-apoptosis yang mengakibatkan down regulation pada proses apoptosis sehingga meningkatkan proliferasi sel kanker. Selain meningkatkan gen Bcl-2, ikatan PGE2 dan EP juga menginduksi ekspresi VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) yang merupakan faktor penting dalam angiogenesis (pembentukan sel darah baru) yang membuat sel kanker mendapatkan nutrisi dan oksigen dan dapat menyebar ke seluruh tubuh melalui darah (Wang dan Dubois, 2004).
Mekanisme COX-2 lain yang menyebabkan proliferasi sel kanker meningkat diperantarai oleh ikatan antara PGE2 dengan EGFR (Epidermal Growth
Factor Reseptor), ikatan tersebut mengaktifkan PI3K (Phosphoinositide 3- Kinase). Selanjutnya PI3K memproduksi PIP3 (Phosphatidylinositol 3,4,5 Triphosphate) yang mengaktifkan PDK1 (Pyruvate Deshydrogenase Kinase).
Protein ini akan berfosforilasi untuk mengaktifkan Akt/PKB (Protein Kinase B) yang bertanggung jawab dalam progresi dan meningkatnya penyebaran sel kanker (Sobolewski, et al., 2010).
2.5 Proliferasi dan Apoptosis Sel
Pertumbuhan sel dalam individu diatur oleh suatu sistem keseimbangan, yaitu apoptosis dan proliferasi. Apabila terjadi apoptosis berlebihan, maka suatu sistem organ akan mengalami kemunduran fungsi yang dapat menimbulkan penyakit. Sebaliknya, apabila terjadi proliferasi berlebihan, maka akan membentuk suatu massa tumor yang akan mengarah pada kanker (Sudiana, 2011).
Apoptosis adalah proses regulasi kematian sel secara aktif yang terprogram (programmed cell death), tanpa disertai proses injury dan reaksi inflasi. Apoptosis adalah kematian sel melalui mekanisme genetik dengan kerusakan/fragmentasi kromosom atau DNA. Apoptosis dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu apoptosis fisiologis dan apoptosis patologis. Apoptosis fisiologis adalah kematian sel yang diprogram (programmed cell death). Proses kematian sel erat kaitannya dengan enzim telomerase. Pada sel embrional, enzim ini mengalami aktivasi sedangkan pada sel somatik enzim ini tidak mengalami aktivasi, kecuali sel bersangkutan mengalami transformasi menjadi ganas.
Telomer yang terletak pada ujung kromosom merupakan faktor yang sangat penting dalam melindungi kromosom. Pada sel normal, telomer akan memendek pada saat pembelahan diri. Apabila ukuran telomer mencapai ukuran
tertentu (level kritis) akibat pembelahan berulang, maka sel tersebut tidak dapat melakukan pembelahan diri lagi. Selanjutnya sel akan mengalami apoptosis secara fisiologis. Pada sel ganas, pemendekan telomerase sampai pada level kritis tidak terjadi karena pada sel ganas terjadi aktivasi dari enzim ribonukleoprotein (telomerase) secara terus menerus. Enzim ini sangat berperan pada sintetis telomer DNA, sehingga berbagai elemen yang dibutuhkan pada pembentukan telomer dapat dibentuk secara terus menerus dan ukuran telomer pada ujung kromosom dapat dipertahankan. Oleh karena itu, sel ganas dapat bersifat immortal (Sudiana, 2011).
Apoptosis patologis adalah kematian sel karena adanya proses suatu rangsangan. Proses ini dapat melalui beberapa jalur, yaitu aktivitas p53, jalur sitotoksik, disfungsi mitokondria, dan kompleks fas dan ligan. Apoptosis dipicu oleh aktivitas p53 karena sel memiliki gen cacat yang dipicu oleh banyak faktor, antara lain bahan kimia, radikal bebas, maupun virus (oncovirus). Gen yang cacat dapat memicu aktivitas beberapa enzim seperti PKC dan CPK-K2 yang dapat memicu aktivitas p53. P53 adalah faktor transkripsi terhadap pembentukan p21. Peningkatan p21 akan menekan semua CDK (Cyclin Dependent Kinase) dengan cyclin, dimana siklus pembelahan sel sangat tergantung pada ikatan kompleks antara CDK dengan cyclin. Apabila terjadi pengikatan p21, maka semua CDK akan ditekan, baik pada CDK-1 pada fase M maupun CDK-4 dan CDK-6 pada fase S, lalu siklus sel akan berhenti sehingga p53 akan memicu aktivitas Bax. Protein Bax akan menekan aktivitas Bcl-2 sehingga terjadi perubahan membran permeabilitas dari mitokondria yang mengakibatkan pelepasan sitokrom C ke sitosol sehingga akan mengaktivasi
kaskade kaspase. Kaspase aktif ini akan mengaktifkan DNA-se yang akan menembus membran inti dan merusak DNA, sehingga DNA akan terfragmentasi dan mengalami apoptosis (Sudiana, 2011).
Apoptosis melalui jalur sitotoksik dipicu oleh adanya sel yang memiliki gen cacat sehingga sel akan mengekspresikan protein asing. Protein asing yang dihasilkan dapat bersifat imunogenik sehingga memicu pembentukan antibodi. Antibodi akan menempel di permukaan sel killer dan akan memicu pelepasan enzim yang disebut sebagai sitotoksin. Sitotoksin tersebut mengandung perforin dan granzyme. Perforin dapat memperforasi membran sel yang memiliki gen cacat sedangkan granzyme akan masuk ke dalam sel dan mengaktivasi kaspase kaspade. Kaspase yang aktif ini akan mengaktivasi DNA-se sehingga sel mengalami apoptosis. Apoptosis dengan jalur disfungsi mitokondria terjadi karena adanya gangguan ekspresi protein pada mitokondria yang tidak seimbang baik ekspresi berlebih maupun protein yang diekspresikan adalah protein abnormal. Terjadinya apoptosis melalui jalur ligan dan fas terjadi karena dipicu oleh adanya sel yang terinfeksi virus, dimana di permukaan sel terekspresi suatu protein yang disebut fas. Fas yang terdapat pada membran sel yang terinfeksi virus akan diikat oleh ligan yang berada di permukaan NK-cell atau CTL. Adanya ikatan antar fas-ligan akan mengaktifkan suatu protein yang disebut Fas Associated Protein Death Domain (FADD) yang dapat mengaktivasi kaspase kaskade. Selanjutnya, kaspase yang aktif akan mengaktifkan DNA-se sehingga sel akan mengalami apoptosis (Sudiana, 2011).
2.6 Penanganan Kanker
Penanganan kanker ada dua jenis, yaitu pencegahan dan penghambatan
kanker. Upaya pencegahan disebut kemopreventif. Senyawa kemopreventif dibagi menjadi dua kategori, yaitu blocking agent dan suppressing agent. Blocking agent mencegah karsinogen mencapai target aksinya, baik melalui penghambatan aktivasi metabolisme maupun menghambat interaksi dengan target makromolekul seperti DNA, RNA, atau protein. Sedangkan suppressing agent menghambat pembentukan malignan dari sel yang telah terinisiasi pada tahap promosi atau progresi (Surh, 1999).
Kemopreventif dibagi menjadi tiga golongan, yaitu primer, sekunder, dan tersier. Kemopreventif primer adalah mencegah terjadinya sel kanker sejak tahap premalignan. Usaha pencegahan saat karsinogenesis pada tahap awal malignan adalah kemopreventif sekunder. Sedangkan kemopreventif tersier adalah usaha untuk meminimalkan resiko yang mungkin terjadi setelah terapi untuk malignan primer. Upaya penyembuhan (kuratif) kanker, antara lain kemoterapi menggunakan obat-obatan, seperti golongan siklofosfamid, methotreksat, dan 5-flurourasil. Pada dasarnya kinerja obat-obatan tersebut sama, yaitu menghambat proliferasi sel sehingga sel tidak jadi memperbanyak diri. Kemoterapi bisa diberikan secara tunggal ataupun kombinasi dengan harapan bahwa sel-sel yang resisten terhadap obat tertentu juga bisa merespon obat yang lain sehingga bisa diperoleh hasil yang lebih baik. Dampaknya pada pasien biasanya rambut rontok, selera makan menurun, serta rasa lemah dan letih (Sharma, 2000).
Terapi hormon digunakan untuk jenis kanker yang berkaitan dengan hormon, misalnya kanker payudara (berkaitan dengan hormon estrogen) pada wanita dan kanker prostat (berkaitan dengan hormon androgen) pada pria. Terapi
hormon pada dasarnya berusaha menghambat sintesis steroid sehingga sel tidak dapat membelah. Terapi ini membawa dampak negatif bila diaplikasikan pada wanita yang masih dalam usia subur karena dapat menghambat siklus menstruasi. Radioterapi menggunakan sinar-X dengan dosis tertentu dapat merusak DNA dan memaksa sel untuk berapoptosis. Efek negatif yang ditimbulkan hampir sama dengan kemoterapi (Sharma, 2000; Wargasetia, 2005).
2.6.1 Penanganan Kanker Payudara
Upaya penyembuhan kanker dapat digolongkan secara pembedahan, kemoterapi, terapi hormon, radioterapi, dan terapi gen (Jong, 2005; Sharma, 2000;
Wargasetia, 2005).
Kemoterapi merupakan salah satu pengobatan yang bertujuan mematikan ataupun memperlambat pertumbuhan sel kanker. Jenis agen kemoterapi yang sering digunakan pada kanker payudara antara lain kemoterapi neoajuvan, ajuvan, dan paliatif (Yudissanta, dkk., 2012). Obat kemoterapi yang biasanya diberikan dalam upaya penyembuhan kanker payudara ada dalam bentuk tunggal dan kombinasi. Beberapa bentuk tunggal yang biasanya diberikan antara lain docetaxel , taxol, dan doksorubisin (Mechetner, et al., 1998). Beberapa bentuk kombinasi yang biasanya diberikan antara lain antrasiklin-siklofosfamid, taxanes-siklofosfamid, dan antrasiklin-siklofosfamid-taxol (Anonim, 2014).
2.6.2 Metode Pengujian Aktivitas Antikanker
Pengujian aktivitas antikanker dapat dilakukan dari beberapa parameter, antara lain uji sitotoksik, indeks selektivitas, analisis isobologram, combination index (CI), pemacuan apoptosis dan siklus sel dengan metode flowcytometryy, dan pengujian ekspresi protein dengan metode imunositokimia.
Uji sitotoksik dilakukan secara in vitro untuk menentukan potensi sitotoksik suatu senyawa, seperti obat antikanker. Toksisitas merupakan kejadian kompleks secara in vivo yang menimbulkan kerusakan sel akibat penggunaan obat antikanker yang bersifat sitotoksik. Respon sel terhadap obat sitotoksik dipengaruhi oleh kerapatan sel. Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] adalah salah satu uji sitotoksik yang bersifat kuantitatif. Uji ini berdasarkan pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna. Pada uji ini digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase. MTT akan direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium, yang termasuk dalam mitokondria dari sel hidup.
Formazan merupakan zat berwarna ungu yang tidak larut dalam air sehingga dilarutkan menggunakan HCl 0,04 N dalam isopropanol atau 10%
SDS dalam HCl 0,01 N. Intensitas warna ungu terbentuk dapat ditetapkan dengan spektrofotometri dan berkorelasi langsung dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme, sehingga berkorelasi dengan viabilitas sel. Persentase viabilitas dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut (Kupcik, et al., 2001).
absorbansi sampel
% Viabilitas = x 100 % absorbansi kontrol
Nilai indeks selektivitas diperoleh dengan menggunakan sel yang berasal dari ginjal monyet hijau afrika (sel Vero) menggunakan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT). Indeks selektivitas diperoleh dari rasio IC50 sel Vero sel dibandingkan dengan sel kanker yang diuji. Nilai lebih tinggi
dari 3 menunjukkan bahwa obat atau ekstrak memiliki selektivitas yang tinggi (Weerapreeyakul, et al., 2012). Indeks selektivitas dihitung menggunakan persamaan di bawah ini:
IC50 sel Vero Indeks selektivitas =
IC50 sel MCF-7
Pengujian siklus sel dan apoptosis menggunakan metode flowcytometry.
Flowcytometry adalah teknik yang digunakan untuk menghitung dan menganalisis partikel mikroskopis yang tersuspensi dalam aliran fluida (Sayed, et al, 2009). Prinsip dasar dari metode ini adalah berdasarkan fluoresensi. Suspensi sel atau partikel yang hendak dianalisa disedot atau dialirkan. Aliran dikelilingi oleh fluida yang sempit, sel akan melewati satu demi satu melalui sinar laser terfokus. Sinar laser akan menyerang sel tersebut. Sel yang sesuai dengan cahaya laser dan panjang gelombang yang tepat dapat dipancarkan kembali sebagai fluoresensi jika sel mengandung zat alami fluorescent satu atau lebih fluorochrome-label antibodi melekat pada permukaan atau struktur internal sel.
Penyerapan cahaya tergantung pada struktur internal sel dan ukuran dan bentuknya. Cahaya fluoresensi terdeteksi oleh serangkaian dioda. Filter optik berfungsi untuk memblokir cahaya yang tidak diinginkan.
Hasil data disimpan melalui komputer (Ulfah, 2010). Flowcytometry dapat digunakan untuk menganalisa DNA content sel melalui pewarnaan sel dengan pewarna propidium iodide (PI) atau 4’,6’-diamino-2-phenylindole (DAPI).
Dengan adanya fluorochrome yang memiliki kemampuan berinterkalasi dengan basa untai DNA seperti propidium iodide, maka tiap sel yang memiliki jumlah set
kromosom yang berbeda akan memberikan intensitas fluoresensi yang berbeda.
Semakin banyak set kromosom maka intensitas fluoresensi akan semakin besar.
Untuk pengujian apoptosis, ditambahkan antibodi Annexin V dan propidium iodida, sedangkan pengujian siklus sel ditambahkan antibodi propidium iodida.
Lalu diukur dengan alat flowcytometer (Hostanska, et al., 2004). Flowcytometer atau FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) digunakan untuk membaca intensitas fluoresensi tiap sel (Givan, 2001).
Imunositokimia merupakan suatu metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya ekspresi suatu protein spesifik atau antigen dalam sel dengan menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen. Ada dua jenis metode imunositokimia, yaitu metode langsung dan metode tidak langsung. Pada metode langsung, antibodi yang mengikat fluoresen atau zat warna langsung berikatan dengan antigen pada sel.
Sedangkan pada metode tidak langsung, antigen diikatkan pada antibodi primer secara langsung kemudian ditambahkan antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti peroksidase, alkali fosfatase, atau glukosa oksidase. Antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer. Selanjutnya ditambahkan substrat kromogen yang akan diubah oleh enzim sehingga terjadi pembentukan warna (pigmen) yang akan mewarnai sel. Untuk menjamin antibodi agar dapat mengikat antigen, sel harus difiksasi dengan ditempelkan pada bahan pendukung padat sehingga antigen akan immobile. Hal ini dapat dilakukan dengan cara menumbuhkan sel pada slide mikroskop, coverslip, atau bahan pendukung plastik yang sesuai. Ada dua macam metode fiksasi, yaitu pelarut organik dan reagen cross-linking.
