peroksidase Kolesterol oksidase
Lampiran 1 Prosedur penentuan lipid serum 1) Prosedur analisis kolesterol total
Kolesterol total ditentukan dengan metode enzim cholesterol oxidase-p- aminophenozone (CHOD-PAP).
Prinsip uji
Kolesterol dan kolesterol ester dilepaskan dari lipoprotein dengan enzim, selanjutnya dioksidasi secara enzimatik, reaksinadalah:
Kolesterol ester +H2O kolesterol + asam lemak
Kolesterol + O2 kolesterol 3-on + H2O2
2H2O2 + phenol + 4-aminoantipyrine Quinoneimine dye + 4 H2O Reagen:
Reagen enzim (R1) mengandung phenol, kolesterol oksidase, kolesterol esterase, peroksidase dan 4-aminoantipyrine. Reagen standar (R4) mengandung kolesterol, stabil disimpan pada suhu 2-8 oC.
Prosedur:
Panjang gelombang : 500 nm, Hg 546 nm Suhu : 37 oC
Kuvet kaca : 1 cm
Pengukuran reagen blanko (RB) dilakukan satu kali untuk satu seri pemeriksaan.
Perhitungan 1. Dengan standar
Kolesterol = δA contoh/ δA standar x 200 mg/dl atau Kolesterol = δA contoh/ δA standar x 5,16 mmol 2. Dengan faktor
Panjang gelombang C (mg/dl) C (mmol)
Hg 546 860 x δA 22,2 x δA
Dipipet ke dalam kuvet Reagen blanko Standar Contoh Standar
Standar Standar
- - 1000 µl
10 µl - 1000 µl
- 10 µl 1000 µl Dicampur dengan baik, diukur sesudah diinkubasi pada suhu 37 oC selama 5 menit.
Absorbansi contoh dan standar dibaca terhadap RB dalam waktu 60 menit Kolesterol esterase
2) Prosedur analisis HDL Prinsip uji
Contoh ditambahkan asam fosfotungsat dan magnesium klorida untuk mengendapkan kilomikron, VLDL, dan LDL dengan cara disentrifus, supernatan mengandung fraksi HDL, kadarnya ditentukan dengan metode enzimatik.
Reagen:
Reagen mengandung asam fosfotungsta 0,55 mmol/l dan magnesium klorida 25 mmol. Reagen stabil pada suhu 15-25 oC
Prosedur:
a. Presipitasi (Pengendapan)
Dipipet ke dalam kuvet Makro Semi Mikro
Contoh
Reagen presipitasi (tanpa pengenceran) Reagen presipitasi (diencerkan)
500 µl 1000 µl
-
200 µl - 500 µl Dicampur dengan baik, diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang.
Sentrifus selama 2 menit pada 10000 g atau 10 menit pada 4000 g/ Setelah disentrifugasi supernatan yang jernih dipisahkan dari endapan dalam waktu satu jam dan tentukan konsentrasi kolestrol dengan metode CHOD-PAP.
b. Penentuan Kolestrol
Dippet ke dalam kuvet Reagen
Blanko Contoh Akuabidestilata
Supernatan HDL
Reagen CHOD-PAP Kolestrol
100 µl - 1000 µl
- 100 µl 1000 µl Dicampur dengan baik, diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang.
Sentrifus selama 2 menit pada 10000 g atau 10 menit pada 4000 g/ Setelah disentrifugasi supernatan yang jernih dipisahkan dari endapan dalam waktu satu jam dan tentukan konsentrasi kolestrol dengan metode CHOD-PAP.
Perhitungan
Panjang gelombang Makro (mg/dl) Semi Mikro (mg/dl) Hg 546 nm C = 280 x A contoh C = 327 x A contoh 500 nm C = 188 x A contoh C = 220 x A contoh
5 Dengan perhitungan dapat ditentukan:
LDL-kolesterol (mg/dl) = kolesterol total – trigliserida – HDL-kolestrol atau
LDL-kolesterol (mmol/l) = kolesterol total – trigliserida – HDL-kolestrol 2,2
3) Prosedur Analisis LDL
Analisis LDL kolesterol serum ditentukan dengan kit Fluidtest LDL- CHOL REF 413 LOT D283 dari Biocon Jerman menggunakan metode presipitasi (pengndapan).
Prinsip Uji
LDL diendapkan dengan heparin pada titik isoelektrik (pH5,12). Setelah disentrifugasi sisda LDL dan VLDL di dalam supernatan dan dapat ditentukan dengan metode enzimatik.
Reagen:
Reagen mengandung heparin 0,68 g/l, sodium sitrat 0,064 mol/l dan stabilizer 2
%. Reagen ini stabil apabila disimpan pada suhu (2-8) °C.
Posedur:
a. Presipitasi (Pengendapan)
Dippet ke dalam tabung sentrifus Contoh
Reagen LDL 100 µl
1000 µl
Dicampur dengan baik, didiamkan selama sepuluh menit pada suhu +15 sampai +25 °C dan disentrifus selama 15 menit pada 4000 rpm. Setelah disentrifugasi supernatan yang jernih dipisahkan dari endapan dalam waktu satu jam ditentukan konsentrasi kolesterol dengan metode CHOD-PAP.
b. Penentuan Kolesterol
Dipipet ke dalam kuvet Reagen Blanko Contoh Akuabidestilata
Supernatan HDL
Reagen CHOD-PAP Kolestrol
100 µl - 1000 µl
- 100 µl 1000 µl Dicampur dengan baik, diukur sesudah diinkubasi pada 37 °C selama 5 menit atau 10 menit pada suhu 20-25 °C. Dibaca absorbansi contoh terhadap terhadap reagen blanko dalam waktu 60 menit.
Perhitungan:
Panjang gelombang Makro (mg/dl) Hg 546 nm
500 nm C = 1028 x A contoh
C = 950 x A contoh
LDL kolesterol = Total kolesterol – LDL koleserol supernatan
4) Prosedur Analisis Trigiliserida Serum
Analisis trigiliserida serum ditentukan dengan kit Fluidtest TG REF 5748 LOT D716 dari Biocon Jerman menggunakan metode GPO-PAP merupakan uji kolorimetrik enzimatik.
Prinsip uji
Trigliserida dihidrolisis secara enzimatis menjadi gliserol menurut reaksi berikut.
Trigeliserida Gliserol + asam lemak bebas Gliserol + ATP G-3-P + ADP
G-3-P + O2 DAP + H2O2
H2O2 + 4-aminoantipyrin + p-khlorofenol 4H2O2 + Quinonimine Reagen:
Reagen R1 (reagen enzim) dan reagen R4 (standar) stabil bila disimpan pada suhu +2 sampai +8 °C dan terlindung dari cahaya.
Prosedur:
Panjang gelombang : 500-550 nm, Hg 546 nm
Suhu : +37 °C
Kuvet Kaca : 1 cm
Pengukuran terhadap reagen blanko (RB) dilakukan satu kali untuk satu seri pemeriksaan.
Dipipet ke dalam kuvet
Reagen Blanko Standar Contoh Standar/R4
Sampel Reagen kerja
- - 1000 µl
10 µl - 1000 µl
- 10 µl 1000 µl Campur dengan baik, diukur sesudah diinkubasi pada 37 °C selama 5 menit.
Dibaca absorbansi contoh dan standar terhadap RB dalam waktu 60 menit.
Perhitungan
Konsentrasi trigliserida dapat dihitung dengan rumus:
POD GK
LPL
GPO
Trigliserida (mg/dl)= 200xδA contoh/δA standar atau Trigliserida (mmol/l)= 2,28 x δA contoh/δA standar
Lampiran 2 Rata-rata berat badan kelinci (gram) selama periode penelitian Perlakuan
Minggu ke--
Kontrol negative
Kontrol positif Simvastatin Discodoris sp
0 1873± 156 1935± 310 1890 ± 309 1892 ± 118 1 1971± 135 2133± 279 2024 ± 315 2008 ± 141 2 2041± 109 2183± 250 2070 ± 284 2058 ± 150 3 2040± 135 2186± 253 2069 ± 236 2067 ± 162 4 2143± 67 2332± 190 2134 ± 261 2067 ± 117 5 2167± 51 2381± 182 2144 ± 240 2163 ± 201 6 2121± 95 2329± 229 2146 ± 264 2180 ± 221 7 2187± 57 2445± 212 2196 ± 256 2231 ± 255 8 2268± 44 2470± 219 2275 ± 305 2329 ± 258 9 2255± 33 2463± 231 2261 ± 270 2299 ± 287 10 2273± 49 2463± 231 2277 ± 255 2297 ± 317 11 2305± 19 2536± 248 2349 ± 327 2307 ± 428 12 2280± 34 2507± 249 2392 ± 374 2297 ± 401
Lampiran 3 SGOT dan SGPT darah kelinci setelah 12 minggu perlakuan
Perlakuan Ulangan SGOT SGPT Kontrol negatif
1 2 3
46 41 28*
60*
34 32 Kontrol positif
1 2 3
77*
51 62
93 48*
78
Simvastatin 1
2 3
95 87 96
87 94 99 Discodoris sp
1 2 3
42 75*
46
46 63*
44
* Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman >20%
Lampiran 4 Kandungan plasma darah kelinci selama pengamatan Perlakuan Ulangan
Kandungan plasma darah kelinci
Kolesterol Trigliserida HDL LDL M0 M4 M8 M12 M0 M4 M8 M12 M0 M4 M8 M12 M0 M4 M8 M12
Kontrol
negatif 1 79.8* 41.5 56.1* 51.6* 74.0* 42.3 34.6 35.5 30.7 41.4 59.8 76.3 34.3* 20.4 19.3 50.3 2 41.3 41.5 31.7 31.6 33.9 28.1* 50.0* 32.3 26.5 47.6 38.2* 64.4 48.0 10.2 20.2 30.4*
3 38.4 24.9* 29.3 31.6 49.8 46.2 34.6 51.6* 15.0* 59.3 68.2 52.2 41.4 15.2 12.5* 40.4 Kontrol
positif 1 65.3 268.3 324.4 573.7 74.7* 100.5 156.5 200.2 28.5 44.6 56.9 11.0 21.9* 159.7 208.7 365.2 2 54.8 143.9* 324.4 571.1 42.8 105.5 160.7 250.2* 13.8* 40.6 60.9 46.4* 82.4 91.6* 264.5 158.4*
3 28.8* 268.3 656.1* 757.9* 52.5 102.6 170.4* 220.5 23.8 71.5* 40.1* 26.9 54.5 191.9 407.9* 505.2
Simvastatin
1 50.9* 51.2 63.4 128.9* 53.9 42.3* 34.6 46.1* 27.6 99.3* 146.2* 52.2* 82.5 66.8 40.4 91.4 2 85.5 46.3 78.1 31.6 23.4* 17.5 19.2* 96.8 63.3* 63.2 73.9 62.5 72.3 87.5 64.1* 74.7 3 96.1 97.6* 129.3* 44.7 51.8 19.2 30.8 103.2 28.0 56.5 33.9 62.2 57.2 37.3* 33.8 81.1
Discodoris sp
1 28.8* 112.2 26.8* 68.4 38.0 35.1* 34.6 48.4 15.0 80.9* 106.0 96.2 76.2 38.0 20.3 15.0 2 49.0 119.5 75.6 52.6* 38.7 46.2 30.8 38.7 23.4 58.1 106.1 92.8 87.9 24.3 50.5* 20.0 3 44.2 75.6* 63.4 71.1 36.6 46.2 46.2* 35.5 21.9 60.8 93.5 120.7 75.0 52.2* 20.7 43.3*
* Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman > 20%
Lampiran 5 Persentasi kondisi sel hati yang mengalami kerusakan Perlakuan Ulangan Normal Degenerasi
Hidropis Degenerasi
lemak Nekrosa Kontrol
negatif
1 90.92 5.01 0.10 3.97 2 92.77 0.00 0.00* 7.23
3 27.17* 66.41* 0.09 6.33
4 92.18 3.42 0.00* 4.40 Kontrol
positif
1 43.88 53.02 0.00* 3.10 2 41.91 51.17 3.15 3.76 3 17.77* 77.20 0.36 4.67
4 37.76 19.63* 37.09* 5.51*
Simvastatin
1 87.26 2.60* 2.46 7.67 2 65.93* 21.26 3.59 9.22 3 92.68 29.89 5.04 12.97*
4 87.76 1.50* 0.68* 10.07 Discodoris
sp
1 86.16 0.98* 0.00 6.60
2 62.67* 32.10* 0.00 5.24
3 91.36 1.57 0.00 7.07 4 83.29 9.69 0.29* 6.74
* Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman > 20%
Lampiran 6 Persentase endapan protein pada glomerulus ginjal kelinci percobaan
Perlakuan Ulangan Endapan protein
Kontrol negatif
1 2 3 4
3*
0*
1.1 1.66
Kontrol positif
1 2 3 4
2.58 0.9*
3.56 1.96
Simvastatin
1 2 3 4
7.8 4.94
0*
0*
Discodoris sp
1 2 3 4
6.1*
9.02 10.76 11.08
* Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman >20%
