Oleh: La Ode Nafiu dan Muhammad Amrullah Pagala1)
ABSTRACT
The objective this reseacrh was detect theMxgene of Tolaki Chicken as genetic marker. As a threatment in this research was carried out experiment by using 15 Tolaki chicken from Sub District Palangga, and Sub District Wolasi of Konawe Selatan Regency. The research was conducted from September to Nopember 2012. The Method of this research was using DNA Extraction according to Sambrook, et al(1989). The identified MxGene was conducted based on PCR (Polymerase Chain Reaction) according to Ko et al(2002); Maeda (2005) and Sulandari et al (2007). The spesifik primer to amplified Mx gene according to Seyama et al (2006) was Foward NE-F2 (5’CCTTCAGCCTGTTTTTCTCCTTTTAGG AA3’) and Reverse NE-R2/R (5’CAGAGGAATCTGATTGCTCAGGCGTGTA3). Result showed that all Tolaki Chicken sample had Mxgene with 299 bp
Keywords : Tolaki Chicken, Mx gene and PCR.
PENDAHULUAN
Pengembangan ayam lokal di Indonesia sampai saat ini masih belum ditangani secara serius dan kontinu, upaya ke arah seleksi yang terarah pada karakteristik fenotipik tertentu masih sangat terbatas. Hal ini dapat dilihat masih tingginya keragaman sifat-sifat yang dimiliki, baik sifat-sifat tampilan fisik maupun produktivitasnya (Mansjoer, 2003). Tingginya keragaman sifat yang dimiliki ayam lokal merupakan potensi dasar dalam pembentukan galur ayam lokal asli yang murni dan unggul, melalui program seleksi yang berkesinambungan dan karakterisasi pada sifat-sifat khas yang menonjol.
Ayam Tolaki merupakan salah satu ayam lokal yang memiliki penampilan yang khas selain ayam lokal lainnya seperti : ayam Nunukan, Bangkok, Pelung, Nagrak, Sentul, Merawang, Merawas, Kedu hitam/putih, Kokok Balenggek, Tukong, Kate dan ayam Berugo. Ayam Tolaki merupakan salah satu dari 31 jenis ayam lokal yang memiliki karakteristik penampilan yang khas (Nataamidjaja dan Dwiyanto, 1994). Ayam Tolaki adalah ayam lokal asli Sulawesi Tenggara. Sebagaimana yang dinyatakan Sarwono (2005), bahwa ayam yang berbadan atletis ini diperkirakan
berasal dari Sulawesi Tenggara. Ayam Tolaki memiliki pola warna bulu yang mirip dengan ayam hutan merah (Gallus-gallus), sehingga ada yang menyebutnya sebagai ayam hutan. Lebih lanjut disebutkan sampai saat ini ayam Tolaki masih dikelompokkan sebagai ayam aduan, sementara dengan postur tubuh ayam Tolaki sebenarnya dapat diarahkan untuk tujuan produksi telur dan daging.
Untuk mengetahui peta penyebaran ayam Tolaki ini, maka salah satu acuan dasar yang dapat digunakan adalah mengikuti peta sebaran masyarakat asli suku Tolaki/Mekongga, karena ayam Tolaki merupakan salah satu hewan yang digunakan untuk acara adat dan sebagai salah satu media pengobatan tradisional suku Tolaki (Aku dan Pagala, 2010).
Penelitian tentang karakterisasi ayam Tolaki sampai sejauh ini masih sampai pada penampilan sifat fenotipiknya sebagaimana telah dilakukan oleh Nafiu et al. (2009) yang melaporkan Performans ayam Tolaki secara fisik memiliki postur tubuh yang relatif lebih kecil dan bentuk tubuh yang lebih ramping dibanding ayam kampung, dengan rata-rata berat Jantan 1.60±0.29 kg kisaran (1.22 - 1.99 kg) dan betina Rata-rata dengan berat 1.29±0.21 kg, kisaran (0.97 - 2.04 kg). Penelitian
karakteristik fenotipik ayam Tolaki ini telah dilaksanakan sampai pada pengamatan pola warna, seperti warna bulu, shank dan bentuk jengger bahkan telah dilakukan penelitian polimorfisme analisis pita protein darah. Sedangkan penelitian karakterisasi genetik melalui analisis molekuler (analisis DNA) termasuk identifikasi molekuler sifat-sifat ekonomis masih sangat sedikit dilakukan sehingga dibutuhkan penelitian kearah analisis molekuler ayam Tolaki untuk menghasilkan karakterisasi sifat genetik yang berciri spesifik.
Salah satu sifat ekonomis penting pada ayam lokal adalah ketahanan terhadap serangan penyakit viral seperti flu burung (Avian Influenza) dan tetelo (Newcastle Disease). Sifat antiviral ini diketahui dikontrol oleh gen Mx. Hasil penelitian Maeda (2005) menunjukan bahwa semua populasi Ayam Lokal di negara Asean mempunyai gen Mx+(tahan Flu burung) dan Mx- (rentan Flu burung), di Indonesia sendiri frekuensi gen Mx+ lebih besar yakni 63% dan sisanya 37% gen Mx-. Penggunaan teknik molekuler dengan memilih genotipe gen kandidat yang resisten terhadap penyakit tertentu sebagai Marker Assisted Selection (MAS) diharapkan dapat mempercepat pembentukan jenis Ayam Lokal Resisten terhadap beberapa penyakit yang mematikan seperti AI dan ND.
Berdasarkan Pemikiran tersebut, maka dibutuhkan suatu penelitian molekuler yang dapat mengunkap sifat resistensi penyakit viral pada Ayam Tolaki.
METODE PENELITIAN Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan bulan September sampai Nopember 2012 Lokasi pengambilan sampel dilaksanakan di Kabupaten Konawe Selatan Propinsi Sulawesi Tenggara. Analisis sampel di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Molekuler Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Fakultas peternakan IPB Bogor.
Materi Penelitian
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah ayam Tolaki yang
diambil dari beberapa daerah di Kabupaten Konawe Selatan Propinsi Sulawesi Tenggara sebanyak 15 ekor. Setelah sebelumnya dilakukan proses seleksi dan identifikasi fenotipik. Pengambilan sampel darah dilakukan pada tahap I (pertama) penelitian, selanjutnya analisis laboratorium pada tahap II di Laboratorium Departemen IPTP Fakultas Peternakan IPB. Bahan yang digunakan adalah bahan kimia untuk pengambilan sampel darah, ekstraksi DNA, amplifikasi DNA, gel elektroforesis, dan Silver Staining antara lain : EDTA, Trs, HCL pekat, potassium asetat, air bebas ion, NaCl, NaOH, SDA, natrium asetat, asam asetat, fenol, etanol absolute, kloroform, isoamil alkohol, dan proteinase K, agarose, bromfenolblue, etidium Bromida, marker DNA leader 100 pb, Tris-Borat-EDTA, Mgcl2, dNTP, Taq polymerase dan random primer.
Alat yang digunakan mesin PCR, elektroforesis, autoclave, vacuum tainer, pipet mikro, pipet tip,disposable glove, sentrifuse, vortex,gelas piala, magnetic stirrer, tabung eppendorf, alat thremocycler, lampu UV, kamera paraloid.
METODE PENELITIAN Isolasi DNA Total
Isolasi DNA Total dilakukan dengan menggunakan metode pemurnian fenol dan presipitasi dengan etanol menurut Duryadi (1993). Adapun prosedur pelaksanaannya adalah sebagai berikut : 4. Darah ayam sebanyak 250 µl yang
sebelumnya telah ditambahkan EDTA 10% dipindahkan kedalam tabung ependorf 1,5 ml.
5. Ditambahkan digestion buffer(SDS 1% v/v, 10 mM EDTA, pH 8, 20 mM NaCl, 50 mM, Tris HCL pH 9) sebanyak 500 µl dan dikocok.
6. Inkubasi pada suhu 550C selama semalam atau 16 jam.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA pada praktikum ini menggunakan protokol ekstraksi DNA metode phenol (Sambrook, et al, 1989). Sebagai berikut :
14. 250 µl sampel darah dalam EtOH dipindahkan ke tabung 1,5 ml
15. Ditambahkan 1000 µl DW/TE dan lisis buffer 500 µl dikocok pada votex dan didiamkan selama 5 menit.
16. Sentrifuge pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit
17. Supernatannya dibuang dan endapannya (pelet) disuspensikan dengan larutan 40 L SDS 10% dan 10
L Protk 5 mg/ml, dan 1 x STE sampai 400 µl.
18. Dikocok pelan dalam inkubator pada suhu 55°C selama 2 jam.
19. Supernatan sisa diekstraksi dengan penambahan 1 x volume 400 µl phenol-400 µl (chloroform-Isoamil alkohol,24:1) dan 40 µl 5M Nacl. Dikocok pelan pada suhu ruang selama 1 jam.
20. Sentrifuge pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Bagian bening (DNA) dipindahkan ke tabung 1,5 ml baru. 21. Ditambahkan 800 µl Etanol absolut dan
40 µl 5 M Nacl.
22. Selanjutnya tabung difreezing selama (lebih dari) 30 menit/over night. 23. Larutan kemudian disentrifuse pada
12.000 xg selama 5 menit untuk mempresipitasi Asam Nukleat.
24. Supernatan dibuang dan pelet dibilas dengan 800 L Etanol 70% (etanol kemudian dibuang).
25. Diamkan dalam keadaan terbuka dalam desikator atau ruang terbuka sampai alkoholnya hilang.
26. Ditambahkan 100 µl.TE 80% atau Elution Buffer dan DNA kemudian disimpan dalam freezer sampai akan digunakan.
Identifikasi dan Amplifikasi gen Mx Identifikasi genotipe gen Mx dilakukan berdasarkan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) menurut KO et a.l. (2002); MAEDA (2005) dan SULANDARI et al. (2007). Primer spesifik untuk mengamplifikasi gen Mx berdasarkan laporan SEYAMA et al., (2006) adalah
primer Foward NE-F2
(5’CCTTCAGCCTGTTTTTCTCCTTTTA GG AA3’) dan primer Reverse NE-R2/R
(5’CAGAGGAATCTGATTGCTCAGGCG TGTA3).
Untuk amplifikasi fragmen DNA gen Mxdigunakan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR). Komposisi coctail PCR dalam volume 25μl adalah primer forward 1μl, primer reverse 1μl, DNA template (50 ng) 2 μl, PCR mix 12,5 μl dan pure water 8,5 μl. Kondisi PCR yang digunakan yaitu pre denaturasi 94oC selama 5 menit, kemudian denaturasi 940 C selama 60 detik, annealing pada temperatur 60 0C selama 60 detik dan elongasi pada temperatur 72 0C selama 60 detik, dengan siklus sebanyak 35 kali, dan final extention 72 0C selama 5 menit. Produk PCR disegregasikan dengan alat elektroforesis gel agarose 1,2% dalam buffer TBE 0,5x selama 60 menit dengan voltage 90 volt konstan, kemudian diwarnai dengan ethidium bromide dan dilihat memakai alat Ultra Violet. Dokumentasi dilakukan dengan memotret hasil elektroforesis tersebut menggunakan alat gel document (Gel doc), kemudian disimpan pada file flash disk.
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi DNA Ayam Tolaki Hasil isolasi dan ekstraksi DNA ayam Tolaki disajikan pada gambar 1 berikut ini :
Gambar 1. Hasil Ekstraksi DNA Ayam Tolaki
Keterangan : A = Marker 1 kb
B = Sampel DNA Ayam Tolaki
Berdasarkan tampilan pita-pita DNA hasil ekstraksi diatas, terlihat bahwa secara keseluruhan semua sampel (15 sampel) menunjukkan hasil pita DNA pada ayam Tolaki yang cukup bersih, meskipun ada beberapa pita DNA terlihar smear. Pita
B
DNA ini terkumpul berdekatan dengan stocking gel. Hasil ekstraksi DNA pada ayam Tolaki ini di duga mengandung gen Mx yang mengindikasikan bahwa ayam lokal ini tahan terhadap beberapa serangan penyakit ayam khususnya pada serangan penyakit viral. Salah satu sifat ekonomis penting pada ayam lokal adalah ketahanan terhadap serangan penyakit viral seperti flu burung (Avian Influenza) dan tetelo (Newcastle Disease). Sifat antiviral ini diketahui dikontrol oleh gen Mx.(Maeda, 2005). Dilaporkan pula gen Mx dapat mengakibatkan resistensi pada vasicular somatitits virus (VSV) dan avian Influenza.
Penelitian selanjutnya memperjelas posisi protein Mx ini yang ternyata berada pada posisi asam amino 631 yang dapat mengakibatkan resistensi untuk mepertahankan diri terhadap kombinasi serangan VSV dan AI pada struktur selnya (Ko et al., 2002).
Amplifikasi PCR pada Ayam Tolaki Hasil ekstraksi DNA ayam Tolaki yang dilanjutkan dengan proses perbanyakan (amplifikasi DNA) dengan PCR (Polymerisasi Chain Reaction) ditampilkan pada Gambar di bawah ini.
Gambar 2. Hasil Amplifikasi PCR DNA Ayam Tolaki Keterangan :
M = Marker 1 kb
TP1 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Palangga Kandang 1 TP2 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Palangga Kandang 2 TP3 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Palangga Kandang 3 TP4 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Palangga Kandang 4 TP5 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Palangga Kandang 5 TP6 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Palangga Kandang 6 TP7 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Palangga Kandang 7 TW1 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Wolasi Kandang 1 TW2 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Wolasi Kandang 2 TW3 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Wolasi Kandang 3 TW4 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Wolasi Kandang 4 TW5 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan Wolasi Kandang 5
PCR merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu (Mullis, et all, 1994). Dalam hal ini, PCR diperlukan untuk mengamplifikasi fragmen DNA gen Mx secara invitro menggunakan primer spesifik.
Berdasarkan hasil amplifikasi PCR DNA ayam Tolaki diperoleh informasi bahwa semua sampel ayam Tolaki baik dari Kecamatan Palangga maupun Kecamatan Wolasi memiliki atau mengandung gen Mx dengan ukuran pita DNA sebesar 299 bp. Gen Mxadalah gen yang bertanggungjawab
terhadap kemampuan ayam dalam mempertahankan diri (Resisten) terhadap serangan virus flu burung (avian influenza). Hasil ini semakin mempertegas hasil penelitian Maeda (2005) yang mengambil sampel Ayam kampung atau ayam lokal di beberapa negara Asia Tenggara dan menemukan bahwa hampir sebagian besar mengandung gen Mx, Selanjutnya dikatakan di Indonesia sendiri frekuensi gen Mx+ lebih besar yakni 63% resisten dan sisanya 37% gen Mx- rentan terhadap Avia Influenza dengan jumlah sampel sebanyak 330 ekor. Ukuran pita DNA gen Mxpada ayam Tolaki sebesar 299 bp sejalan dengan hasil penelitian yang dilaporkan oleh Sironi, et al (2008) yang menemukan adanya gen Mx pada ayam jenis white leghorn dan New Hampshire sebesar 300 bp.
Keberadaan gen Mx dapat digunakan sebagai marker guna mendeteksi daya tahan ayam terhadap penyakit viral seperti Avian Influenza dan Newcastle Disease, hal ini dikarenakan gen Mx merupakan native antiviral yang spesifik pada ayam, sehingga gen Mxini dapat digunakan sebagai penciri dalam seleksi molekuler. Pada penelitian dengan populasi yang lebih besar Sartika, dkk (2011) melakukan seleksi terhadap ayam lokal di Indonesia guna menghasilkan breed ayam lokal Indonesia yang tahan terhadap serangan virus AI dari 200 sampel induk ayam dan 40 ayam jantan diperoleh frekuensi alel resisten Mx++65% pada induk
dan 60% pada ayam jantan, sementara frekuensi alel yang rentan virus Mx- yakni 35% pada induk dan 40% pada jantan.
Gen Mx mampu menghasilkan protein Mx yang bervariasi pada setiap spesies ayam. Protein Mx ini bersifat antiviral yang mampu melawan infeksi vesicular stomatitis virus (VSV). Adanya variasi pada asam amino protein Mx pada posisi 631 sangat menentukan spesifikasi antiviralnya. Hal ini dapat terjadi karena adanya mutasi subtitusi yang terjadi antara serin (AGT) dan asparagin (AAT) pada posisi 631 tersebut. Mutasi subtitusi ini akan menentukan terdapatnya gen Mx+ dan gen Mx-(Watanabe 2003; Ko et al., 2004).
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut :
4. Sampel Ayam Tolaki yang berasal dari Kecamatan Palangga dan Wolasi Kabupaten Konawe Selatan terbukti
memiliki Gen Mx yang
bertanggungjawab terhadap serangan virus Flu Burung (Avian Influenza) ataupun serangan virus tetelo (Newcastle Disease).
5. Pita DNA gen Mx yang ditemukan pada ayam Tolaki berukuran 299 bp. Keberadaan gen Mx ini dapat digunakan sebagai penciri dalam seleksi molekuler guna menghasilkan galur ayam lokal yang tahan terhadap serangan penyakit viral pada ayam.
DAFTAR PUSTAKA
Aku, A.S dan Pagala, M.A. 2010. Studi Sebaran dan Pemetaan Populasi Ayam Tolaki (Manu ndolaki) di Kabupaten Kolaka dan Kolaka Utara dalam rangka pelestarian plasma nutfah asli Sulawesi Tenggara. Laporan Penelitian. Lembaga Penelitian Unhalu. Unpublished. Kendari
Ko, J.H., H.K. Jin, A.Asano, A.Takada, A.Ninomiya, H.Kida, H.Hokiyama, M.Ohara, M.Tsuzuki, M.Nishibori, M.Mizutani and T.Watanabe. 2002. Polymorphisms and the differential antiviral activity of the chciken Mx gene. Genome Research 12 (4):595-601.
Maeda, 2005. Polymorphism of Mx Gene in Asian Indigenous chicken
population. Makalah
dipresentasekan pada Seminar Nasional Tentang Unggas Lokal III. Universitas Diponegoro.25 Agustus 2005.
Mansjoer SS. 2003. Potensi ayam buras di Indonesia. Makalah semiloka pengkajian pengembangan produksi bibit ayam Buras dan Itik,
CisaruaBogor, Tanggal 11 -12 Desember 2003.
Mullis, K.B., F.Ferre and R.A Gibbs. 1994. The Polymerase Chain Reaction. Birkhause, Boston.p.512.
Nafiu, LD, Aku, AS, Saili, T, Taufik Y dan Rusdin, M. 2009. Pelestarian dan Pengembangan Ayamn Tolaki sebagai Plasma Nutfah Asli Sulawei Tenggara. Laporan Penelitian. Lembaga Penelitian Unhalu. Kendari
Nataamidjaja A.G. dan K. Diwyanto, 1994. Konservasi Ayam Buras Langka. Proceeding, Koleksi dan Karakterisasi Plasma Nutfah Pertanian, Bogor.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Sartika, T., Sulandari, S.,and, M.S.A Zein.
Selection of Mx gene genotype as genetic marker for Avian Influenza resistance in Indonesian native chicken. BMC Proceedings 2011, 5(Suppl 4):S37.
Sarwono, B. 2005. Ayam Aduan. Penebar Swadaya. Jakarta. Hal 16-18
Seyama, T., J.H. Ko, M.Ohe, N.Sasaoka, A Okada, H.Gomi, A.Yoneda, J.Ueda, M.Nishibori, S.Okamoto, Y.Maeda and T.Watanabe. 2006. Population Research of genetic polymorphism at amino acid position 631 in chciken Mx protein with differential antiviral activity. Biochem. Genet. 44:432-443.
Sironi, L., Ramelli.P., Williams, JL.,Mariani, P., 2010. PCR-RFLP Genotyping Protocol for Chicken Mx Gene G/A Polymorphism associated with the S631N Mutation. Genetics and Molecular Research9(2):1104-1108.
Sulandari, S., M.S.A. Zein, D. Astuti And T.Sartika. 2007. Unblocking Indonesian Indigenous Chicken Genome to explore genetic resistance to avian influenza virus infection. Laporan Akhir, Program Insentif KNRT Tahun Anggaran 2007.
Watanabe, T. 2003. Genomic analysis of antiviral resistant Mx gene in the chicken. Lab. Animal Breeding and Reproduction, Hokkaido University. Sapporo, Japan. International workshop on Animal Genome Analysis, KKR 2003 Nop 6; Sapporo (JP) : Hotel Tokyo.
