BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Bahan dan Alat Metode Penelitian

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni sampai dengan Desember 2007.

Penelitian ini dilakukan pada beberapa tempat yaitu : pembuatan tepung kedelai dan tepung tempe pada di Laboratorium Jasa Analisis Pangan Fakultas Teknik Pertanian Institut Pertanian Bogor, Analisis kandungan senyawa isoflavon tepung kedelai dan tepung tempe di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian Bogor, pemeliharaan dan ovariektomi tikus di kandang hewan percobaan Fakultas Kedokteran Hewan IPB, pemeriksaan siklus estrus dan analisis hormon estrogen dilakukan pada Laboratorium Fisiologi dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.

Bahan dan Alat

Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah tikus putih betina (Rattus norvegicus) yang berasal dari galur Sprague-Dawley paritas II berumur dua belas minggu dengan bobot badan 200 gram sebanyak 30 ekor, kit estradiol, kedelai impor varietas americana, tempe yang berasal dari agen pabrik tempe Desa Ciherang Bogor, air, wadah plastik, NaCl fisiologis, Giemsa, kapas (cotton buds), ragi LIPI produksi Balai Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), kertas saring, sekam, kawat ram dan pelet dari Comfeed PT. Suri Tani Pemuka Grup PT. Japis Comfeed Indonesia, dengan kandungan protein kasar 18.0-20%, lemak kasar min 40%, serat kasar max 7.0%, kalsium max 2.0% , phosfor max 2.0%, abu max 13%, air max 10%.

Alat yang diperlukan dalam penelitian ini adalah perangkat kandang tikus, Automatic Gamma Counter, kamera digital dan mikroskop.

Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yang terdiri dari tahap

persiapan tepung kedelai dan tepung tempe, tahap persiapan hewan model, tahap

perlakuan dan pengamatan (fase proestrus, fase estrus, fase metestrus, dan fase

diestrus), dan tahap akhir yaitu analisa kadar hormon estrogen dengan menggunakan metode Radioimmunoassay (RIA).

Tahap Persiapan tepung kedelai dan tepung tempe

Sampel biji kedelai impor varietas americana sebanyak 10 kg dibuat menjadi tepung kedelai. Proses pembuatan tepung kedelai sebagai berikut : penggilingan, pengeringan dengan oven pada suhu 45°C dan kadar air 10%, penepungan dan pengayakan (60 mesh) (lampiran 1). Pembuatan tempe pada penelitian ini menggunakan 20 kg kedelai dengan mengikuti tahapan sebagai berikut: pembersihan biji kedelai kering, pencucian dan perendaman, perebusan pertama, pengupasan kulit, perendaman, perebusan kedua, penirisan dan pendinginan, peragian, pembungkusan dan inkubasi, selanjutnya tempe diolah menjadi tepung tempe (lampiran 2). Proses pembuatan tepung tempe sebagai berikut : pengirisan tempe (1 x 2 x 0,5 cm

³

), penggilingan, pengeringan dengan oven pada suhu 45°C dan kadar air 10%, penepungan dan pengayakan (60 mesh) (lampiran 3). Analisis kandungan isoflavon tepung kedelai dan tepung tempe dilakukan dengan menggunakan HPLC (High Performance Liquid Cromatography). Prosedur analisis kandungan isoflavon dapat dilihat pada lampiran 4.

Tahap Persiapan Hewan Model

Tikus betina ditempatkan dalam kandang plastik dengan tutup terbuat dari kawat ram dan dialasi sekam, pakan berupa pelet dan air minum diberikan ad libitum. Lingkungan kandang dibuat agar tidak lembab, ventilasi yang cukup serta penyinaran yang cukup dimana lamanya terang 14 jam dan lama gelap 10 jam.

Jumlah tikus betina yang digunakan dalam penelitian ini adalah 30 ekor yang

terdiri 15 ekor non ovariektomi dan 15 ekor ovariektomi (ovariektomi dilakukan

oleh dokter hewan FKH IPB). Masing-masing tikus ditempatkan dalam kandang

individu. Semua tikus diadaptasikan di lingkungan kandang percobaan selama 10

hari. Setelah diadaptasikan, 15 ekor tikus dilakukan ovariektomi dan pemulihan

selama 21 hari, kemudian semua tikus dilakukan percobaan.

Tahap Perlakuan dan Pengamatan.

Tikus dibagi kedalam 6 (enam) kelompok percobaan masing-masing terdiri dari 5 (lima) ekor. Kelompok 1: tikus non ovariektomi yang diberi pelet/pakan biasa (Non-ov K), kelompok 2: tikus non ovariektomi yang diberi tepung kedelai 10 g bk/100 g bb/hari (Non-ov Kd), kelompok 3: tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe 10 g bk/100 g bb/hari (Non-ov T), kelompok 4: tikus ovariektomi yag diberi pelet/pakan biasa (Ov K), kelompok 5:

tikus ovariektomi yang diberi tepung kedelai 10 g bk/100 g bb bk/hari (Ov Kd), dan kelompok 6: tikus ovariektomi yang diberi tepung tempe 10 g bk/100 g bb/hari (Ov T).

Tahap perlakuan dilakukan selama 28 hari atau 4 (empat) minggu.

Pemberian tepung kedelai dan tepung tempe dilakukan secara pencekokan sebanyak tiga kali sehari yaitu pagi hari (pukul 08.00 WIB), siang hari (pukul 12.00 WIB) dan sore hari (pukul 16.00 WIB). Sebelum pencekokan tepung kedelai dan tepung tempe dibuat seperti bubur dengan penambahan aquades sebanyak 30 ml. Setelah selesai masa perlakuan dilakukan pengambilan data untuk menentukan panjang siklus estrus dengan cara melakukan ulas vagina. Ulas vagina dilakukan 2 (dua) kali sehari, yaitu pada pagi hari (pukul 07.00 WIB) dan sore hari (pukul 18.00 WIB) selama dua minggu. Preparat ulas vagina selanjutnya difiksasi dengan methanol selama 15 menit dan diwarnai dengan Giemsa 10%

selama 30 menit, dicuci dengan air mengalir setelah itu dikeringkan. Setelah kering, preparat diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 40x10.

Penentuan fase siklus estrus dari hasil ulas vagina dilakukan berdasarkan

keberadaan sel-sel epitel vagina (gambar 5) dan jumlah kualitatif sel-sel epitel

vagina seperti yang tertulis pada tabel 5.

Gambar 5. Gambaran ulas vagina tikus putih galur Sprague-Dawley dengan pembesaran 40x10.

Tabel 5. Perbandingan jenis sel pada preparat ulas vagina

Fase siklus estrus Ulasan vagina Proestrus Sel epitel berinti ± 75%

Sel kornifikasi (sel tanduk) ± 25%

Estrus Sel kornifikasi ± 75%

Sel pavement (menumpuk) ± 25%

Metestrus Sel pavement 100%

Sel pavement dan leukosit

Diestrus Leukosit 100%

Leukosit dan sel berinti mulai muncul

Sumber : Baker et al. 1980 Sel epitel berinti Sel kornifikasi

Leukosit Sel pavement

Ulas vagina dilakukan selama 15 hari. Setelah masa tersebut terlampaui ulas vagina terus dilakukan untuk mendapatkan fase diestrus. Pada fase diestrus, masing-masing tikus diambil darahnya secara interkardial sebanyak kurang lebih 1 ml. Darah dikoleksi pada tabung penampung, selanjutnya darah disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 15 menit sehingga didapatkan serum yang kemudian digunakan untuk penentuan kadar estrogen. Dalam penelitian ini diukur estradiol untuk mewakili estrogen secara keseluruhan.

Tahap Analisa Hormon Estrogen.

Konsentrasi estrogen dalam serum diukur dengan metode Radioimmunoassay (RIA) dengan teknik fase padat menggunakan kit estrogen coat-a-count yang berisi estradiol berlabel

¹²⁵

I. Seri larutan standar A, B, C, D, E, F, dan G berturut-turut berisi estrogen dengan konsentrasi 0, 20, 50, 150, 500, 1800, dan 3600 pg/ml yang diperoleh dari diagnostic product corporation (Los Angeles, CA). Volume sampel yang direkomendasikan adalah 100 µl.

Tabung untuk Non Spesific Binding (NSB) dan Total Count (T) diberi label dan masing-masing dibuat duplo. Sebanyak 14 tabung diberi label masing- masing A (MB), B, C, D, E, F dan G (duplo). Dengan menggunakan mikropipet 100 µl larutan standar konsentrasi 0, 20, 50, 150, 500, 1800, dan 3600 pg/ml dipipet hingga ke dasar tabung. Pada tabung NSB dimasukkan juga 100 µl larutan standar A. Tabung-tabung lainnya diisi sampel masing-masing sebanyak 100 µl.

Ke dalam tiap tabung ditambahkan 1 ml estrogen berlabel kemudian divorteks.

Keseluruhan campuran itu diinkubasikan selama 3 jam dalam keadaan temperatur kamar. Sisa cairan yang ada dalam tiap tabung dituang dan tabung dibiarkan kering selama 3 menit. Radioaktivitas yang terikat pada tabung dicacah dengan menggunakan Automatic Gamma Counter selama 1 menit. Pencacahan dilakukan di laboratorium fisiologi dan farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB.

Persen radioaktifitas yang terikat dihitung dengan membagi CPM sampel maupun

standar dengan CPM standar A (MB). Persamaan kurva standar dihitung dengan

persamaan regresi linier persen radioaktivitas yang terikat sebagai Y dan log

konsentrasi standar sebagai X. Konsentrasi estrogen sampel dihitung dengan

memasukkan nilai persen radioaktivitas terikat sampel ke persamaan kurva standar.

Rancangan Percobaan

Penelitian ini menggunakan metode eksperimental yaitu pola rancangan acak lengkap (RAL) dengan 6 (enam) kelompok percobaan masing-masing terdiri dari 5 (lima) ekor. Kelompok 1: tikus non ovariektomi yang diberi pelet/pakan biasa (Non-ov K), kelompok 2: tikus non ovariektomi yang diberi tepung kedelai 10 g bk/100 g bb/hari (Non-ov Kd), kelompok 3: tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe 10 g bk/100 g bb/hari (Non-ov T), kelompok 4: tikus ovariektomi yag diberi pelet/pakan biasa (Ov K), kelompok 5: tikus ovariektomi yang diberi tepung kedelai 10 g bk/100 g bb bk/hari (Ov Kd), dan kelompok 6:

tikus ovariektomi yang diberi tepung tempe 10 g bk/100 g bb/hari (Ov T ).

Analisis Data

Hasil pengukuran kadar hormon estrogen dibuat rataannya, dihitung

simpangannya dengan menggunakan standard error (rataan ± SE), kemudian data

juga dianalisis dengan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) dan

dilanjutkan dengan Uji Duncan dengan selang kepercayaan 95% (α = 0.05)

dengan menggunakan perangkat lunak SAS (Mattjik dan Sumertajaya 2006).