E. Yuniarti, E. Husen, dan Nurhamida
Balai Penelitian Tanah, Bogor
ABSTRAK
Produksi inokulan pupuk hayati dalam skala industri membutuhkan media produksi yang murah dan tersedia di alam serta bahan pembawa inokulan yang mampu mempertahankan viabilitas dan fungsi inokulan dalam waktu yang relatif lama. Optimasi media dan bahan pembawa inokulan Rhizobia sudah banyak diteliti dan dikaji. Perbedaan dan persamaan syarat untuk inokulan Pseudomonas belum banyak diteliti. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pH optimum
Pseudomonas sp. dan kemampuan tumbuhnya pada media alternatif serta
ketahanannya dalam gambut. pH optimum Pseudomonas sp. diketahui dengan
menumbuhkan pada media King’s B dan pertumbuhannya diamati dengan spektrofotometer. Pertumbuhan pada media alternatif dujikan dengan menumbuhkan bakteri pada media King’s B yang dimodifikasi. Populasi bakteri Pseudomonas sp. dalam media alternatif diamati dengan metode cawang hitung. Ketahanan bakteri diujikan dalam gambut rawa pening steril dengan pH akhir 7,1 dan dua faktor suhu penyimpanan (ruang dan 4ºC) diketahui dengan menghitung populasi bakteri pada umur inokulan ke-1 dan 3 bulan. Optimasi pH pada media King’s B cair menghasilkan dua kelompok bakteri dengan pH optimum berbeda (7 dan 6.5) dan populasi maksimum dicapai pada jam ke-48. Pada media alternatif
dengan pH optimum menunjukan bahwa delapan Pseudomonas sp. dapat
tumbuh baik dengan populasi maksimum berkisar 1.32×107 - 6.9×109 CFU/g pada jam ke-48. Dalam gambut hampir seluruh inokulan dapat bertahan dengan populasi lebih dari 1 x 107 CFU/g pada lama penyimpanan bulan3 bulan, yaitu 1,02 x 107 - 3,1 x 108 dan 3,95 x 107 - 4,03 x 108 CFU/g berturut-turut pada suhu ruang dan 4ºC. Tampak bahwa media alternatif dapat menyokong pertumbuhan
Pseudomonas sp. relatif tidak berbeda nyata dengan media King’s B dengan
waktu panen pada jam ke-48. Bahan pembawa gambut dengan kondisi pH 7.1 dan kadar air 51,12% dapat mempertahankan viabilitas Pseudomonas sp.dengan populasi lebih dari 1 x 107 CFU/g pada lama penyimpanan tiga bulan.
PENDAHULUAN
Latar belakang
Delapan koleksi bakteri Pseudomonas sp. (CRB 5, CRB 12, CRB 17, CRB 24, CRB 46, CRB 47, CRB 49, CRB 56) salah satu kelompok mikroba plant
akar tanaman kedelai potesial dikembangkan sebagai pupuk hayati karena mampu menghasilkan hormon IAA (indole acetic acid), senyawa siderofor, antibiotik, kitinase, hidrogen sianida, dan pelarut fosfat.
Produksi inokulan pupuk hayati dalam skala industri membutuhkan kultur inokulan cair dalam jumlah besar, sehingga untuk efisiensi biaya produksi bahan bagi media yang digunakan haruslah bersifat murah dan tersedia di alam. Begitu juga dengan bahan pembawa inokulan haruslah dapat mempertahankan viabilitas dan fungsi inokulan dalam waktu yang relatif lama. Gambut banyak digunakan sebagai bahan pembawa karena memiliki beberapa sifat yaitu tidak menimbulkan racun pada bakteri yang akan di inokulasikan, mudah diaplikasikan, memiliki kapasitas penyerapan air yang baik, memiliki tekstur material yang tidak bergumpal, keberadaannya tersedia di alam, memiliki pelekatan yang baik terhadap biji, dan memiliki kapasitas penyangga pH yang baik. Namun tiap inokulan menghendaki persyaratan media dan karakterisitik bahan pembawa yang berbeda. Optimasi media dan bahan pembawa inokulan Rhizobia sudah banyak diteliti dan dikaji. Perbedaan dan persamaan syarat untuk inokulan
Pseudomonas belum banyak diteliti.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pH optimum Pseudomonas sp. dan kemampuan tumbuhnya pada media alternatif serta ketahanannya dalam bahan pembawa gambut.
METODOLOGI Waktu dan tempat penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Mei-Agustus 2009, di Laboratorium Mikrobiologi, Kelti Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah.
Bakteri
Delapan bakteri Pseudomonas yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Pseudomonas CRB 5, 12, 17, 24, 46, 47, 49, dan 56. Bakteri tersebut dipelihara pada media agar miring Kings’s B (agar 15 g/l, bacto pepton 20 g/l, K2HPO4 1,5 g/l, MgSO4 1,5 g/l, dan gliserol 15 ml/l), dan disimpan pada suhu
Optimasi pH
Untuk mengetahui pH optimum, delapan bakteri Pseudomonas sp. masing-masing ditumbuhkan pada media King’s B cair dengan berbagai pH berbeda yaitu 5,0; 5,5; 6,0; 6.5; dan 7,0. Parameter yang diamati adalah nilai OD (600 nm) pada jam ke-0, 3, 6, 12, 24, 36, dan 48.
Optimasi media
Kemampuan tumbuh pada media alternatif diujikan dengan menumbuhkan bakteri pada medium alternatif berupa media King’s B cair yang ditambahkan sumber karbon molase (1,5%) sebagai pengganti gliserol, sumber N susu skim (2%) sebagai pengganti protease pepton, dan air kelapa hijau (1%) sebagai sumber mineral, unsur mikro, dan vitamin. Parameter yang diamati adalah populasi bakteri Pseudomonas sp. yang tumbuh di dalam media alternatif diamati pada jam ke 0, 6, 12, 24, 48 dengan metode kuatitatif cawang hitung pada media King’s B agar.
Penyiapan gambut
Pada penelitian ini bahan pembawa yang digunakan adalah gambut, yang terlebih dahulu disaring dan dianalisis sifat-sifat kimia, kemudian diukur pH-nya dengan cara mengencerkan 10 g gambut dengan 90 ml aquadest dan ditambahkan kapur (CaCO3) sampai mencapai pH normal. Total kapur yang
ditambahkan untuk mencapai pH normal sebanyak 0,5 g. Gambut-gambut berukuran 50 g dalam kantung plastik tahan panas, diseal lalu diautoklaf dua kali pada suhu 121ºC dan tekanan 1 atm selama 15 menit.
Viabilitas Pseudomonas sp. dalam gambut
Inokulan diinokulasikan sebanyak 12 ml pada gambut steril dalam kantong plastik sehingga kadar air akhir bahan pembawa termasuk dalam kisaran rekomendasi Somasegaran dan Hoben (1985) berkisar 40-60%, yaitu ± 51,12% dan populasi bakteri dalam jumlah mencukupi. Kadar air Populasi bakteri diamati dengan metode kuantitatif cawan hitung pada waktu ke-0 (sesaat setelah pencampuran dengan pijatan suspensi inokulan dalam gambut) dan setelah inkubasi selama satu minggu pada suhu ruang. Pengamatan populasi bakteri yang disebabkan faktor penyimpanan pada suhu ruang dan suhu refrigerator (4ºC) dilakukan pada umur inokulan ke 1 bulan dan 3 bulan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi pH
Optimasi pH dilakukan untuk mendapatkan pH optimum dan kurva tumbuh setiap bakteri. Hasil optimasi pH pada media King’s B cair menunjukkan terdapat dua kelompok bakteri yang memiliki pH optimum berbeda yaitu pH optimum 7 dan pH optimum 6,5. Pada Gambar 1 terlihat bahwa dua bakteri Pseudomonas sp. menunjukan pertumbuhan optimal pada pH 6,5 yaitu CRB 49 dan 56. Sedangkan pada Gambar 2, enam bakteri lainnya (CRB 5, CRB 12, CRB 17, CRB 24, CRB 46, dan CRB 47) tumbuh optimum pada pH 7,0. Baik pada pH 6,5 maupun 7,0 tujuh Pseudomonas sp.( CRB 5, CRB 17, CRB 24, CRB 46, dan CRB 47, CRB 49 dan CRB 56) mencapai populasi maksimum pada jam ke-48, sedangkan Pseudomonas sp. CRB 12 mencapai populasi maksimum pada jam ke-36. Kelompok bakteri dengan pH optimum 6,5 yaitu CRB 49 dan CRB 56 memiliki populasi maksimum dengan nilai OD sebesar 2,305 dan 1,879 sedangkan kelompok bakteri dengan pH optimum 7,0 yaitu CRB 5, CRB 12, CRB 24, CRB 46, CRB 47, dan CRB 56 memliki nilai OD maksimum berturut-turut sebesar 2,271; 2,193; 2,121; 2,377;1,768; dan 2,18. Informasi pH optimum ini selanjutnya digunakan untuk optimasi media dengan media alternatif yang diharapkan menghasilkan biomassa inokulan maksimum yang tinggi atau mendekati nilai seperti pada media alaminya King’S B.
Gambar 1. Pertumbuhan Pseudomonas sp. CRB 49 dan CRB 56 pada media King’s B dengan pH optimum 6,5
Gambar 2. Pertumbuhan Pseudomonas sp. CRB 5, CRB 12, CRB 17, CRB 24, CRB 46, dan CRB 47pada media King’s B dengan pH optimum 7,5
Pertumbuhan Pseudomonas pada media alternatif
Pengamatan pertumbuhan pada media alternatif dengan pH optimum menunjukkan bahwa kedelapan isolat Pseudomonas sp. dapat tumbuh dengan baik dan mencapai LOG jumlah populasi maksimum berkisar 7,12-9,84 (1,32×107-6,9×109 CFU/ml) pada jam ke-48 (Gambar 4). Sedangkan pada media alami Pseudomonas sp. yaitu Kings’B cair jumlah populasi maksimum berkisar 8,94-11,04 (8,7×108 – 7,2×1010 CFU/ml) pada jam ke-48 (Gambar 3).
Gambar 3. Pertumbuhan Pseudomonas sp. dengan media alternatif pada berbagai lama waktu pengukuran
Gambar 4. Pertumbuhan Pseudomonas sp. dengan media kings’B pada berbagai lama waktu pengukuran
Optimasi media dalam penelitian ini memiliki tujuan untuk mendapatkan media alternatif yang sederhana, murah dan mudah didapatkan serta mampu menghasilkan biomassa sel bakteri maksimum yang tinggi. Pertumbuhan
Pseudomonas sp. pada media alternatif menunjukkan bahwa kedelapan bakteri
dapat memanfaatkan senyawa substitusi susu skim sebagai sumber N dan molase sebagai sumber C untuk metabolisme pertumbuhannya. Dengan demikian media alternatif dapat digunakan sebagai media pengganti untuk produksi delapan inokulan Pseudomonas sp (CRB 5, CRB 12, CRB 17, CRB 24, CRB 46, CRB 47, CRB 49, CRB 56).
Molase merupakan limbah (produk sampingan) dari pembuatan gula tebu, namun molase masih memiliki kandungan glukosa pada kisaran 4-9%, sukrosa pada kisaran 30-40%, frukrosa pada kisaran 5-12% dan komponen lainnya, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai bahan pengganti gliserol (Patauran 1982). Dalam media alternative yang digunakan, kandungan gulanya menjadi glukosa 0,06-0,135%, sukrosa 0,45-0,6%, dan fruktosa 0,075-0,18%. Penambahan air kelapa pada media alternatif diharapkan dapat menyempurnakan komposisi media alternatif, karena air kelapa mengandung sumber-sumber mineral, unsur mikro, dan vitamin yang dibutuhkan bakteri pada proses metabolismenya.
Kinetika pertumbuhan mikroorganisme sangat diperlukan untuk menunjang bioproses. Perilaku dinamik sel mikroorganisme secara garis besar mengalami empat fase pertumbuhan yang meliputi fase lag (adaptasi), fase eksponensial dan fase stasioner serta fase kematian. Di dalam proses kultivasi fase eksponensial dan stasioner pada umumnya merupakan titik kritis kultivasi, dimana mikroorganisme menghasilkan metabolit. Setelah fase adaptasi selesai, mikroorganisme memasuki fase eksponensial dimana laju pertumbuhan maksimum dan konstan, sehingga jumlah biomassa maksimum terdapat pada fase late exponential (Atlas et al., 1998). Semua bakteri Pseudomonas sp. yang digunakan dalam penelitian ini, menunjukkan akhir pertumbuhan eksponensial pada jam ke-48 dengan nilai Optical Density (OD) maksimum berkisar pada 1.768-2.305. Akhir fase pertumbuhan eksponensial dimana massa sel maksimum ini merupakan penentu waktu panen pada proses perbanyakan inokulan. Pada medium alternatif setelah waktu inkubasi 48 jam diperoleh massa sel
Pseudomonas sp. berkisar 1.32×107 - 6.9×109 cfu/ml.
Viabilitas Pseudomonas dalam gambut
Viabilitas bakteri pada bahan pembawa gambut dipengaruhi oleh bahan organik berupa partikel mudah larut seperti karbohidrat, protein, dan asam organik yang terdapat pada gambut, selain itu viabilitas bakteri dalam gambut juga dipengaruhi oleh media alternatif yang dinokulasikan. Bahan-bahan ini merupakan sumber karbon dan energi utama bagi aktifitas metabolism mikroorganisme dalam gambut. Selain itu viabilitas bakteri yang baik dan stabil ditentukan pula oleh kemampuan gambut yang mampu mempertahankan kandungan air, pH gambut yang netral serta kemampuan Pseudomonas sp. untuk memanfaatkan sumber karbon dan sumber energi yang ada pada gambut serta strategi bertahan Pseudomonas sp. dengan menggunakan mekanisme efisiensi yang dimiliki oleh Pseudomonas sp. (Jasinski, 2000).
Tabel 1. Perubahan pH dan kandungan unsur makro dan mikro bahan pembawa gambut sebelum dan sesudah penambahan CaCO3 (kaptan 5%)
pH N P K Ca Mg Na ……… % ……… Sebelum 6,0 0,97 0,03 0,02 2,32 0,19 0,06 Sesudah 7,1 0,41 0,04 0,03 5,06 0,25 0,09 S Fe Al Mn Cu Zn B % ……… ppm ……… Sebelum 0,3 11001 22372 222 13 28 td Sesudah 0.43 18833 0 369 17 69 73
Gambut Rawa Pening dipilih karena merupakan salah satu sumber gambut yang direkomendasikan untuk bahan pembawa rhizobia dan memiliki karakteristik kelembaban yang baik yang ditunjukkan oleh kapasitas menahan air yang tinggi serta kehilangan air yang lebih besar dibutuhkan untuk mengubah potential (Simanungkalit et al., 1999). Pada Tabel 1 tampak bahwa pengkayaan gambut Rawa Pening dengan CaCO3 (1 Kg kaptan per 25 Kg gambut) meningkatkan pH
menjadi 7,1 dan menurunkan kadar Al (toksik), namun meningkatkan oksidasi amonium dengan kata lain menurunkan kadar N gambut. Peningkatan unsur-unsur makro dan mikro lainnya diperoleh dari kapur yang ditambahkan.
Hasil pengukuran kadar air inokulan selama penyimpanan tiga bulan disajikan pada Tabel 2 tampak bahwa pada suhu refrigerator, kehilangan air inokulan gambut lebih rendah dibandingkan suhu ruang setelah lama penyimpanan tiga bulan. Kadar air inokulan Pseudomonas pada penyimpanan suhu ruang berkisar 34,13-37,60% dan pada suhu refrigerator berkisar 37,83- 42,17%. Sebagian besar inokulan menunjukkan kadar air < 40% dan hanya 4 inokulan yaitu CRB 12, 46, 47, 56 pada suhu refrigerator yang masih bertahan dalam kisaran kadar air inokulan sesuai rekomendasi Somasegaran dan Hoben (1985), yaitu berturut-turut sebesar 41,67; 41,48; 42,17; dan 40,58. Walaupun demikian hasil pengamatan populasi Pseudomonas dalam gambut (Tabel 3) menunjukkan bahwa hampir seluruh inokulan tidak berkembang atau tumbuh selama inkubasi dan mampu bertahan selama penyimpanan dengan jumlah populasi lebih dari 1 x 107 CFU/g. Populasi Pseudomonas setelah lama
penyimpanan tiga bulan berkisar 1,02 x 107 - 3,1 x 108 CFU/g pada suhu ruang dan 3,95 x 107 - 4,03 x 108 CFU/g pada suhu refrigerator. Kecuali inokulan Crb 56
mampu bertahan dengan jumlah populasi 1,41 x 106 CFU/g pada suhu ruang dan 6,03 x 106 CFU/g pada suhu refrigerator.
Tabel 2. Kadar air inokulan gambut pada lama penyimpanan tiga bulan
Kadar air pada penyimpanan Inokulan bakteri
Suhu ruang Suhu refrigerator ……….. % ……….. Crb 5 37.60 37.83 Crb 12 34.66 41.67 Crb 17 34.13 38.37 Crb 24 35.15 39.25 Crb 46 35.10 41.48 Crb 47 36.92 42.17 Crb 49 37.37 38.73 Crb 56 37.51 40.58
Salah satu strategi bertahan Pseudomonas sp. dalam gambut adalah mekanisme efisiensi penggunaan karbon. Pseudomonas sp. diketahui mengakumulasi β-Polihidroksi Butirat (PHB) dalam sel berfungsi sebagai sumber karbon dan energi cadangan, yang dapat digunakan sebagai sumber nutrisi dalam kondisi nutrisi non karbon seperti N, P dan O2 terbatas dan diproduksi
pada fase stasioner. Peran PHB mirip dengan peranan polimer karbohidrat seperti glikogen pada manusia, yaitu mudah diuraikan untuk sintesis polimer lain (Aneja and Charles 1999).
Tabel 3. Viabilitas inokulan Pseudomonas sp. pada gambut
Populasi inokulan pada lama dan suhu penyimpanan
1 bulan 3 bulan
Inokulan
bakteri Waktu ke-0
1 minggu
suhu ruang Suhu ruang refrigerator Suhu Suhu ruang refrigerator Suhu ………. Cfu/g ………. Crb 5 6,58 x 108 5,00 x 108 2,01 x 108 3,10 x 108 1,15 x 108 2,22 x 108 Crb 12 8,50 x 108 8,07 x 108 3,95 x 108 5,10 x 108 3,10 x 108 4,03 x 108 Crb 17 3,95 x 107 3,72 x 107 1,34 x 107 2,11 x 107 1,02 x 107 2,09 x 107 Crb 24 3,24 x 108 1,01 x 108 7,05 x 107 1,05 x 108 6,40 x 107 9,55 x 107 Crb 46 2,00 x 108 1,20 x 108 7,01 x 107 9,11 x 107 1,06 x 107 3,02 x 107 Crb 47 3,13 x 108 1,18 x 108 5,04 x 107 8,10 x 108 9,21 x 107 1,22 x 108 Crb 49 2,08 x 108 1,31 x 108 1,44 x 108 1,81 x 108 6,32 x 107 1,14 x 108 Crb 56 1,88 x 107 2,00 x 107 9,75 x 106 1,03 x 107 1,41 x 106 6,03 x 106
KESIMPULAN DAN SARAN
1. Media alternatif yang digunakan dalam penelitian ini mampu menyokong pertumbuhan inokulan Pseudomonas sp. relatif tidak berbeda dengan media King’s B sebagai media alami Pseudomonas sp. dengan waktu panen pada jam ke-48.
2. Bahan pembawa gambut dengan kondisi pH 7,1 dan kadar air 51,12% dapat mempertahankan viabilitas inokulan Pseudomonas sp. dengan jumlah populasi lebih dari 1 x 107 CFU/g setelah lama penyimpanan 3 bulan.
3. Sampai lama penyimpanan 3 bulan pada suhu ruang dan suhu 4°C, kadar air inokulan berkisar 34,13-37,60% dan 37,83-42,17%.
4. Disarankan untuk menggunakan gambut yang diperkaya dengan sumber karbon rendah N seperti molase untuk meningkatkan perkembangan dan daya tahan bakteri Pseudomonas sp.
DAFTAR PUSTAKA
Aneja, P, and T.C. Charles. 1999. Poly-3-hidroxybutirate degradation in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti: Isolation and characterization of gene encoding 3-hidroxybutirate dehidrogenase. J Bacteriol 181:849-857. Atlas, R.M. and R. Bartha. 1998. Microbial Ecology, 4th ed. California: Addision
Wesley Longman. Inc.
Jasinski, S.M. 2000. Peat. US Geologycal Survey: US Departement of the interior. Patten, C.L. and B.R. Glick. 2002. Role of Pseudomonas putida indole acetic acid
in development of plant root system. Appl Environ Microbiol 68:3795-3801.
Patauran, J.M. 1982. By-Product of The Cane Sugar Industry. Amsterdam: Elsevier Scientific Publishing Company.
Simanungkalit, R.D.M., R.J. Roughley, and A. Indrasumunar. 1999. The effect of carrier material and moisture potential on the quality of legume inoculants. Penelitian Pertanian Tanaman Pangan 18(1):64-70.
Somasegaran, P. and H.J. Hoben. 1985. Methods In Legume Rhizobium Technology. University of Hawaii NifTAL “Project and MIRCEN”.
