1
Potensi Bakteri Isolat Sonai untuk Hidrolisis
Ampas Sagu Menjadi Monosakarida
[Sonai isolate as potential bacteria for fiber sago hydrolysis to
monosaccharide]
Prima Endang Susilowatia , Sarni Marwantia, Desi Kurniawatya, Sapto Raharjoa
a
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Halu Oleo, Kendari Diterima 10/04/2012; direvisi 11/06/2012; disetujui 03/09/2012
Abstract
Cellulolytic and xylanolytic enzymes play an important role in natural biodegradation processes in which plant lignocellulosic materials are efficiently degraded by microorganisms. Large amount of fiber sago wastes from renewable sago residues are rich sources of cellulose, hemicellulose and lignin. Hemicelluloses wastes bioavailability conversion presupposes the changing of the macromolecular structure by using enzymes and to result free simple compounds (mono-disaccharide). The purposes of this study are isolation bacteria from water collected in the Sonai hot-springs and use bacteria for bioconversion of fiber sago. Bacteria were isolated on cellulose dan xylan agar medium and screened by the cellulolysis dan xylan method. Determining the reducing sugars liberated from cellulose and xylan using dinitrosalicylic acid (DNS) reagent. The results are identification of bacteria from Sonai hot springs showed 13 isolates potential xylanolitic and cellulose. Isolate IIIB-3 showed maximum xylanase and cellulose production. The isolate can hydrolysis fiber sago at condition optimum fermentation 500C, pH 6, shaker rate 175 rpm, 5% substrate, and 18 hours incubation.
Keywords: fiber sago, hemicelluloses, sacharification, Sonai isolate
Prima Endang Susilowati, Telp./Hp.: 0401-3191626/081322087327 Email: primachem_kdi@yahoo.com
1. Pendahuluan
Sulawesi Tenggara merupakan salah satu provinsi penghasil sagu dengan luas area 5.607 hektar (BPPS, 2008). Pengolahan sagu umumnya
dilakukan secara tradisional yaitu batang sagu ditebang, selanjutnya pemerasan dengan penambahan air, dan penyaringan untuk memisahkan pati dari ampasnya. Ampas sagu
2
selama ini belum dimanfaatkan, hanya dibuang dan menjadi limbah (Awg-Adeni dkk., 2010). Proses pemanfaatan ampas sagu cukup baik, karena mengandung serat kasar 18,25%, abu 2,99% dan protein 1,132% (Rahmawati, 2011).
Kandungan serat kasar merupakan komponen terbanyak dalam ampas sagu. Serat kasar merupakan polisakarida yang terdiri dari selulosa yang terbungkus oleh lignin dengan ikatan yang cukup kuat (Saha, 2004). Proses hidrolisis hemiselulosa yang umum digunakan pada industri etanol adalah hidrolisis dengan asam, seperti asam sulfat atau asam klorida (Taherzadeh dan Karimi, 2008). Selain menggunakan asam, hemiselulosa dapat dihidrolisis menggunakan enzim yaitu hidrolisis menggunakan enzim selulase dan
xilanase (Pason dkk, 2003; Kurnia Harlina Dewi, 2002). Hidrolisis enzimatik dapat mengurangi penggunaan zat kimia sehingga relatif lebih ramah lingkungan.
Secara umum mekanisme hidrolisis selulosa secara enzimatik, merupakan aksi sinergetik oleh endoglukanase (EC 3.2.1.4), exoglukanase atau selobiohidrolase (EC 3.2.1.91), dan β-glukosidase (EC3.2.1.21). Endoglukanase atau β-1,4-glukan-4-glukanohidrolase bekerja menghidrolisis ikatan glikosidik β-1,4 pada rantai selulosa secara acak. Aktivitas exoglukonase adalah memotong selulosa dibagian ujung rantai untuk menghasilkan selobiosa atau glukosa. β-glukosidase atau β-1,4-glukosida glukohidrolase (EC 3.2.1.21) mampu menghidrolisis selobiosa dan rantai pendek
selo-3 oligosakarida menjadi glukosa (Wu
dkk., 2006).
Enzim xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan substrat yang dihidrolisis, yaitu β-xilosidase, eksoxilanase, dan endoxilanase. Enzim β-xilosidase adalah enzim yang mampu menghidrolisis xilo-oligosakarida rantai pendek menjadi xilosa. Eksoxilanase mampu memutus rantai polimer xilan pada ujung reduksi, sehingga menghasilkan xilosa sebagai produk utama dan sejumlah oligosakarida rantai pendek. Sementara enzim endoxilanase mampu memutus ikatan β-1,4 pada bagian dalam rantai xilan secara teratur. Hasil hidrolisis xilan adalah xilo-oligosakarida dan xilosa (Perez dkk., 2002).
Sumber air panas Sonai merupakan salah satu daerah di
Sulawesi Tenggara yang potensial terdapat bakteri selulolitik dan xilanolitik termofilik. Hal ini disebabkan di sekitar sumber air panas terdapat area tanaman sagu (Rahmawati, 2011). Bervariasinya keanekaragaman hayati dan tingkat kelembaban yang tinggi serta substrat yang melimpah di kawasan ini sangat memungkinkan hidup berbagai jenis mikroorganisme, seperti bakteri yang memiliki aktivitas amilolitik, selulolitik dan xilanolitik tinggi.
Pada penelitian ini dilakukan isolasi bakteri potensial xilanolitik dan selulolitik dari sumber air panas Sonai Sulawesi Tenggara, yang selanjutnya digunakan untuk menghidrolisis ampas sagu. Supaya proses hidrolisis enzimatis berlangsung optimal maka dilakukan penentuan konsentrasi substrat, pH, kecepatan goyang
4
inkubator dan suhu optimum. Informasi ini diharapkan dapat membantu pengembangan bioindustri di Indonesia, antara lain industri bioetanol, pakan ternak.
2. Metodologi
2.1. Alat yang Digunakan
Spektrofotometer 20D+ (Thermo Scientific), sentrifus (Geneys),
laminar air flow, shaker inkubator,
timbangan analitik (Ohaus), pH meter (Hanna), oven, autoklaf (Astel), termometer, mikroskop dan peralatan-peralatan gelas.
2.2. Bahan yang Digunakan
Sampel air panas Sonai, ampas sagu, CMC (carboxymethylcellulose), xilan, xilosa, glukosa, NaOH 4 M, HCl 4 M, NaOH 2%, buffer pH 4–9. Media LB (Luria Bertani) dimodifikasi
(Pepton 0,5%, Yeast Extract 0,25%, NaCl 0,5%, CaCl2 0,01%, MgSO4 0,3%, H3BO3 0,001%, Na2MoO4.2H2O 0,001%, agar-agar 3%, air sampel). Media NB (Nutrient Broth) (pepto, 0,5%, BE 0,3%, KNO3 0,5%). Reagen DNS (1 g asam 3,5-asam dinitrosalisilat, 20 mL NaOH 2 N, dan 30 g Na-K-Tartrat dalam 100 mL)
2.3. Prosedur Kerja
Data penelitian ini diperoleh dengan menggunakan metode isolasi dan penapisan bakteri xilanolitik-selulolitik, hidrolisis ampas sagu menggunakan bakteri, dan analisis monosakarida yang terbentuk. Isolasi dan penapisan bakteri digunakan untuk memperoleh bakteri potensial hidrolisis hemiselulosa. Hidrolisis ampas sagu secara enzimatik oleh bakteri dilakukan untuk memperoleh
5 monosakarida. Banyaknya jumlah
monosakarida yang terbentuk dianalisis menggunakan metode DNS (dinitrosalisilat). Sampel bakteri diambil dari sumber air panas Sonai Sulawesi Tenggara pada 4 titik dengan karakteristik lingkungan yang berbeda. Isolasi bakteri dilakukan dengan metode dilution plate pada media
Nutrien broth (NB). Isolat yang
tumbuh selanjutnya diisolasi dan diidentifikasi. Identifikasi dilakukan dengan mengamati zona bening yang terbentuk pada media mengandung xilan dan selulosa (Sharma dan Bajaj 2005).
Penetapan kadar serat, protein, air, dan abu pada ampas sagu dilakukan menggunakan metode
AOAC (2005). Sebelum ampas sagu dihidrolisis, dilakukan delignifikasi dengan cara sampel direndam dalam
NaOH, kemudian dicuci sampai pH netral. Sampel terdelignifikasi dikeringkan pada suhu 80C (Li dkk.,
2010). Proses hidrolisis ampas sagu dilakukan pada kondisi optimum sehingga dapat diperoleh monosakarida dalam jumlah banyak. Optimalisasi proses hidrolisis ampas sagu (fermentasi) meliputi pengamatan pengaruh konsentrasi substrat, suhu, pH dan kecepatan goyang inkubator terhadap laju hidrolisis (Sharma dan Bajaj, 2005). Jumlah monosakarida yang dihasilkan dianalisis menggunakan metode Dinitrosalicylic Acid (DNS) (Miller dalam Sharma dan Bajaj 2005). Sebagai standar gula pereduksi digunakan glukosa standar.
6
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Seleksi mikroba xilanolitik dan selulolitik
Pengambilan sampel dari sumber air panas Sonai dilakukan pada enam titik (Tabel 1). Pemilihan titik sampling didasarkan pada karakteristik lingkungan di sekitar air panas, sehinggga diharapkan dapat menghasilkan enzim yang bersifat termostabil. Kondisi air panas pada tempat pengambilan sampel mempunyai pH 7 dan suhu berkisar 41-43 oC. Isolasi mikroba potensial xilanase dan selulase dilakukan hanya pada tiga titik air panas, yaitu mata air panas, air panas dekat dengan tanaman sagu, dan air panas kolam permandian. Sampel mikroba yang diperoleh diharapkan mampu mewakili keragaman mikroba di Sonai.
Bakteri xilanolitik dan selulolitik mampu memanfaatkan karbon dari limbah hemiselulosa sebagai sumber energi, dengan cara menghasilkan enzim xilanase dan selulase ekstraseluler untuk mendegradasi xilan dan selulosa yang terdapat di dalam media fermentasi. Isolat IIIB-3 menunjukan indeks xilanolitik dan selulolitik terbesar pada media mengandung xilan dan selulosa (Gambar 1). Semakin banyak enzim yang dihasilkan oleh bakteri xilanolitik dan selulolitik, maka zona bening yang terbentuk akan semakin luas karena xilan dan selulosa yang terdegradasi semakin banyak.
3.2. Optimasi proses hidrolisis ampas sagu
7 Ampas sagu diketahui
mempunyai kandungan serat kasar cukup tinggi, maka sangat dimungkinkan untuk dihidrolisis menjadi monosakarida (gula reduksi). Proses hidrolisis dengan bantuan mikroorganisme memerlukan kondisi,
antara lain suhu, pH, kecepatan goyang inkubator dan konsentrasi substrat pada proses fermentasi.
Kondisi ini merupakan faktor yang penting untuk pertumbuhan mikroorganisme dan pembentukan produk metabolitnya.
Tabel 1. Sampel air dari sumber air panas Sonai Sulawesi Tenggara
Sampel Asal pH Suhu (o C)
T1 Mata air 7 42
T2 Sekitar 20 meter dari T1 7 42
T3 Sekitar 15 meter dari T1 7 41
T4 Kolam permandian I (± 7 meter dari T1) 7 41 T5 Kolam permandian II (± 10 meter dari T1) 7 43
T6 Sekitar 5 meter dari T1 7 42
Suhu berpengaruh langsung terhadap kecepatan pertumbuhan mikroorganisme, kecepatan sintesis enzim dan inaktivasi enzim, serta kecepatan pembentukan produk (Knob dan Carmona 2008). Hasil eksperimen menunjukan isolat IIIB-3 masih
mampu tumbuh pada suhu 50C. Kondisi ini disebabkan isolat tersebut berasal dari sumber air panas yang bersuhu 41-43C. Proses hidrolisis ampas sagu pada penelitian ini dilakukan pada suhu 50C, karena pada suhu ini isolat IIIB-3 masih
8
mampu hidup selain itu suhu yang tinggi dapat mempercepat proses
hidrolisis.
pH merupakan salah satu faktor penentu pertumbuhan mikroorganisme dan pembentukan produk metabolitnya. Mikrorganisme memiliki rentang pH kultivasi yang cukup sempit untuk pertumbuhannya. Perbedaan aktivitas enzim terhadap suhu dan pH yang digunakan pada proses fermentasi dapat terjadi karena perbedaan interaksi kimia antar protein (Bataillon
et al., 2000). Isolat IIIB-3 dikultivasi
pada media dengan pH diatur 5-10.
Hasil hidrolisis maksimum diperoleh pada media dengan pH 6 yaitu 0,128 mg/mL (Gambar 2).
Aerasi berfungsi untuk mempertahankan kondisi aerobik dan mengatur temperatur substrat tetap konstan. Tingkat oksigen yang dibutuhkan untuk sintesis produk, jumlah panas metabolik yang harus dihilangkan dari bahan, ketebalan lapisan substrat, tingkat CO2 dan metabolit lain yang mudah menguap
Gambar 1. Aktivitas selulolitik dan xilanolitik bakteri isolat Sonai (Susilowati dkk, 2010)
9 harus dihilangkan, serta tingkat ruang
udara yang tersedia di dalam substrat (Richana, 2000). Tingkat aerasi sangat dipengaruhi oleh sifat mikroorganisme.
Pada penelitian ini menunjukan pada kecepatan goyang inkubator 175 rpm menghasilkan gula reduksi tertinggi yaitu 0.455 mg/mL.
Konsentrasi substrat adalah salah satu faktor penentu untuk pembentukan produk suatu reaksi enzimatik. Pada penelitian ini telah dilakukan variasi konsentrasi substrat 1-8%, untuk mengetahui konsentrasi ampas sagu yang optimum menghasilkan gula reduksi. Produksi gula reduksi tertinggi diperoleh pada konsentrasi substrat 5% dengan
kosentrasi gula yang dihasilkan sebesar 0.255 mg/mL (Tabel 2).
Mikroorganisme mempunyai waktu pertumbuhan bervariasi bergantung pada aktivitas metabolismenya. Fase-fase dalam pertumbuhan mikroorganisme sangat berpengaruh terhadap enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Enzim diekskresikan oleh
10
mikroorganisme untuk membantu pencernaan makanannya, yaitu menghidrolisis makromolekul yang
ada pada media hidupnya menjadi mikromolekul yang siap dimanfaatkan untuk pertumbuhannya.
Tabel 2. Kadar gula reduksi hasil hidrolisis ampas sagu
Ampas sagu (%) Gula hasil hidrolisis (mg/mL)
1 0,096
5 0.255
6 0.246
7 0.224
8 0.096
Hasil penelitian menunjukan waktu optimum produksi gula reduksi sebagai hasil hidrolisis ampas sagu
oleh isolat IIIB-3 adalah pada jam ke-18 waktu fermentasi (Gambar 3).
Gambar 3. Pengaruh waktu pertumbuhan isolat IIIB-3 terhadap jumlah gula reduksi
11
4. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian telah ditemukan 13 isolat bakteri potensial xilanolitik dan selulolitik dari sumber air panas Sonai Sulawesi Tenggara. Isolat bakteri IIIB-3 memiliki indeks xilonolitik dan selulolitik tertinggi dengan angka indeks berturut-turut 2,4 dan 6. Kondisi hidrolisis ampas sagu adalah substrat ampas sagu 5%, suhu 50C, pH 6, kecepatan goyang inkubator 150 rpm, dan waktu inkubasi 18 jam.
Ucapan Terima Kasih
Kepada Dirjen Dikti atas dukungan melalui dana penelitian PKMP Dikti Tahun 2011.
Pustaka
AOAC. (2005). Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemist. The Association of official Analitycal Chemist.
Awg-Adeni, D. S., Abd-Aziz, S., Bujang, K., & Hassan, M. A. (2010). Bioconversion of sago residue into value added products. African Journal of Biotechnology, 9(14), 2016-2021.
Bataillon, M., Cardinali, A. P. N., Castillon, N., Duchiron, F. . (2000). Purification and characterization of a moderately thermostable xylanase from Bacillus sp. strain SPS-0. Enzyme and Microbial Technology, 26, 187-192.
BPPS. (2008). Keadaan Pertanian Sulawesi Tenggara. Retrieved 1 April, 2012. Dewi, K. H. (2002). Hidrolisis limbah hasil
pertanian secara enzimatik. Akta Agrosia., 5(2), 67-71.
Knob, A., & Carmona, E. C. (2008). Xylanase production by Penicillium sclerotiorum and its characterization. World Applied Sciences Journal., 4(2), 277-283.
Li, M. F., Fan, Y. M., Sun, R. C., & Xu, F. (2010). Characterization of ekxtracted lignin of bamboo (Neosinocalamus affinis) preteaded with sodium hydroxide/urea solution at low temperature BioResources. , 5(3), 1762-1778.
Pason, P., Ratanakhanokchai, K., & Kyu, K. L. (2003). Multiple Cellulases and Xylanases of Bacillus circulans B-6. Biotechnology for Sustainable Utilization of Biological Resources in the Tropics Vol. 16. Proceedings of Project Seminars for JSPS-NCRT/DOST/LIPI/VCC, 305-310. Pe´rez, J., Munoz-Dorado, J., Rubia, T., &
Martınez, J. (2002). Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicelluloses and lignin: an overview. Int Microbiol. , 5, 53-63.
Rahim, R. (2011). Isolasi dan identifikasi mikroorganisme xilanolitik dari sumber air panas Sonai serta optimasi produksi enzim. Unpublished Skripsi, Universitas
12
Haluoleo, Kendari.
Richana, N., Lestari, P., Thontowi, A., & Rosmimik. (2000). Seleksi isolat bakteri lokal penghasil xilanase. Jurnal Mikrobiologi Indonesia. , 5(2), 54-56. Saha, B. C. (2004). Lignocellulose
Biodegradation and Application in Biotechnology. US Government Work. American Chemical Society, 2-14.
Sharma, P., & Bajaj, B. K. (2005). Production and partial characterization of alkali-tolerant xylanase from an alkalophilic Stretomyces sp. CD 3. Journal of Scientific & Industrial Research. , 64, 688-697.
Susilowati, P. E., Raharjo, S., Ardiansyah, R., R., Marwanti, S., & Zaeni, A. (2010). Screening thermostable microorganisms able to produces cellulase and xylanase enzymes. Proceeding CIEB (Conferences Industrial Enzyme and Biotechnology), 24-29.
Taherzadeh, M. J., & Karimi, K. (2008). Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production: A Review. Int. J. Mol. Sci, 9, 1621-1651. Wu, B., Zao, Y., & Gao, P. J. (2006). A new
approach to measurement of saccharifying capacities of crude cellulose. BioResources. 1(2). 189-200.
