Kuliah 4: Oktober 5, Pengenceran revisited OpenWetWare file names Spektrofotometri Praktikum Metabolisme

(1)

Ketrampilan Dasar Laboratorium

Program

Program Studi

Studi Ilmu

Ilmu Biomedik 20

Biomedik 2011

11 Kuliah 4: Oktober 5, 2010

Pengenceran “revisited”

OpenWetWare…file names

Spektrofotometri

(2)

Pengenceran

Pengenceran::

The ratio

a:b

is generally defined as the

quotient (

a/b

)

and is described as

a in b

.

2–4

However, it may also be expressed as a to b.

5,6

[meaning]…the

sum

a+b

.

a:b

Fishel, L.A. 2010. Dilution Confusion: Conventions for Defining a Dilution

Journal of Chemical Education 87:183-1185.

2. Kaplan LA, Pesce AJ, eds. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation. 5th ed. St Louis, Mo.: Mosby Elsevier; 2010:32.

3. Troy DB, ed. Remington—The Science and Practice of Pharmacy. 21st ed. Philadelphia, Pa.: Lippincott Williams & Wil-kins; 2006:119.

4. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. 4th ed. St. Louis, Mo.: Elsevier Saunders; 2006:27.

5. Darton M, Clark J. The Macmillan Dictionary of Measurement. New York, NY: Macmillan Publishing Co.; 1994:378.

6. The Random House Dictionary of the English Language. 2nd ed., unabridged. New York, NY: Random House; 1987:1602.

(3)

Pengenceran

Pengenceran::

Untuk mata kuliah Ketrampilan Dasar

Laboratorium, a:b selalu diartikan a/a+b

a:b

1:1



pengenceran 50% atau 1/2 dari awalnya

1:3



pengenceran 25% atau 1/4 dari awalnya

2:3



pengenceran 40% atau 2/5 dari awalnya

1:9



pengenceran 10% atau 1/10 dari awalnya

1:10



pengenceran <10% atau 1/11 dari awalnya

(4)

Filenames in

Filenames in OpenWetWare

OpenWetWare

Praktikum 4: Metabolisme I dan Spektrofotometri



Bahan Praktikum

Metabolisme I dan

Spektrofotometri



Artikel Dasar Kegiatan Praktikum Metabolisme

di sini

Tugas Mahasiswa (laporan) Praktikum 4

Tolonglah nama file Anda termasuk nama Anda/kelompok

Anda sendiri

Contoh:

"Abdi dan Mustafa laporan praktikum

metabolisme dan spektrofotometri.pdf“

(5)

Spectrophotometry

Basic Ideas:

i) If a molecule absorbs a photon of electromagnetic radiation, its energy level will riserise  EXCITED

STATE

ii) a molecule may vibrate in many ways, so there are many vibrational vibrational levelslevels iii) Absorption (and emission)

of energy is quantal (yaitu set values)

(6)

Basic ideas...

iv) Electromagnetic Spectrum: relationship between energy and wavelength

E = hc/

(h Planck’s constant=4.13566733×10−15_eV_s)

UV and visible

spectrum (~200-800nm) berguna

bagi penelitian molekul-molekul



electronic

transitions

X-ray or



-ray

energy tinggi



molekul

dihancurkan/kanker

IR

energi agak rendah



mendapat keterangan

tentang struktur molekul (

rotational or

vibrational transitions

)

(7)

(8)

UV and visible

spectrum (~200-800nm)

λ semakin kecil

energi semakin besar

** skala logarithmik**

Ada molekul/unsur yang

dapat menyerap cahaya

langsung pada

200nm < λ > 800nm

misalnya:

(9)

Absorption Spectra of DNA and protein

DNA and protein absorb energy in the UV region

(10)

Hasil

(11)

Spektra

Spektra absorpsi

absorpsi glukosa

glukosa dan

dan kolesterol

kolesterol

diambil dari: https://fscimage.fishersci.com/images/D10972~.pdf

Enzymatic Colorimetric Methods for the Analysis of Human Serum by UV-Visible Spectroscopy, Keppy et.al., Thermo Fisher Scientific

standar standar sempel sempel λ (nm) λ (nm) se rapan se rapan

glukosa

kolesterol

dasarnya: H₂O₂ bereaksi dengan fenol, 4-amino-antipirin serta peroksidase derivatif kuinonimin yang berwarna merah.

(12)

Protein dapat diukur dgn reagensia Biuret

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 480 500 520 540 560 580 600 620 panjang gelombang (nm) serap an

Puncak serapan pada

≈520 nm

Serapan cahaya dibanding dengan panjang gelombang cahaya pada reaski reagensia Biuret dengan protein

(13)

Alat Spektrofotometer :

A =



dc

% transmission =

100 x (I

_o

/I)

hubungan antara transmisi cahaya (I/ I_o) dgn konsentrasi sempel

d

I_o I

I_o= intensitas cahaya yang masuk I = intensitas cahaya yang keluar

d = jarak larutan yang dilalui cahaya (cm) c = konsentrasi larutan (mole/litre atau M)  = molar absorption coefficient (M-1_cm-1₎

log

₁₀

(I

_o

/I) = -dc

tapi lebih praktis untuk mengunakan konsep serapan

(absorbance) dimana , A = -log₁₀(I_o/I)

(14)

d

I_o I

I_o= intensitas cahaya yang masuk I = intensitas cahaya yang keluar

A = -log

₁₀

(I

_o

/I)

Kalau 0% cahaya diserap sempel??

I

_o

= I

 A = -log

₁₀

(1)  A = 0

Kalau 50% cahaya diserap sempel??

I

_o

> I

 A = -log

₁₀

(2)  A = 0,3

Kalau 99,9% cahaya diserap sempel??

(15)

Kalau nilai A yang diperoleh > 1,5

sebaiknya

sebaiknya sseempel diencerkan

mpel diencerkan dulu agar

dulu agar

hasilnya lebih akurat/ dapat dipercaya

2

Hukum Beer-Lambert

A =



dc

Hukum Beer-Lambert benar pada konsentrasi

yang berbanding lurus dengan A

(16)

Basic operation:

i) pakai sempel blanko dan sempel yg lain

ii) sempel blanko dimasukkan dulu untuk dinulkan sinyal pada  yg sedang digunakan

iii) sempel yg lain diperiksa pada  yg sama. iv)serapannya dibaca

spektrofotometer

Mode (transmittance or absorption) Wavelength adjustment Cuvette holder 100%T (0 absorbance) adjustment On/Off

kuvet

(17)

Praktikum

Praktikum 44

Metabolisme

Metabolisme I (

I (glukosa

glukosa, ,

trigliserida

trigliserida, urea)

, urea) dan

dan

Teknik

Teknik Spektrofotometri

Spektrofotometri



Kelompok praktikum



Bagian praktikum



Pengenceran



Grafik-grafik

(18)

Kelompok

Kelompok Praktikum

Praktikum

18

Kelompok

Kelompok 1 (

1 (masuk

masuk pk

pk 08:00):

08:00):

Dedy

Ernawati

Mara Imam

Fera

Roy

Taufik

Martina

Lily

Dorra

Anwar

Kelompok

Kelompok 2 (

2 (masuk

masuk pk

pk 12:00):

12:00):

Taya Elsa

Leo

Yeni

Dita

Musthari

Ningrum Donny

Siti

Sukaisi

(19)

Cara

Cara kerja

kerja....

....

1. Pengenceran - doubling dilution dan decimal dilution dari larutan stok glukosa dan urea (meja 1,3,5 mengerjakan pengenceran larutan stok urea dan meja 2,4 mengerjakan pengenceran larutan stok glukosa)

2. Sempel darah diambil (boleh semua mhs, paling sedikit seorang dari grup meja Anda). 1ml darah cukup.

3. Darah disentrifugasi biar serum dapat diambil

4. Kerjakan pemeriksaan glukosa, trigliserida serta urea pada sempel serum sesuai dengan prosedurnya

(20)

Cara

Cara kerja

kerja....

....

GLUKOSA TRIGLISERIDA U_REA

volume reagensia kit 1000l reagensia glukosa 1000l reagensia R2 1000l reagensia A, kemudian 1000l reagensia B volume sampel 10l 10l 10l konsentrasi standard kit 100mg/dl 200mg/dl 40mg/dl periode dan temperatur inkubasi 10 min @ 37C 5 min @ 37C 5 min @ 25C ** 2X** periksa pada λ 500nm 530nm 600nm

(21)

Hasilnya

Hasilnya....

....

Tabel 1a s/d 2b

faktor konsentrasi grup meja__ grup meja__ 1 2 4 8 16 32 64 128 blanko konsentrasi ser apa n

Hitung garis regresi (linear regression) pada data yg diperoleh. Rumus yang dihasilkan berbentuk y= mx + b dimana y = serapan; x = konsentrasi dan “m” merupakan slope

(22)

Hasilnya

Hasilnya....

....

Tabel 3 GLUKOSA UREA mhs: ______ mhs: ______ mhs: ______ mhs: ______ Serapan sempel dari grafik 1a/2a dari grafik 1b/2b dari rumus kit

maksudnya dari rumus

garis regresi y= mx + b

}

contoh urea:

A

_sempel

/A

_standar

x 40mg/dl

(23)

Hasilnya

Hasilnya....

....

Tabel 4 Hasil pemeriksaan glukosa, trigliserida dan urea plasma mahasiswa

data kelas

ser

apa

n

detil2_mhs_{(berapa lama sejak}

makan; rata-rata apa yg dimakan; jenis kelaminan; umur)

GLUKOSA TRIGLISERIDA UREA

A kadar A kadar A kadar 1.

2.

(24)

Laporan

Laporan dan

dan proposal

proposal Metabolisme

Metabolisme II

II

Laporan * satu laporan per grup meja

1-2 halaman selain Tabel 3 dan 5 grafik

 kata-kata sendiri

 perubahan yang ada dicatat

 3 kesimpulan dari setiap grafik (5 grafik yang berdasar

Tabel 1a, 1b, 2a, 2b serta Table 4)

 komentar atas kebuktian (atau tidak) Hukum Beer-Lambert

 komentar atas hasil pada Tabel 3.

(25)

Laporan

Laporan dan

dan proposal

proposal Metabolisme

Metabolisme II

II

Proposal untuk Praktikum Metabolisme II (dibuat masing-masing)

Dari data dan pengalaman Anda pada praktikum ini, pikirkan suatu hipotesis dan mendesain suatu percobaan yang bisa membuktikan hipotesis Anda itu benar atau tidak dan yang bisa diuji dalam konteks praktikum (ingatlah

keterbatasan waktu dan alat!!)

 Siapkan cara kerja/proposal yang lengkap dan jelas

 proposal akan dikumpulkan (secara hardcopy) pada UTS (tgl 10 Nopember)

 akan dikomentar dikembalikan kepada Anda sebelum akhir bulan Nopember.

 Anda boleh bergabung dengan seorang mhs lain (terserah Anda) sebagai grup meja untuk praktikum Metabolisme II dan boleh memilih satu

proposal di antara kalian berdua untuk mengerjakan bersama-sama pada jam praktikum pada tgl 15 Desember 2011.