Dibandingkan dengan tipe sel lain seperti sel fibroblas dan epitel, kultur primer sel saraf otak lebih susah ditumbuhkan. Sel saraf berkembang dari progenitor saraf dan tidak mampu membelah ketika sudah mature, berbeda dengan sel fibroblas dan epitel yang kemampuan pertumbuhannya masih bagus meskipun sudah mature. Selain itu sel harus beradaptasi dengan lingkungan (Mather dan Roberts 1998) dan berinteraksi dengan populasi sel yang tidak homogen pada awal kultur primer. Oleh karena itu dibutuhkan medium yang mampu mempertahankan daya hidup pada kultur primer sel saraf otak. Insulin transferrin selenium (ITS) diketahui mampu meningkatkan daya hidup dan proliferasi sel (Freshney 1994). Kebanyakan medium kultur tidak mengandung ITS sehingga ingin diketahui pertumbuhan sel saraf dalam medium yang mengandung ITS. Penambahan ITS diharapkan dapat meningkatkan proliferasi sel.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mengetahui kemampuan pertumbuhan secara in vitrosel-sel saraf yang diisolasi dari otak besar anak tikus umur tiga hari dan secara khusus untuk mengidentifikasi tipe-tipe sel yang tumbuh, tingkat proliferasi, population doubling time (PDT) dan panjang akson dan dendrit serta gambaran kualitatif protein yang disekresikan.
Manfaat
Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini adalah mendapatkan informasi tentang kemampuan pertumbuhan secara in vitrodan tingkat proliferasi selsaraf otak besar anak tikus dalam medium dengan dan tanpa penambahan ITS. Selain itu juga dapat dimanfaatkan untuk menghasilkan
conditioned mediumdan galur sel.
TINJAUAN PUSTAKA
Sel Saraf Otak
Otak merupakan bagian dari sistem saraf yang termasuk dalam susunan saraf pusat. Otak terdiri atas sel-sel saraf yang jumlahnya diperkirakan mencapai 100 milyar sel (Freudenrich 2001; Kuntarti 2007). Otak berfungsi dalam mengkoordinasi, mengontrol, dan mengatur seluruh aktivitas tubuh (Freudenrich
2001). Bagian-bagian otak vertebrata secara umum antara lain cerebrum, diensefalon, cerebellum, midbrain, pons, dan medulla oblongata (Kuntarti 2007). Bagian-bagian otak pada tikus dapat dibagi menjadi beberapa bagian utama yaitu otak depan (forebrain), batang otak (brain stem), otak tengah (midbrain), cerebellum, dan medulla oblongata. Otak depan terdiri atas korteks serebri, hippocampus, dan bulbus olfactorius. Batang otak meliputi ganglia basalis, septum, epithalamus, thalamus, dan hypothalamus. Sedangkan otak tengah meliputi tectum, tegmentum, dan pedunculi cerebri (Hedrich & Bullock 2004).
Secara umum sistem saraf disusun oleh jaringan saraf yang terdiri atas sel-sel saraf atau neuron dan sel-sel pendukung atau sel-sel glia (Beresford 2001; Junqueira & Carneiro 2005). Neuron memiliki bagian-bagian yang sama seperti sel yang lain akan tetapi memiliki kemampuan yang istimewa yaitu kemampuan mentransmisikan sinyal dan menyampaikan pesan menuju sel target (Freudenrich 2001) sehingga dapat menjalankan fungsi sistem saraf seperti mengingat, berfikir, dan mengontrol semua aktivitas tubuh. Secara khusus neuron juga berfungsi dalam merangsang aktivitas sel tertentu dan melepaskan neurotransmitter dan molekul lain (Junqueira & Carneiro 2005). Sel glia atau neuroglia berfungsi untuk melindungi, mendukung, merawat, dan mempertahankan homeostasis cairan di sekeliling neuron (Kuntarti 2007).
Morfologi dan Fungsi Berbagai Jenis Sel Otak
Neuron terdiri dari tiga bagian utama yaitu dendrit, badan sel, dan akson (Gambar 1). Dendrit merupakan penjuluran-penjuluran kecil yang memanjang berfungsi dalam menerima stimulus dari lingkungan, sel sensoris atau sel saraf lainnya (Junqueira & Carneiro 2005). Badan sel berukuran besar mengandung bagian-bagian utama sel seperti nukleus, reticulum endoplasma, ribosom, dan mitokondria. Kerusakan pada badan sel menyebabkan kematian pada sel saraf (Freudenrich 2001). Badan sel berfungsi menerima stimulus dari dendrit untuk diteruskan menuju akson. Akson berupa penjuluran tunggal yang keluar dari badan sel. Fungsi akson yaitu menghubungkan stimulus menuju sel lainnya seperti sel saraf, otot, dan kelenjar. Bagian distal akson biasanya bercabang dan
berhubungan dengan sel lain baik sel saraf maupun sel lainnya membentuk struktur yang disebut sinaps (Junqueira & Carneiro 2005).
Gambar 1 Morfologi neuron di dalam kultur, N: nukleus, P: perikaryon, D: dendrit, A: akson, H: axon hillock, tanda panah: sel glia (Kerr 2000).
Neuron memiliki bentuk yang bervariasi. Berdasarkan bentuknya neuron dapat dikelompokkan menjadi neuron multipolar, bipolar, dan unipolar atau pseudounipolar (Gambar 2) yang didasarkan atas jumlah penjuluran akson dan dendrit (Junqueira & Carneiro 2005). Neuron multipolar memiliki satu penjuluran akson dengan banyak penjuluran dendrit. Neuron bipolar memiliki masing-masing satu penjuluran dendrit dan akson sedangkan neuron unipolar hanya memiliki satu penjuluran yang dekat dengan badan sel dan membagi menjadi dua cabang. Kebanyakan neuron dalam tubuh berbentuk multipolar (Cormack 2001; Junqueira & Carneiro 2005). Neuron bipolar dapat ditemukan pada ganglion cochlearis dan ganglion vestibularis serta pada retina dan mukosa olfaktorius. Neuron unipolar banyak ditemukan pada ganglion kranialis dan juga dapat ditemukan pada ganglion spinalis (Junqueira & Carneiro 2005).
Sel glia terdiri dari astrosit, oligodendrosit, sel Schwann, sel-sel ependymal, dan mikroglia (Gambar 2). Sel glia lebih banyak jumlahnya dibandingkan dengan neuron. Sel glia terletak di sekitar sel saraf mengelilingi badan sel, dendrit, dan akson. Astrosit, oligodendrosit, sel-sel ependymal, dan mikroglia dapat ditemukan pada sistem saraf pusat sedangkan sel Schwann ditemukan pada saraf perifer (Junqueira & Carneiro 2005). Masing-masing sel
glia memiliki fungsi yang spesifik. Astrosit berfungsi dalam mengontrol sinyal antarneuron, mengatur ion dan metabolisme sel saraf, serta sebagai blood brain barrier (Cormack 2001). Oligodendrosit dan sel Schwann memiliki fungsi yang sama yaitu bertanggung jawab dalam sintesis selubung myelin, sedangkan mikroglia berfungsi sebagai makrofag. Sel-sel ependymal merupakan komponen sel glia yang menyusun plexus choroideus. Sel-sel ependymal berfungsi dalam sekresi dan pergerakan cairan serebrospinal (Junqueira & Carneiro 2005).
Gambar 2 Berbagai tipe neuron dan sel glia (Cormack 2001).
Kultur Sel Saraf
Kultur sel adalah kultur sel-sel yang berasal dari organ atau jaringan yang telah diuraikan secara mekanis dan atau secara enzimatis menjadi suspensi sel. Suspensi sel tersebut kemudian dibiakkan menjadi satu lapisan jaringan (monolayer) di atas permukaan yang keras seperti botol, tabung, dan cawan atau menjadi suspensi sel dalam media penumbuh (Malole 1990). Kultur primer berarti menumbuhkan sel dari jaringan hewan secara langsung dalam medium penumbuh (Butler 2004). Kebanyakan kultur primer sel saraf didapatkan dari jaringan saraf tikus pada masa embrionik atau neonatal (Banker & Goslin 1998; Butler 2004). Sel-sel pada masa embrionik tersebut lebih mudah didispersi dan memiliki potensi pertumbuhan yang lebih unggul (Butler 2004). Di antara mamalia, tikus dan mencit merupakan spesies yang umum digunakan sebagai sumber jaringan pada
kultur saraf (Banker & Goslin 1998; Fedoroff & Richardson 2001). Penggunaan tikus dan mencit dapat memberikan keuntungan terutama pada konsistensi genetik dan biaya yang tidak terlalu mahal (Banker & Goslin 1998).
Sel saraf dapat juga ditumbuhkan dari neural cell line (Murayama et al. 2001). Beberapa neural cell line telah dikembangkan seperti neuronal cell line, glial cell line, embryonal carcinoma cell line, dan melanoma cell line. Keuntungan menggunakan cell line antaralain memiliki kemampuan hidup lebih lama, pertumbuhannya tidak terbatas, dan terdiri dari satu jenis sel tunggal. Selain itu penggunaan cell line sebagai sumber kultur dapat mengurangi penggunaan hewan coba (Murayama et al. 2001). Ketersediaan sel tunggal dalam jumlah cukup besar dalam kultur dapat memberikan keuntungan untuk purifikasi bahan alami maupun rekombinan. Misalnya untuk produksi neuroendokrin yang jumlahnya dalam tubuh sangat sedikit. Meskipun demikian kultur sel saraf dari sumber cell line memiliki kekurangan terutama karena ketiadaan beberapa jenis sel yang berkembang dalam sistem saraf secara in vivo (Murayama et al.2001).
Sistem Kultur
Kultur sel membutuhkan medium dan lingkungan yang sesuai dengan kondisi in vivo. Kondisi ini diciptakan dengan pengaturan temperatur, pH, oksigen, CO2, tekanan osmosis, permukaan untuk melekat sel, nutrien dan vitamin, proteksi terhadap zat toksik, hormon, dan faktor pertumbuhan yang mengatur pertumbuhan dan diferensiasi sel (Malole 1990). Temperatur yang ideal untuk pertumbuhan sel adalah pada 37°C (Pollard & Walker 1990) dengan pH optimal 7,4 (Malole 1990). Selama kultur diusahakan pH tidak lebih rendah dari 7,0 karena pH yang rendah akan memperlambat pertumbuhan sel. Kestabilan pH dapat dijaga dengan sistem buffer karbondioksida-karbonat sama seperti dalam darah (Malole 1990). Sistem tersebut terdiri dari penambahan NaHCO3 dalam medium dan udara yang mengandung karbondioksida 5%. (Malole 1990). Permukaan untuk melekat sel harus memiliki daya adhesif. Beberapa bahan tertentu dapat digunakan sebagai substrat untuk melekatkan sel seperti fibronectin, gelatin, dan kolagen (Butler 2004).
Sel di dalam tubuh organisme menerima nutrisi dari sirkulasi darah. Medium untuk kultur sel in vitro harus mampu menyuplai nutrisi yang sama seperti keadaan nutrisi pada darah (Radledge & Kristiansen 2001). Awalnya untuk menumbuhkan sel mamalia in vitro melibatkan medium yang berasal dari bahan alami seperti embrio ayam, serum, dan cairan limfe. Tetapi sejak tahun 1950 ditemukan medium kultur yang mengandung berbagai komponen penting dan sudah banyak perkembangan.
Medium dasar untuk kultur sel adalah larutan garam seimbang. Larutan ini berfungsi untuk menciptakan pH dan osmolaritas fisiologis yang dibutuhkan untuk mempertahankan viabilitas sel in vitro. Untuk menciptakan kondisi yang mampu merangsang proliferasi sel, dalam medium perlu ditambahkan glukosa, asam amino, vitamin, dan beberapa garam tertentu yang dibutuhkan sesuai jenis sel yang dikultur (Radledge & Kristiansen 2001).
Medium pertumbuhan yang sering dipakai untuk kultur sel mamalia adalah Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). Medium tersebut merupakan modifikasi dari Basal Medium Eagle (BME) yang mengandung konsentrasi asam amino dan vitamin empat kali lipat lebih banyak. Asam amino dan vitamin yang ditambahkan dalam media berfungsi sebagai suplemen tambahan. Awalnya DME mengandung 1000 mg/L glukosa dan dilaporkan pertama kali digunakan untuk kultur embrio tikus. Selain asam amino dan vitamin, medium ini juga mengandung asam folat, nikotinamid, riboflavin, vitamin B-12, dan garam mineral seperti kalsium korida, potasium klorida, magnesium sulfat, sodium klorida, dan monosodium fosfat. Natrium bikarbonat digunakan sebagai sumber karbonat yang dapat mempertahankan pH dan osmolaritas (Mather dan Barnes 1998). Medium DMEM sangat cocok digunakan dalam berbagai kultur sel termasuk sel-sel yang berasal dari manusia, monyet, hamster, tikus, mencit, ayam, dan ikan (Pombinho et al. 2004).
Medium kultur dapat juga ditambahkan komponen lain seperti ITS. Suplemen ITS mengandung tiga komponen faktor pertumbuhan yang penting untuk beberapa tipe sel tertentu. Insulin penting dalam pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel sedangkan transferrin merupakan protein pengangkut zat besi (iron-transport protein) yang fungsinya sama seperti insulin (Banker &
Goslin 1998). Selenium berfungsi sebagai kofaktor sintesis glutathione, yaitu membantu memecah peroksida dan superoksida. Dilaporkan juga bahwa selenium mampu melindungi kerusakan yang distimulasi oleh cahaya (Banker & Goslin 1998). Selain itu selenium juga dapat mengoptimalkan pertumbuhan sel. Kebanyakan medium basal untuk kultur sel tidak mengandung ITS. Penambahan ITS diketahui mampu mengurangi penggunaan serum dalam medium. Banyak cell line seperti BHK, HeLa, Vero, MDCK, dan CHO dapat tumbuh dengan penambahan ITS meskipun serum yang digunakan 1-2% (Anonimus 2005).
Sel tidak dapat hidup hanya dengan medium basal saja (Banker & Goslin 1998). Kebutuhan akan nutrisi dan faktor pertumbuhan untuk pemeliharaan sel dapat disediakan dalam medium dengan penambahan serum. Serum yang digunakan dapat diperoleh dari berbagai hewan seperti sapi (Fetal Calf Serum (FCS), Newborn Calf Serum (NBCS)), kuda, dan manusia (Mather & Barnes 1998). Jumlah serum yang ditambahkan biasanya 5-20% (Shuler & Kargi 1992; Banker & Goslin 1998). Menurut Banker dan Goslin (1998) FCS mengandung faktor mitogenik yang tinggi sehingga sering digunakan untuk keperluan kultur cell line atau kultur primer sel glia. Serum terbukti dapat mendukung pertumbuhan sel melalui penyediaan faktor hormonal, pertumbuhan, perlekatan, dan penyebaran sel (Mather & Roberts 1998) serta menyediakan transport protein pembawa hormon, mineral, dan lipid (Shuler & Kargi 1992). Penggunaan antibiotik dalam medium juga diperlukan untuk mencegah kontaminasi (Jakoby & Pastan 1979). Antibiotik yang sering digunakan dalam medium adalah gentamisin (Mather & Roberts 1998).
Pemanfaatan Kultur Sel Saraf
Kultur sel memiliki banyak manfaat terutama untuk menyelidiki karakteristik fisiologi dan metabolisme sel. Kultur sel juga bermanfaat dalam pengujian efek zat tertentu terhadap suatu sel. Zat toksik dan bahan-bahan mutagenik dapat dievaluasi di dalam kultur (Butler 2004). Selain itu kultur sel dapat digunakan untuk memproduksi bahan-bahan untuk mendiferensiasikan stem cell menjadi sel spesifik. Secara khusus, kultur sel saraf memiliki potensi untuk dimanfaatkan dalam terapi penyakit degenerasi saraf seperti Alzheimer dan
penyakit Parkinson. Hal ini karena sel saraf sendiri memiliki stem cell yang disebut sebagai neural stem cell (Halim et al.2010). Stem cellpada jaringan saraf dimanfaatkan untuk regenerasi sel-sel saraf yang rusak. Saat ini penelitian baik riset maupun klinis telah banyak dilakukan untuk mengarahkan diferensiasi neural stem cellmenjadi sel saraf (Halim et al.2010)
Protein yang Dihasilkan oleh Sel Saraf
Otak menghasilkan bermacam-macam protein yang disekresikan oleh sel saraf maupun sel glia. Menurut Quarles et al. (2006) protein menyusun bagian otak tikus sebanyak 56,9%. Salah satu protein yang dihasilkan oleh sel saraf adalah protein tau. Protein ini dihasilkan dari bagian akson yang berfungsi dalam menstabilkan dan meningkatkan pembentukan mikrotubuli neuron serta meningkatkan viabilitas neuron (Hansson 2008). Bagian lain sel saraf seperti selubung myelin juga menghasilkan protein yaitu myelin basic protein(MBP) dan proteolipid protein(PLP). Kedua protein ini dapat larut dalam SDS elektroforesis dan dapat dipisahkan berdasarkan berat molekulnya (Quarles et al.2006).
Selain protein, sel saraf juga mensekresikan beberapa growth factorseperti nerve growth factor (NGF), glial derived neurotrophic factor (GDNF), nestin, dan glial fibrillary acidic protein (GFAP). Astrosit diketahui mampu mensekresikan fibroblast growth factor-1 (FGF-1) berdasarkan penelitian Ito et al. (2005).
Metode Analisis Protein Sel Saraf
Identifikasi protein dapat dilakukan dengan berbagai macam metode diantaranya liquid phase isoelectric focusing (IEF), imunopresipitasi, mass spectrometry (MS), dan gel elektroforesis (Hansson 2008). Protein merupakan molekul yang bersifat amfoter yang mengandung grup asam dan basa pada sekuen asam amino sehingga muatan protein akan bervariasi berdasarkan pH. Sifat demikian dimanfaatkan untuk memisahkan protein berdasarkan titik isoelektrik (pI) masing-masing protein dengan IEF. Titik isoelektrik akan berhenti pada pH spesifik ketika muatan protein sama dengan nol (Hansson 2008). Pemisahan protein dapat juga dengan metode imunopresipitasi apabila sampel biologis mengandung beberapa macam protein. Metode MS digunakan untuk menganalisis
massa protein berdasarkan rasio massa per muatan. Selain itu MS juga memberikan informasi tentang sekuen dan perubahan asam amino (Hansson 2008).
Penelitian ini menggunakan gel elektroforesis untuk menganalisa protein. Elektroforesis mampu memisahkan protein dengan baik berdasarkan titik isoelektrik dan berat molekul. Biasanya metode yang digunakan adalah SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate – polyacrilamide gel electrophoresis ) (Hansson 2008). Menurut Roe (2001) dan Ahmed (2005) SDS-PAGE merupakan metode yang cukup cepat dalam identifikasi protein dan sering digunakan untuk memperkirakan berat molekul serta menentukan komposisi subunit dari suatu protein murni (Deutscher 1992). Penggunaan lain SDS-PAGE adalah untuk monitoring purifikasi protein, verifikasi konsentrasi protein, deteksi proteolisis, deteksi modifikasi protein, dan deteksi imunopresipitasi protein (Ahmed 2005).
Mekanisme kerja SDS-PAGE sama seperti elektroforesis pada umumnya akan tetapi ditambahkan dengan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebelum dilakukan elektroforesis. Adanya SDS yang merupakan bahan detergen anionik ini akan mendenaturasi protein lalu melekat kuat pada molekul yang diuraikan tersebut. Satu molekul SDS diperkirakan mengikat dua asam amino. Molekul SDS ini lalu menutupi permukaan protein dan membentuk jejaring muatan negatif yang dihasilkan dari grup sulfat pada molekul SDS. Semua protein akan bermuatan negatif dengan berat jenis yang sama sehingga protein tersebut hanya dapat dipisahkan berdasarkan ukurannya (Hames 1998). Protein dengan berat molekul rendah akan bergerak lebih cepat di dalam gel dibandingkan dengan protein dengan berat molekul besar. Berdasarkan prinsip tersebut berat molekul suatu protein dapat diperkirakan dengan memasukkan marker protein standar yang sudah diketahui berat molekulnya dalam gel yang sama (Ahmed 2005).
Elektroforesis dapat dilakukan dalam dua sistem bufer yaitu sistem langsung dan tidak langsung. Sistem langsung (continuous system) hanya menggunakan satu separating gel serta buffer yang sama baik pada gel maupun bak elektroforesis sedangkan pada sistem tidak langsung (discontinuous system) terdiri dari dua macam gel yaitu separating gel dan stacking gel. Kedua gel ini memiliki daya rembes, daya ion, dan pH yang berbeda. Kelebihan penggunaan
sistem ini adalah didapatkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan tanpa stacking geldalam volume sampel yang sama (Ahmed 2005).
Deteksi protein dalam gel dilakukan dengan berbagai macam pewarnaan seperti coomassie blue, silver nitrat, dan amido black (Ahmed 2005). Coomassie blue merupakan pewarnaan yang cepat dan sering digunakan untuk visualisasi protein pada gel poliakrilamid (Ahmed 2005; Bonner 2007). Protein dapat terdeteksi oleh coomassie blue apabila konsentrasi sampel protein yang diloading dalam gel sebelum tahapan rehidrasi sebanyak 500 µg sampai dengan 1 mg (Blot 2003). Dibandingkan dengan coomassie blue, pewarnaan silver nitrat jauh lebih sensitif (Janson & Ryden 1998; Blot 2003) bahkan pada konsentrasi nanogram, akan tetapi membutuhkan waktu lebih lama (Ahmed 2005).
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari-Juli 2010 di Laboratorium Embriologi dan Laboratorium Layanan Pendidikan Terpadu, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
