Cytotoxic study of Pandanus conoideus Lam extract and oil
on human lymphocytes in vitro
Sukirno*, Fransiska Zakaria Rungkat**, Nurheni SriPalupi** *Pusat Riset Obat dan Makanan, Badan POM RI
Gedung Pusat Riset Jl. Percetakan Negara No.23 - Jakarta 10560 **Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor
Jalan Raya Darmaga Bogor Jawa Barat 16003
ABSTRAK
Buah merah (Pandanus conoideus Lam) diduga memiliki sejumlah senyawa yang memiliki efek potensial da-lam meningkatkan respon imun. Buah merah mengandung karotenoid sebesar 55.000 ppm (9.185 β-karoten, 3.685 α-tokoferol, dan 42.009 tokoferol total). Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi efek sitotoksik buah merah. Uji menggunakan kultur sel limfosit manusia yang diberi perlakuan ekstrak metanol, n-heksan, air, dan minyak atsiri buah merah dengan konsentrasi 8.3; 33.3; dan 66.7 µg/mL. Inkubasi perlakuan selama 72 jam 370C. Sel limfosit dihitung manual dengan triphan blue dan dianalisa dengan metode MTT
[3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazolium]. Hasil penelitian menunjukkan bahwa mortalitas sel menurun secara dramatis dan berkorelasi positif dengan besaran konsentrasi ekstrak dan minyak atsiri buah merah. Kultur sel dengan perlakuan ekstrak air 8.3 µg/ml menurunkan mortalitas sel dari 134x104 menjadi 22x104 sel/ml,
per-lakuan minyak atsiri 33.3 µg/ml dari 100x104 menjadi 38x104 sel/ml, ekstrak metanol 8.3 µg/ml dari 78x104
menjadi 64x104 sel/ml, dan ekstrak n-heksan 8.3 µg/ml dari 92x104 menjadi 66x104 sel/ml. Dapat
disimpul-kan bahwa ekstrak dan minyak atsiri buah merah tidak toksik terhadap sel limfosit manusia. Toksisitas sel ter-gantung pada polaritas dan dosis ekstrak/minyak atsiri, polaritas dan konsentrasi tertinggi mengindikasikan toksisitas sel yang paling rendah.
Kata kunci: buah merah (Pandanus conoideus Lam), sitotoksik sel limfosit, respon imun
ABSTRACT
Buah merah (Pandanus conoideus Lam) has been assumed to contain a great number of substances which have potential effect in increasing immune responses. Buah merah contain carotenoid 55.000 ppm (β-caroten 9.185, α-tocopherol 3.685 and tocopherol total 42,009 ppm).This research was aimed to evaluate cytotoxic effect of buah merah. This study was carried out by treating human lymphocyte cell culture with methanol, n-hexana, water extracts and oil of buah merah with various dosages 8,3; 33,3 and 66,7 µg/ml, then incubated at 37°C, for 72 hours. The lymphocyte cells were counted manually with triphan blue and analized by MTT method.The result showed that cell mortality decreased dramatically with the increase of dosage of all extracts and oil of buah merah. Cells cultured with the addition of 8.3 µg/ml water extracts resulted decreasing of cell mortality from134x104 to 22 x104 sel/ml, with the addition of 33.3 µg/ml oil decreased from 100x104 to 38x104 cell/ mL and
the addition of 8.3 µg/ml methanol extracts decrease cell mortality from 78x104 to 64x104 cell/ml, and with 8.3
µg/ml n-hexana extracts decreased from 92x104 to 66x104 cell/ml.It can be concluded that extracts and oil of
Pandanus conoideus Lam were not toxic to human lymphocyte cells. The cell toxicity depends on the polarity and dosage of the extracts/oil, the highest polarity and dose indicate the lowest cell toxicity.
PENDAHULUAN
Indonesia merupakan salah satu negara yang kaya akan keanekaragaman hayati terutama tumbuh-tumbuhan. Ada lebih dari 30.000 jenis tumbuhan yang terdapat di Indonesia, dan lebih dari 1.000 jenis telah diketahui dapat dimanfaatkan untuk pengobatan. Obat bahan alam yang telah terdaftar di Badan POM hingga saat ini berjumlah 11.776 produk, sedangkan jumlah industri obat bahan alam Indonesia pada saat ini berjumlah 1046 industri (Sampurno, 2004). Hal ini mendorong bekembangnya penelitian pengembangan bahan alam sebagai obat, makanan dan kosmetika. Penelitian khasiatdan keamanan dapat dilakukan secara praklinik maupun klinik. Uji praklinik dapat dilakukan secara invivo maupun invitro (World
Heath Organization, 1993).
Salah satu bahan alam yang popular dimanfaatkan sebagai obat bahan alam adalah buah merah. Buah merah diklaim dapat menanggulangi beberapa penyakit, walaupun belum didukung oleh hasil penelitian ilmiah, seperti HIV/AIDS, stroke, kanker payudara, kanker rahim, thalasemia, asam urat, tekanan darah tinggi, tumor, kista, diabetes, gangguan prostat, dan gangguan imunitas serta sebagai hepatoprotektor. Buah merah dapat berfungsi sebagai pereda batuk, penghalus kulit, pengering luka, penyubur rambut, dan obat cacing. Di samping efek yang menguntungkan ada pula dampak negatip yang dilaporkan akibat konsumsi buah merah, antara lain diarhe, warna faeces dan urine membiru, dan penurunan hemoglobin (Redaksi Agro Media, 2005).
Dengan adanya klaim khasiat dan efek
samping tersebut, maka perlu dilakukan penelitian tentang khasiat dan toksisitas. Penelitian ini bertujuan mengamati toksisitas khususnya sifat toksik terhadap sel-sel limfosit manusia dari pengaruh pemberian ekstrak dan minyak buah merah. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai sifat toksik buah merah yang dapat digunakan sebagai salah satu dasar pengambilan kebijakan dan keputusan oleh Badan POM terhadap konsumsi buah merah sehingga masyarakat dapat terlindungi. Selain itu dapat merupakan dasar untuk penelitian dan pengembangan buah merah lebih lanjut.
METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Pusat Riset Obat dan Makanan Badan POM dan di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Kedokteran Hewan IPB, bulan Februari-Maret 2006.
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah buah merah segar yang diperoleh dari Papua. Sedangkan bahan kimia yang diperlukan untuk mengisolasi dan uji invitro limfosit adalah darah segar dari donatur yang sehat, ficoll/ Histopaque-1077, RPMI-1640 (Gibco BRL), NaHCO3, aquabidest, Phospat Buffer Saline (PBS) pH 7.4, Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma Chemical, USA), antibiotik penisilin-streptomisin, MTT(3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-difenil-tetrazolium), larutan biru tripan, larutan HCl-isopropanol 0,04N, Na2HPO4/Na2HPO4.2H2O, alkohol 70%.
Identifikasi Buah Merah
Identifikasi sistematika/taksonomi buah merah dilakukan di Herbarium Bogoriense Pusat Penelitian Biologi, LIPI di Bogor, dengan metode analisa DNA secara molekular (Keim, 2005).
Pembuatan ekstrak dan minyak buah merah
Pembuatan minyak
Buah merah segar yang disimpan dalam
deep freezer, dikeluarkan, dilakukan thawing pada
suhu kamar lalu buah merah ditimbang sebanyak 700 gram dan dikukus. Kemudian kukusan buah merah tersebut dimaserasi hingga keluar cairan, setelah disaring cairan tersebut direbus pada temperatur ± 45°C selama 72 jam hingga keluar minyaknya. Kemudian minyak ditimbang untuk menentukan rendemen.
Pembuatan ekstraksi metanol
Buah merah ditimbang sebanyak 100,9 gram, dimaserasi dengan metanol 500 ml, kemudian dimaserasi lagi dengan metanol 350 ml. Selanjutnya dimaserasi kembali dengan metanol sisa pelarut rotavapor, disaring didapat maserat ketiga lalu dilakukan evaporasi. Ekstrak ditimbang untuk menentukan rendemen.
Pembuatan ekstraksi heksana
Buah merah ditimbang sebanyak 100,5 gram, dimaserasi dengan 500 mL n–heksana. Setelah 3 hari dimaserasi kembali dengan 350 mL n-heksana. Setelah 24 jam dimaserasi kembali dengan n-heksana sisa pelarut dari rotavapor, lalu setelah 24 jam disaring, untuk mendapatkan maserat ketiga. Setelah pelarut diuapkan ekstrak ditimbang untuk menentukan rendemen.
Pembuatan ekstrak air
Buah merah ditimbang sebanyak 100,9 gram, dimaserasi dengan 500 mL air, kemudian
dimaserasi lagi dengan350 mL air, selanjutnya dimaserasi kembali dengan 250 mL air sisa pelarut dari rotavapor, lalu setelah 24 jam disaring, untuk mendapatkan maserat ketiga. Setelah pelarut diuapkan ekstrak diitimbang untuk menentukan rendemen.
Kultur Sel Limfosit
Persiapan
Kultur limfosit disiapkan dengan metode pemisahan sel darah menggunakan Ficoll, (nama dagang histopaque). Ficoll merupakan larutan campuran ficoll-paque yang cocok untuk pemisahan sel mononuklear manusia (Jeffrey W Pollar and John M. Walker, 1997). Sel memerlukan media pertumbuhan agar sel tersebut dapat bertahan hidup, berkembang dan berdiferensiasi. Media biasanya ditambah dengan serum berkisar antara 5%-20% yang terbukti dapat menunjang pertumbuhan sel diluar tubuh (Malole,1990). Isolasi limfosit
Limfosit diisolasi dari darah perifer mahasiswa dewasa sehat, laki-laki dan telah menyetujui pengambilan darah tersebut. Pengambilan darah dilakukan oleh seorang perawat, dengan cara darah (50 mL) diambil lewat vena menggunakan tabung vacutaener steril yang berisi EDTA 5%, kemudian di goyang pelan-pelan. Di dalam laminar air flow, vacutaener yang berisi darah tersebut dihilangkan udaranya dengan cara membuka tutupnya dekat api, kemudian tutup tabung dikencangkan lagi. Tabung disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 1.500 rpm, sehingga terbentuk 3 lapisan, lapisan paling atas yang berwarna kuning dibuang menggunakan mikropipet. Lapisan tengah setinggi 1 cm diambil menggunakan mikropipet dimasukkan
kedalam tabung valkon steril berisi larutan ficoll 3 mL dengan cara dialirkan lewat dinding tabung pelan-pelan, kemudian disentrifus lagi dengan kecepatan 2.500 rpm selama 30 menit. Tabung dikeluarkan dan akan terlihat cincin ditengah, bagian atas cincin dibuang, dan diambil cincin ½ cm bersama cairan dibawahnya ½ cm, lalu ditambahkan media RPMI hingga volumenya 9 mL. Tabung disentrifus dengan kecepatan 1.500 rpm selama 5 menit hingga terjadi endapan berwarna putih, RPMI diganti dengan RPMI yang baru sebanyak 5 ml, disentrifus 1.500 rpm selama 5 menit, hingga terjadi endapan. Setelah ditambahkan RPMI sebanyak 5 mL, sel limfosit dihitung dengan hematositometer. Gelas hematositometer dibersihkan dengan alkohol, di masukkan ke dalam inkubator, diambil 20 µl kultur limfosit, setelah sebelumnya ditambahkan biru tripan sebanyak 20 µl dan dianalisis dengan
hematositometer. Jumlah limfosit dihitung
dengan rumus :
Keterangan :
N = Jumlah sel limfosit
A = Jumlah sel hidup rata-rata per bidang pandang FP = Faktor pengenceran
Reaksi
Suspensi limfosit masing-masing sejumlah 80 µl dimasukkan ke dalam sumur, kemudian pada setiap sumur diisi dengan ekstrak sesuai dosis sebanyak 20 µl. Kelompok kontrol (+) menggunakan 50 µg/mL lipopolisakarida dan convanalin A sedangkan kelompok kontrol (-) menggunakan kultur sel limfosit tanpa penambahan ekstrak. Setelah itu, dilakukan
N = A x FP x 104 sel/ml
inkubasi di dalam inkubator CO2 pada suhu 37°C selama 72 jam.
Dosis pemberian
Dosis dari ekstrak air, ekstrak metanol, ekstrak heksana dan minyak dari buah merah masing-masing adalah : 8,33. 10-3 ; 33,3. 10-3 dan 66,7. 10-3 µg/ml.
Penetapan pertumbuhan sel
Penghitungan sel limfosit dilakukan dengan dua cara yaitu dengan cara manual menggunakan pewarnaan biru tripan dan MTT. Setelah dilakukan inkubasi selama 72 jam, ke dalam semua sumur ditambahkan MTT sebanyak 10 µl, diaduk dan dimasukkan lagi di dalam inkubator CO2 selama 4 jam. Setelah itu ditambahkan larutan isopropanol sebanyak 100 µl, kemudian ditentukan absorbansinya dengan spektrofotometer microplate reader, pada panjang gelombang 570 nm. Hasil absobansi digunakan untuk menghitung persentase pertumbuhan sel limfosit dengan rumus:
AE-AK X 100
AK
AE : Rata-rata absorban ekstrak AK : Rata-rata absorban kontrol (-)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Rendemen yang diperoleh dari minyak, ekstrak metanol, ekstrak heksana, ekstrak air, berturut-turut adalah 1,72; 17,58; 5,83; 1,72%. Rendemen ekstrak yang diperoleh, digunakan sebagai dasar untuk penentuan dosis uji. Rendemen tertinggi adalah ekstrak metanol yang menunjukkan bahwa sebagian besar senyawa dari buah merah bersifat sedikit polar.Sel limfosit yang mati karena perlakuan ekstrak dan minyak
buah merah dapat dilihat pada Gambar 1 berikut ini.
Gambar 1. Tingkat kematian sel limfosit
Pada Gambar 1 terlihat bahwa ekstrak air yang mempunyai tingkat polaritas tertinggi menyebabkan tingkat kematian sel terendah. Demikian juga pada dosis 66,7 µg/mL tingkat kematian sel lebih rendah dari pada dosis 8,3 dan dosis 33,3 µg/mL. Pada minyak terjadi penurunan kematian sel mulai dosis 33.3 µg/mL dan terendah pada dosis 66,7 µg/mL, sedangkan pada ekstrak metanol dan ekstrak heksana juga terjadi penurunan, tetapi tidak sebesar ekstrak air dan minyak. Jumlah sel yang mati mempunyai kecenderungan menurun sesuai dengan peningkatan dosis uji dan peningkatan polaritas ekstrak.
KESIMPULAN
Dari hasil penelitian dan pembahasan tersebut dapat disimpulkan bahwa:
Semua ekstrak dan minyak dari buah merah 1.
tidak menyebabkan toksisitas terhadap sel limfosit manusia.
Penurunan kematian sel limfosit tersebut 2.
sesuai dengan sifat polaritas dari ekstrak
dan tergantung pada besarnya dosis uji. Polaritas ekstrak yang semakin tinggi dapat menyebabkan kematian sel limfosit yang semakin rendah. Semakin besar dosis uji akan menyebabkan kematian sel limfosit yang semakin rendah.
DAFTAR PUSTAKA
Jeffrey, W Pollar and John M. Walker. 1997. Basic
Cell Culture Protocols, Methods in Molecular
Biology Volume 75. Humana Press Inc. Totowa, NJ
Keim, A.P 2005.“Pandan Buah Merah” Klasifikasi dan Permasalahan Yang Terkait Dengannya. Bagian Botani (Herbarium Bogoriense) Pusat Penelitian Biologi LIPI.
Malole, M.B.M. 1990. Kultur sel dan Jaringan
Hewan. Pusat Antar Universitas. Institut
Pertanian Bogor.
Redaksi Agro Media. 2005. Pro & Kontra Buah
Merah Pendapat Pakar dan Praktisi.
Penerbit PT Agro Media Pustaka Cetakan ke 1. Jakarta.
Sampurno.2004. Monografi Ekstrak Tumbuhan
Obat Indonesia, volume 1. Badan Pengawas
Obat dan Makanan Republik Indonesia. World Health Organization (WHO).1993. Research
guidelines for evaluating the safety and efficacy of herbal medicines.WHO Regional
