commit to user
PENGARUH PEMBERIAN TERAPI ADJUVAN MINYAK
JINTEN HITAM (
Nigella sativa
) TERHADAP HITUNG
LIMFOSIT MENCIT Balb/C MODEL SEPSIS
SKRIPSI
Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran
Ricky Trinugroho Yuliantoro G0008157
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET
commit to user
PENGESAHAN SKRIPSI
Skripsi dengan judul : Pengaruh Pemberian Terapi Adjuvan Minyak Jinten Hitam (Nigella sativa) Terhadap Hitung Limfosit Mencit Balb/C Model Sepsis
Ricky Trinugroho Yuliantoro, NIM : G0008157, Tahun : 2011
Telah diuji dan sudah disahkan dihadapan Dewan Penguji Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta
Pada hari Kamis , Tanggal 29 Desember 2011
Pembimbing Utama Isdaryanto, dr., MARS
NIP. 19500312 197610 1 001 (...)
Pembimbing Pendamping
DR.Kiyatno,dr.,M.Or.,PFK.,AIFO
NIP. 19480118 197603 1 002 (...)
Penguji Utama
Mochammad Arief T.Q, dr., MS
NIP. 19500913 198003 1 002 (...)
Anggota Penguji
Arif Suryawan, dr., AIFM
NIP. 19580327 198601 1 001 (...)
Surakarta,...2011
Ketua Tim Skripsi Dekan FK UNS
commit to user
PERNYATAAN
Dengan ini menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan
untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan
penulis juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau pernah diterbitkan oleh
orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Surakarta, 6 Desember 2011
Ricky Trinugroho Yuliantoro
commit to user
ABSTRAK
Ricky Trinugroho Yuliantoro, G0008157, 2011. Pengaruh Pemberian Terapi Adjuvan Minyak Jinten Hitam (Nigella sativa) terhadap Hitung Limfosit Mencit Balb/C Model Sepsis.
Fakultas Kedokteran, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Tujuaan Penelitian : Untuk mengetahui pengaruh pemberian terapi adjuvan minyak jinten hitam (Nigella sativa) terhadap hitung limfosit mencit Balb/C model sepsis.
Metode Penelitian : Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorik dengan the posttest only
controlled group design. Hewan uji menggunakan 40 ekor mencit Balb/C jantan yang dibagi
dalam 4 kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol positif, kelompok perlakuan 1 dan kelompok perlakuan 2. Kelompok kontrol negatif hanya diberikan aquades peroral dengan dosis 0,1ml/mencit/hari. Kelompok kontrol positif diberikan injeksi cecal
inoculum dengan dosis 6mg/mencit/i.p/hari. Kelompok perlakuan 1 diinduksi sepsis dan
diberikan antibiotik ceftriaxone dengan dosis 52 mg/mencit/i.m/hari. Kelompok perlakuan 2 diinduksi sepsis serta diberikan antibiotik ceftriaxone dosis 52 mg/mencit/i.m/hari dan minyak jinten hitam peroral dengan dosis 0,1 ml/mencit/hari. Perlakuan dilakukan selama 6 hari. Pada hari ke-6 mencit dikorbankan dan diambil darahnya melalui sinus orbitalis untuk dihitung jumlah limfositnya dengan menggunakan alat differential lymphocyte count. Data yang diperoleh
dianalisis dengan One Way ANOVA menggunakan program SPSS 18 for Windows Release dan
dilanjutkan dengan Post Hoc test.
Hasil Penelitian : Pada penelitian ini diperoleh hitung limfosit kelompok kontrol negatif sebanyak 80,32 + 8,80, kelompok kontrol positif sebanyak 51,22 + 10,29, kelompok perlakuan 1 sebanyak 65,27 + 12,65, kelompok perlakuan 2 sebanyak 79,28 + 9,48. Pada Post Hoc test
didapatkan perbedaan yang bermakna hitung limfosit kelompok kontrol negatif dengan kelompok kontrol positif (p = 0,000), kelompok kontrol negatif dengan kelompok perlakuan 1 (p = 0,021), kelompok kontrol positif dengan perlakuan 1 (p = 0,030), kelompok kontrol positif dengan perlakuan 2 (p=0,000), dan kelompok perlakuan 1 dengan perlakuan 2 (p = 0,030), sedangkan kelompok kontrol negatif dengan kelompok perlakuan 2 tidak didapatkan perbedaan bermakna (p = 0,865).
Simpulan Penelitian : Pemberian terapi adjuvan minyak jinten hitam dapat meningkatkan hitung limfosit pada mencit Balb/C model sepsis.
commit to user
ABSTRACT
Anisa Prastiwi, G0008005, 2011. The Effect of Black Cumin Oil (Nigella sativa) as an Adjuvan Therapy on the Lymphocyte Count in Balb/C Sepsis Mice Model.
Faculty of Medicine, Sebelas Maret University, Surakarta.
Objective : This experiment was aimed to get the information of the effect of Black Cumin Oil
(Nigella sativa) on the lymphocyte count in Balb/C sepsis mice model.
Method : This was a pure experiment with the posttest only controlled group design. We used 40 male Balb/C mice that were divided in 4 groups : negative control group, positive control group, treatment 1 group, and treantment 2 group. Negative control group were given aquadest 0,1 ml/mice/day. Positive control group were given cecal inoculum injection 6mg/mice/i.p/day. Treatment 1 group weres inducted sepsis dan given ceftriaxone antibiotik 52 mg/mice/i.m/day. Treatment 2 group were inducted sepsis dan given ceftriaxone antibiotik 52 mg/mice/i.m/day and black cumin oil 0,1 ml/mice/day. The treatment was done in 6 days. On the day 7, blood samples of subjects were taken from sinus orbitalis for lymphocyte counting with differential limfosit
count. Stastitical analysis of the data was performed by One Way ANOVA with SPSS 18 for
Windows Release programme and continued with Post Hoc test.
Result : The data showed that neutrophil rate of 100 pheripheral blood leukocyte of negative control group 80,32 + 8,80, positive control group 51,22 + 10,29, treatment 1 group 65,27 + 12,65, and treatment 2 group 79,28 + 9,48. With Post Hoc Test we got result there were significant difference of lymphocyte count between negative control group and positive control group (p = 0,000), negative control group and treatment 1 group (0,021), positive control group and treatment 1 group (0,030), positive control group and treatment 2 group (p = 0,000), the treatment 1 group and treatment 2 group (p = 0,030).The difference of neutrophil count between negative control group and treatment 2 group (p = 0,865) was not significant.
Conclusion : Adjuvant theraphy with black cumin oil can increase lymphocyte count on sepsis-model Balb/C mice.
commit to user
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT Yang Maha Pengasih dan Maha Penyayang, atas segala karunia yang dilimpahkan-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
Skripsi dengan judul “Pengaruh Pemberian Terapi Adjuvan Minyak Jinten Hitam
(Nigella sativa) terhadap Hitung Limfosit Mencit Balb/C Model Sepsis” ini diajukan dalam
rangka melengkapi persyaratan guna memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. Dengan selesainya penulisan skripsi ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu, yaitu:
1. Prof. DR. Zainal Arifin Adnan, dr., Sp.PD-KR-FINASIM selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.
2. Muthmainah, dr., M.Kes selaku ketua Tim Skripsi beserta staff.
3. Isdaryanto, dr., MARS selaku Pembimbing Utama atas segala kesabaran, keramahan dan pengertian serta masukan, nasihat, semangat dan meluangkan waktu memberi bantuan dalam penulisan skripsi ini.
4. Dr. Kiyatno, dr., M.Or., PFK., AIFO selaku Pembimbing Pendamping atas semua saran yang berharga, bantuan serta motivasi dalam penyusunan skripsi ini.
5. Mochammad Arief T.Q, dr., MS selaku Penguji Utama yang telah memberikan kritik dan saran dalam penulisan skripsi.
6. Arif Suryawan, dr., AIFM selaku Anggota Penguji yang telah memberikan kritik dan saran dalam penulisan skripsi.
7. Ayah dan Ibu tercinta serta kakak-kakakku tersayang Henny dan Dedy atas dukungan dan doa yang mengalir di setiap waktu.
8. Kepala Laboraturium Histologi Fakultas Kedokteran UNS beserta staff atas izin melakukan skripsi di Laboraturium Histologi
9. Anisa Prastiwi, teman-teman asisten histologi dan teman-teman pendidikan dokter 2008 atas dukungan dan semangatnya.
10. Pihak-pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu atas bantuannya sehingga skripsi ini dapat selesai.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih banyak terdapat kekurangan, sehingga kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak sangat penulis harapkan. Akhirnya penulis berharap semoga skripsi ini berguna bagi semuanya.
Surakarta, Desember 2011
commit to user
DAFTAR ISI
Halaman
PRAKATA vi
DAFTAR ISI vii
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR GAMBAR x
DAFTAR LAMPIRAN xi
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah 1
B. Rumusan Masalah 3
C. Tujuan Penulisan 3
D. Manfaat Penulisan 3
BAB II LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka 5
1. Nigella sativa 5
2. Sepsis 12
3. Peranan Minyak Jinten Hitam dalam
Penatalaksanaan Sepsis 26
B. Kerangka Pemikiran 28
1. Kerangka Pemikiran Konseptual 28
2. Kerangka Pemikiran Teoretis 29
C. Hipotesis 30
commit to user
A. Jenis Penelitian 31
B. Lokasi Penelitian 31
C. Subjek Penelitian 31
D. Teknik Sampling 31
E. Alur penelitian 33
F. Identifikasi Variabel Penelitian 34
G. Definisi Operasional Variabel Penelitian 34
H. Alat dan Bahan Penelitian 36
I. Cara Kerja 37
J. Teknik Analisis Data 38
BAB IV HASIL PENELITIAN 40
BAB V PEMBAHASAN 44
BAB VI SIMPULAN DAN SARAN 49
DAFTAR PUSTAKA 50
commit to user
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Kandungan Asam Lemak dalam Jinten Hitam 7
Tabel 2. Kandungan Kimia Jinten Hitam 10
Tabel 3. Jumlah Hewan Coba yang Masih Hidup dan yang Sudah Mati 40
Tabel 4. Hasil Hitung Limfosit Keempat Kelompok Mencit
dalam satuan % Leukosit 41
commit to user
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Tanaman Nigella sativa 6
commit to user
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Data Jumlah Limfosit Tiap Kelompok
Lampiran 2. Tabel Konversi Dosis Manusia dan Hewan
Lampiran 3. Tabel Daftar Volume Maksimal Larutan Sediaan Uji yang Dapat
Diberikan pada Berbagai Hewan
Lampiran 4. Ethical Clearance
Lampiran 5. Foto Penelitian
commit to user
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Sepsis merupakan proses infeksi dan inflamasi kompleks yang terjadi
karena adanya respon tubuh yang berlebihan terhadap rangsangan produk
mikroorganisme (Guntur, 2008). Morbiditas dan mortalitas sepsis di
Indonesia masih sangat tinggi (Guntur, 2008). Sepsis masih menjadi
penyebab utama kematian di sejumlah Intensive Care Unit (ICU). Selama
periode Januari 2006 - Desember 2007 di Bagian Perinatal Intensive Care
Unit/ Neonatal Intensive Care Unit (PICU/NICU) Rumah Sakit Umum
Daerah Dr.Moewardi Surakarta, terdapat angka kejadian sepsis 33,5% dengan
tingkat mortalitas sebesar 50,2% (Pudjiastuti, 2008). Perkembangan terapi
dengan obat-obatan akan berdampak secara mendasar pada morbiditas dan
mortalitas sepsis. Berdasarkan hasil penelitian tahap Randomized Control
Trials (RCTs), berbagai terapi adjuvan seperti anti-lipopolisakarida
(anti-endotoksin), anti-CD14, anti-Lipopolisakarida Binding Protein (anti-LBP),
anti-TNF-α, IL-1ra, ibuprofen, kortikosteroid dosis tinggi, bradikinin
antagonist, platelet-activating factor acetyl hydrolase, elastase inhibitor,
nitric oxide synthase inhibitor tidak memperlihatkan perbaikan kelangsungan
hidup penderita sepsis (Russel, 2006; Guntur, 2008). Oleh karena itu,
diperlukan suatu terapi adjuvan baru yang dapat memberikan perbaikan pada
commit to user
Proses patologik yang utama pada sepsis adalah apoptosis dari sel-sel
efektor imunologi, termasuk limfosit dan sel dendritik maupun apoptosis
saluran pencernaan (Chang et al., 2007). Sejumlah penelitian menyatakan
bahwa disregulasi apoptosis terhadap kematian sel-sel imun
bertanggungjawab dalam menimbulkan disfungsi imun serta Multiple Organ
Failure (MOF) selama sepsis (Chung et al., 2000; Chung et al., 2003). Pada
sepsis, sel-sel imun yang paling terlihat mengalami disregulasi apoptosis
adalah limfosit. Peningkatan apoptosis limfosit yang terjadi selama sepsis
akan menurunkan jumlah limfosit dalam sirkulasi sehingga terjadi penurunan
Interferon-γ (IFN-γ). Penurunan IFN-γ ini akan menghambat aktivasi
makrofag sehingga menurunkan respon Th1 (Docke et al., 1997).
Nigella sativa (jinten hitam) merupakan tanaman obat tradisional dari
daerah Mediterania yang dipercaya dapat menyembuhkan berbagai macam
penyakit karena memiliki efek antibakteri, antiinflamasi, analgesik,
antipiretik, antioksidan, bersifat hepatoprotektor dan renoprotektor serta
mampu meningkatkan sistem imun (Navdeep, 2009). Nigella sativa
mengandung senyawa thymoquinone yang memiliki efek positif terhadap
sistem imun. Mekanisme kerjanya adalah menghambat translokasi NF-κB ke
dalam nukleus sehingga menurunkan sintesis sitokin proinflamasi, kemokin,
adhesion factor serta faktor koagulasi (Clark and Coppersmith, 2007;
Navdeep, 2009). Nigella sativa juga secara signifikan mampu mengurangi
level stres oksidatif yang memicu sintesis sitokin pro-inflamasi melalui
commit to user
antioksidan serta antiinflamasi tersebut dapat diaplikasikan pada kondisi
patologis yang memiliki respon inflamasi berlebih seperti pada sepsis. Selain
itu, tanaman ini memiliki nilai lebih karena toksisitasnya yang lebih rendah,
harganya yang terjangkau serta mudah ditemukan di lingkungan sekitar.
Namun sampai saat ini belum ada penelitian yang membuktikan bahwa
ekstrak minyak jinten hitam (Nigella sativa) dapat digunakan untuk
mencegah apoptosis limfosit melalui jalur NF κ-β dan caspase-3 pada sepsis.
Oleh karena itu, peneliti ingin mengetahui pengaruh pemberian ekstrak
minyak jinten hitam terhadap limfosit serum. Pemberian ekstrak minyak
jinten hitam diharapkan memiliki potensi sebagai terapi adjuvan dalam
penatalaksanaan sepsis sehingga dapat menekan tingkat morbiditas dan
mortalitas sepsis.
B. Rumusan Masalah
Adakah pengaruh pemberian terapi adjuvan minyak jinten hitam
(Nigella sativa) terhadap hitung limfosit mencit Balb/C model sepsis?
C. Tujuan Penelitian
Untuk mengetahui pengaruh pemberian terapi adjuvan minyak jinten
commit to user
D. Manfaat Penelitian 1. Manfaat Ilmiah
Penelitian ini dapat memberi masukan dalam ilmu pengetahuan
tentang minyak jinten hitam (Nigella sativa) sebagai terapi adjuvan pada
kasus sepsis.
2. Manfaat Praktis
Penelitian ini diharapkan dapat menjadi langkah awal dalam
penelitian tentang memanfaatkan minyak jinten hitam (Nigella sativa)
commit to user
BAB II
LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka 1. Nigella sativa
a. Klasifikasi Tumbuhan
Kerajaan (Kingdom) : Plantae
Divisi (Division) : Magnoliophyta
Kelas (Class) : Magnoliopsida
Bangsa (Ordo) : Ranunculales
Suku (Family) : Ranunculaceae
Marga (Genus) : Nigella
Jenis (Species) : Nigella sativa
b. Sinonim
Black cumin, fennel flower, Nutmeg flower, Roman
coriander, black seed, black caraway, black onion seed, kalonji,
habatussauda, habbat albarakah (Attia et al., 2008).
c. Deskripsi Tanaman
Nigella sativa merupakan tumbuhan dengan tinggi sekitar 20
- 30 cm, berbatang halus, daunnya berbau segar, bunganya berwarna
commit to user
1100 m di atas permukaan laut. Biasanya ditanam di daerah
pegunungan atau sengaja ditanam di halaman atau ladang sebagai
tanaman rempah-rempah. Buahnya berbentuk kapsul menggembung,
terdiri dari 3-7 folikel, yang masing-masing berisi beberapa biji.
Bentuk bijinya kerucut kecil dan berserabut, panjangnya berukuran
tidak lebih dari 3 mm. Memiliki aroma, bentuk yang sama seperti
biji wijen, namun berwarna hitam. Bijinya digunakan untuk
rempah-rempah dan obat-obatan (Attia et al., 2008).
commit to user
Gambar 2.2. Tanaman Nigella sativa
d. Kandungan Kimia 1) Fixed Oil
Kandungan asam lemak dalam jinten hitam sebagai
berikut:
Tabel 1. Kandungan Asam Lemak dalam Jinten Hitam
Asam Lemak Persentase
Asam laurat
Asam miristat
Asam palmitat
Asam stearat
Asam oleat
Asam linoleat
Asam linolenat
Asam eicosadinoat
0,6
0,5
12,5
3,4
23,4
55,6
0,4
3,1
Total 99,5
commit to user
Dari komposisi di atas diketahui bahwa jinten hitam
lebih banyak mengandung asam lemak tidak jenuh (82,5%).
Asam lemak tidak jenuh yang terpenting adalah asam linoleat
dan asam oleat (Wardlaw and Smith, 2006).
Asam linoleat termasuk golongan asam omega-6 dengan
dua ikatan rangkap (Almatsier, 2001). Asam lemak ini
dibutuhkan untuk pertumbuhan dan fungsi normal semua
jaringan. Hewan dan manusia tidak dapat menambahkan ikatan
rangkap pada karbon ke-3 dan ke-6 pada asam lemak yang ada
di dalam tubuh sehingga tidak dapat mensintesis asam lemak
tersebut. Oleh karena itu, asam linoleat merupakan asam lemak
esensial (Wardlaw and Smith, 2006).
Asam oleat termasuk asam lemak tidak jenuh dengan
satu ikatan rangkap (monounsaturated fatty acid = MUFA).
MUFA adalah asam lemak yang kehilangan dua atom hidrogen
dan mempunyai satu ikatan rangkap. MUFA bermanfaat untuk
menurunkan risiko terjadinya penyakit kardiovaskuler dengan
cara menurunkan kadar trigliserida dan kolesterol total (Rolfes
et al., 2006).
2) Volatile oil
Volatile oil dari Nigella sativa mengandung beberapa zat
seperti trans-anethole, carvone, cymene, thymohydroquinone,
commit to user
al., 2003). Limonene bermanfaat dalam memicu produksi enzim
untuk mendetoksifikasi karsinogen sehingga menghambat
pertumbuhan kanker (Rolfes et al., 2006).
3) Kandungan Lain
Komposisi gizi dari biji jinten hitam meliputi karbohidrat
35%, lemak 35-38% dan protein 21%. Sisanya berupa vitamin,
mineral dan zat lain. Karbohidrat dalam jinten hitam berupa
monosakarida, yaitu glukosa, rhamosa, xylosa dan arabinosa.
Selain itu, Nigella sativa juga mengandung non-starch
polysaccharide sebagai sumber serat tinggi (Nickavar et al.,
2003).
Protein yang terkandung di dalam jinten hitam ada 15
macam, di antaranya alanin, arginin, sistin, asam glutamat,
glisin, lisisn, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan,
asparagin, isoleusin dan leusin (Nickavar et al., 2003).
Selain itu, jinten hitam juga mengandung alkaloid,
saponin, asam askorbat, asam dehidroaskorbat, lipase,
phytosterol, beta-sitosterol, alpha-spinasterol, stigmasterol,
campesterol dan tannin. Saponin diketahui dapat menghambat
replikasi DNA pada sel kanker serta menstimulasi sistem imun.
Tannin memiliki efek sebagai antioksidan yang dapat
menghambat aktivitas zat karsinogenik dan perkembangan
commit to user
mempunyai struktur mirip kolesterol sehingga dapat
menurunkan kadar kolesterol darah melalui kompetisi absorbsi
di usus (Rolfes et al., 2006).
Tabel 2. Kandungan Kimia Jinten Hitam
Nilai Nutrisi
RDAB : Recommended Dietary Allowences For Bodybuilders
commit to user
e. Efek Farmakologis
Berbagai penelitian menunjukkan efek Nigella sativa sebagai
antioksidan, analgesik, antipiretik, antihipertensi, bronkodilator,
antibakteri, imunomudulator, anti ulkus, anti jamur, antihelmintes,
antitumor, antidiabetik, berpotensi meningkatkan sistem kekebalan
tubuh, menurunkan kadar lemak, kolesterol serum, trigliserida,
menghambat nekrosis hepar dan renoprotektif, (Bashandy, 2006).
Beberapa senyawa yang terkandung dalam minyak Nigella sativa
seperti thymoquinone, dithymoquinone, thymohydroquinone dan
thymol memiliki aktivitas antioksidan, antimikroba, agen
hipoglikemik, antitumor, efek hepatoprotektif, inhibitor sintesis
eikosanoid dan peroxidasi membran lipid (Thippeswamy, 2005).
Nigella sativa dan komponen aktifnya thymoquinone (TQ),
dapat menghambat peroksidasi lipid non-enzimatik pada liposom
dan memiliki potensi menetralkan radikal bebas. Kemampuannya
sebagai antioksidan telah terbukti dalam melawan hepatotoksisitas
CCL4, fibrosis hati dan sirosis serta kerusakan hepar. Nigella sativa secara signifikan dapat mengurangi level Oxidative Stress Index
(OSI) dan Total Oxidative Status (TOS) yang mengindikasikan
tingkat stres oksidatif jaringan. Mekanisme aktivitas stres oksidatif
dapat menyebabkan pembentukan sitokin pro-inflamasi melalui
commit to user
level Total Antioxidant Capacity (TAC) yang menunjukkan kadar
antioksidan pada jaringan hepar (Turkdogan et al., 2000).
Thymoquinone yang terkandung dalam Nigella sativa juga
dapat menghambat tromboksan B2 dan leukotrien B4 (dengan
menghambat cyclooxygenase dan 5-lipooxygenase) serta peroksidasi
membran lipid. Thymoquinone terbukti menghambat sitokin
proinflamasi seperti IL-1ß, IL-8, dan kemokin seperti Macrophage
Chemotactic Protein-1 (MCP-1). Mekanisme kerjanya adalah
melalui inhibisi terhadap TNF-α yang menginduksi aktivasi NF-κB
serta menghambat translokasi NF-κB ke dalam nukleus (Navdeep,
2009). Aktivitasnya sebagai antioksidan serta anti-inflamasi tersebut
dapat diaplikasikan pada kondisi patologis yang memiliki respon
inflamasi berlebih seperti pada sepsis.
2. Sepsis
a. Definisi Sepsis
Sepsis adalah suatu sindroma klinik yang terjadi sebagai
manifestasi proses inflamasi imunologi karena adanya respon tubuh
yang berlebihan terhadap rangsangan produk mikroorganisme
(Guntur, 2008; Hotchkiss et al., 2003). Untuk mencegah timbulnya
kerancuan, disepakati standardisasi terminologi. Pada bulan Agustus
commit to user
Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine sebagai berikut
(Eny, 2004):
1) Infeksi, respon inflamasi akibat adanya mikroorganisme yang
secara normal pada jaringan tersebut seharusnya steril.
2) Bakteriemi, adanya bakteri hidup dalam darah.
3) Systemic Inflammatory Response Syndrome merupakan reaksi
inflamasi masif sebagai akibat dilepasnya berbagai mediator
secara sistemik yang dapat berkembang menjadi disfungsi organ
atau Multiple Organ Disfunction (MOD) dengan tanda klinis:
a) Temperatur > 38,30C atau < 35,60C b) Denyut jantung > 90 kali/menit
c) Frekuensi nafas > 20 kali/menit atau PaCO2 < 32 torr (< 4,3 kPa)
d) Hitung leukosit > 12.000 sel/mm3 atau < 4000 sel/mm3 atau ditemukan > 10 % sel imatur.
4) Sepsis, SIRS yang disebabkan oleh infeksi
5) Sepsis berat (severe sepsis), sepsis disertai disfungsi organ, yaitu
kelainan hipotensi (tekanan sistolik < 90 mmHg atau terjadi
penurunan > 40 mmHg dari keadaan sebelumnya tanpa disertai
penyebab dari penurunan tekanan darah yang lain). Hipoperfusi
atau kelainan perfusi ini meliputi timbulnya asidosis laktat,
commit to user
6) Syok septik, sepsis dengan hipotensi walaupun sudah dilakukan
resusitasi cairan yang adekuat tetapi masih didapatkan gangguan
perfusi jaringan.
b. Etiologi Sepsis
Sepsis sampai syok septik telah diakui penyebabnya adalah
bakteri gram negatif, tetapi mungkin juga disebabkan oleh
mikroorganisme lain, gram positif, jamur, virus bahkan parasit.
Timbulnya syok septik dan atau Acute Respiratory Disstress
Syndrome (ARDS) sangat penting pada bakteriemia gram negatif.
Syok terjadi pada 20 % - 35 % penderita bakteriemia gram negatif
(John, 1994).
Produk yang berperan penting terhadap sepsis adalah
Lipopolisakarida (LPS). Lipopolisakarida atau kompleks
endotoksin-glikoprotein merupakan komponen utama membran terluar dari
bakteri gram negatif. Lipopolisakarida merangsang peradangan
jaringan, demam dan syok pada penderita yang terinfeksi. Struktur
lipid A dalam LPS merangsang produksi mediator inflamasi seperti
TNF, berbagai sitokin dan prostaglandin, Colony Stimulating Factor
(CSF), Platelet Activating Factor (PAF) dan radikal bebas yang
bertanggung jawab terhadap reaksi dalam tubuh penderita
commit to user
Angka mortalitas penderita sepsis dengan endotoksemia
(41,17 %) lebih tinggi dibandingkan tanpa endotoksemia (12,5 %)
walaupun secara statistik tidak ditemukan perbedaan bermakna.
Jenis kuman yang sering ditemukan adalah kuman gram negatif
(55,26 %), diikuti gram positif (39,47 %) dan jamur atau sel ragi
(5,26 %) (Suhendro, 1997).
c. Patofosiologi Sepsis
Patofisiologi sepsis sangat kompleks karena melibatkan
interaksi antara proses infeksi kuman patogen, inflamasi dan jalur
koagulasi (Kristine et al., 2007) yang dikarakteristikkan sebagai
ketidakseimbangan antara sitokin pro-inflamasi seperti TNF-α, IL
-1β, IL-6 dan IFNγ dengan sitokin anti-inflamasi seperti IL-1ra, IL-4
dan IL-10 (Li-Weber and Krammer, 2003; Elena et al., 2006).
Overproduksi sitokin pro-inflamasi sebagai hasil dari aktivasi NF-κB
akan menyebabkan aktivasi respon sistemik berupa SIRS terutama
pada paru-paru, hati, ginjal, usus dan organ lainnya yang
mempengaruhi permeabilitas vaskuler, fungsi jantung dan
menginduksi perubahan metabolik sehingga terjadi apoptosis
maupun nekrosis jaringan, MOF, syok septik serta kematian (Arul,
2001; Elena et al., 2006; Chopra and Sharma, 2007).
Endotoksin dapat secara langsung berikatan dengan LPS dan
commit to user
(Lipopolisakarida-Antibodi) (Brahmbhatt et al., 2005). Dengan
perantara reseptor CD14. LPSAb yang berada di dalam darah akan
bereaksi dengan makrofag dan kemudian ditampilkan sebagai
Antigen Presenting Cell (APC). Ikatan LPS-Lipopolysaccharide
Binding Protein (LPB) pada reseptor CD14 di permukaan sel akan
berinteraksi degan Toll-Like Receptor-4 (TLR4) untuk menginduksi
NKκ-B sebagai sinyal trankripsi sitokin proinflamasi, kemokin,
adhesion factor serta faktor koagulasi (Clark and Coppersmith,
2007). Sebagai usaha tubuh untuk bereaksi terhadap sepsis, limfosit
T akan mengeluarkan sustansi dari Th1 yang berfungsi sebagai
imunomodulator yaitu IFNγ, IL-2 dan Macrophage Colony
Stimulating Factor (M-CSF). Limfosit Th2 akan mengekspresikan
IL-4, IL-5, IL-6, dan IL-10. Interferon-γ yang dihasilkan Th1 ini
akan merangsang makrofag mengeluarkan IL-1β dan TNF-α
sehingga pada keadaan sepsis terjadi peningkatan kadar IL-1β dan
TNF-α yang berkorelasi dengan keparahan penyakit dan kematian
(Roth and Hanspeter, 2004).
Sepsis memiliki dua fase yang berbeda, yaitu early sepsis
dan late sepsis. Early sepsis merupakan fase hiperdinamik yang
ditandai oleh peningkatan cardiac output, perfusi jaringan dan
penurunan resistensi vaskuler. Tanda khas pada fase ini adalah status
pro-inflamasi yang dimediatori terutama oleh limfosit, makrofag dan
commit to user
toksinnya. Late sepsis merupakan fase hipodinamik yang meliputi
penurunan aliran darah menuju jaringan dan mikrovaskuler,
penurunan fungsi jantung, dan peningkatan indeks cedera dan
disfungsi organ. Pada fase ini, sistem imun menunjukkan presentasi
antigen yang tidak sempurna, penurunan Major Histocompatibility
Complex type II (MHC-II), hilangnya respon hipersensitivitas tipe
lambat, hilangnya fungsi fagosit dan penurunan pelepasan sitokin
dari sel T helper tipe 1 (Th1) (Guntur, 2008).
d. Peran Apoptosis Limfosit dalam Patologi Sepsis
Apoptosis adalah suatu proses yang diprogramkan untuk
membunuh sel yang tidak dikehendaki dan sel yang berpotensi
membahayakan (Strasser et al., 2008) pada saat morfogenesis,
remodeling jaringan dan resolusi respon imun (Wesche-Soldato et
al., 2007). Apoptosis ini akan membatasi kerusakan yang berlebihan
pada lingkungan sekitarnya (Wesche et al., 2005).
Apoptosis atau kematian sel yang terprogram dicirikan oleh
adanya degenerasi nukleus, kondensasi, dan degradasi DNA nukleus
serta fagositosis dari residu sel. Multiple Organ Disfunction atau
Multiple Organ Failure sering berhubungan dengan peningkatan
apoptosis sel limfoid sehingga terapi pengembangan terapi pada
commit to user
mengawali proses apoptosis dapat digunakan sebagai target terapi
baru pada pasien-pasien kritis (Oberholzer et al., 2001).
Perubahan apoptosis dari sel dimediatori oleh cysteine
aspartatespesific protease atau caspase, yang akan membelah dan
menghancurkan sejumlah besar struktur protein dan juga
mengaktifkan enzim-enzim untuk membongkar asam nukleat
(Caspase Activated DNAse yang disebut CAD) atau struktur
lainnya. Caspase ada di dalam sel-sel sehat dalam keadaan inaktif
(zymogen). Berdasarkan struktur, fungsi, dan cara aktivasinya,
caspase dibagi menjadi dua kelompok, yaitu (i) Initiator caspases
(contoh caspase-8, caspase-9 dan Caenohabditis elegans CED-3) dan
(ii) Effector caspases (contoh caspase-3, caspase-6, serta caspase 7).
Effector caspase bertanggung-jawab pada proteolisis dari struktur
protein dan aktivasi CAD (Strasser et al., 2008).
Sejumlah penelitian menyatakan bahwa disregulasi apoptosis
terhadap kematian sel-sel imun bertanggungjawab dalam
menimbulkan disfungsi imun serta MOF selama sepsis (Chung et al.,
2000; Chung et al., 2003). Pemicu apoptosis ini termasuk steroid,
sitokin seperti TNF-α, IL-1, IL-6, FasL, heat shock protein, oksigen
radikal bebas, NO, dan limfosit T cytotoxic (Tc) yang akan
mengekspresikan FasL pada permukaan sel-selnya (Roth and
Hanspeter, 2004). Proses kematian sel melalui apoptosis terjadi
commit to user
ekstrinsik (sel tipe I), jalur intrinsik (sel tipe II) dan jalur yang
diinduksi oleh stres (jalur retikulum endoplasma) (Strasser et al.,
2000; Daniel and Remick, 2007; Turner et al., 2007)
Sel-sel imun yang paling terlihat mengalami disregulasi
apoptosis adalah limfosit. Pada hewan coba terlihat setelah 12 jam
pasca pemaparan polimikroba sepsis akan terlihat apoptosis limfosit
pada timus, lien dan Gut-Association Lymphoid Tissues (GALT). Hal
ini menunjukkan bahwa pada hewan coba, adanya disregulasi
apoptosis dari limfosit ini akan menurunkan survival melalui
hilangnya limfosit. Apoptosis limfosit dalam kelenjar timus tampak
terjadi pada awal setelah onset sepsis (4 jam). Selain itu, adanya
pelepasan dini dari Complement 5a (C5a) pada kondisi sepsis akan
mengakibatkan apoptosis limfosit (Guo et al., 2000).
Apoptosis limfosit yang terjadi terutama dalam lien penting
dalam menimbulkan mortalitas pada sepsis (Wesche-Soldato et al.,
2007). Apoptosis limfosit ini berhubungan dengan disfungsi imun
sehingga akan terjadi penurunan proliferasi dan kemampuannya
dalam melepaskan IFN-γ. Interferon-γ berpotensi untuk
mengaktivasi makrofag dan menginduksi terjadinya respon Th1
(Docke et al., 1997).
Apoptosis berperan dalam pengaturan respon inflamasi
setelah terjadinya jejas pada paru-paru. Hal ini menunjukkan bahwa
commit to user
hubungan antara makrofag alveolar dengan apoptosis sel endotel
tidak hanya menghambat pelepasan sitokin pro-inflamasi dari
makrofag tetapi juga meningkatkan sekresi sitokin anti-inflamasi dan
faktor pertumbuhan, penurunan ekspresi FasL, dan inisiasi apoptosis
limfosit T melalui c-Myc (Wesche et al., 2005)
e. NF κ-B
Nuclear Factor κ-β merupakan faktor transkripsi yang
ditemukan pada semua tipe sel hewan dan dilibatkan dalam respon
seluler terhadap sejumlah rangsangan seperti stres, sitokin, radikal
bebas, radiasi ultraviolet, LDL yang teroksidasi dan antigen virus
maupun bakteri (Jobin, 2000; Gilmore, 2006). Nuclear Factor κ-β
berperan dalam mengendalikan aktivasi sejumlah gen yang terlibat
dalam pertumbuhan, diferensiasi, respon imunitas, dan kelangsungan
hidup dari sel (Jobin, 2000). Nuclear Factor κ-β berperan penting
dalam patofisiologi dari penyakit-penyakit kritis dengan mengatur
ekspresi dari gen (sitokin, kemokin, reseptor) yang secara
bersama-sama akan menentukan respon dari host. Nuclear Factor κ-β
mempunyai fungsi proapoptosis dan anti-apoptosis yang tergantung
pada stimuli dan jenis selnya (Clark and Coopersmith, 2007; Turner
et al., 2007).
Oleh karena itu, maka kesalahan dalam pengaturan NF κ-β
commit to user
septik, infeksi virus dan perkembangan imunitas yang salah
(Gilmore, 2006). Nuclear Factor κ-β ditemukan dalam sitoplasma
yang terikat pada penghambat endogen yang disebut I-κβs dan akan
teraktivasi setelah terjadi fosforilasi I-κβ. Dari hasil degradasi I-κβ
akan terjadi pelepasan NF κ-β ke dalam nukleus dan induksi
transkripsi. Pada sel epitel intestinal, aktivasi NF κ-β akan
menginduksi ekspresi dari sejumlah gen yang berefek pada inflamasi
dan perbaikan mukosa (Diding and Guntur, 2009).
Nuclear Factor κ-β mempunyai fungsi pro-apoptosis dan
anti-apoptosis yang bergantung pada stimulus dan jenis selnya (Li et
al., 2001). Nuclear Factor κ-β akan mengikat sejumlah gen pro
-apoptosis termasuk p53, FasL, dan IL-1β converting enzyme, pada
promoternya. Sebaliknya aktivitas NF κ-β juga diperlukan dalam
pengaktifan gen-gen yang menekan beberapa bentuk apoptosis.
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa NF κ-β adalah faktor
kelangsungan hidup dari sel yang akan melindungi sel dari stimuli
kematian (Diding and Guntur, 2009).
f. Penatalaksanaan Sepsis 1) Pemakaian Antibiotik
commit to user
3) Pengobatan Suplementasi
Adapun pengobatan suplementasi yang sedang
dikembangkan untuk penatalaksanan sepsis antara lain (Guntur,
2008):
a) Strategi anti-endotoksin dengan pemberian antibodi
monoklonal, tetapi pemberian ini masih diperdebatkan.
b) Pemberian infus antibodi monoklonal Faktor VII dapat
menghambat pembentukan trombin dan konversi fibrinogen.
Sistem Antitrombin III (AT III) - Heparin Sulfat dapat
mengikat dan mengurangi aktivitas trombin dalam proses
pembekuan darah, sehingga dapat mengatasi Disseminated
Intravascular Coagulation (DIC).
c) Strategi antimediator inflamasi. Ekspresi sitokin merupakan
respon normal dari inflamasi setelah mendapatkan stimulasi
dan akan terjadi penurunan secara withdrawal apabila
stimuli dihilangkan. Dalam penelitian eksperimental,
penghambatan atau netralisasi mediator dalam keadaan
sepsis dapat mengurangi angka kematian dan strategi ini
sedang dalam proses uji klinik yang hasilnya masih
dievaluasi.
d) Netralisasi NO. Nitric Oxide merupakan vasodilator yang
diproduksi oleh endotel pembuluh darah pada saat sepsis.
commit to user
vasodilatasi pembuluh darah tepi dan penurunan resistensi
sehingga terjadi penurunan tekanan darah sampai syok. Oleh
karena itu, NO harus dinetralisasi dengan menggunakan
methilen blue.
e) Hemofiltrasi. Dalam teori dinyatakan bahwa hemofiltrasi
dapat mengeluarkan mediator inflamasi serta toksin
inflamasi, namun metode ini masih memerlukan penelitian
lebih lanjut.
f) Penggunaan Intravenous Imunoglobulin (IVIG). Pemberian
IVIG akan meningkatkan netralisasi toksin, opsonisasi,
aktivitas bakterisidal serta menstimulasi fagositosis oleh
leukosit dan makrofag. Pemberian IVIG mempunyai efek
yang sinergis dengan antibiotik β-laktam dan membentuk
antibodi laktamase serta dapat merusak membran sel bakteri
gram negatif. IVIG juga dapat menekan aktivitas mediator
inflamasi dan mengurangi pelepasan sitokin proinflamasi.
g. Metode Induksi Sepsis 1) Cecal inoculum (CI)
Cecal inoculum (CI) adalah suatu model yang mampu
menggambarkan dengan baik keadaan sepsis mirip dengan
keadaan klinis peritonitis yang disebabkan infeksi polimikroba.
commit to user
terhadap organisme polimikroba yang berasal dari saluran
pencernaan (Fu Bu et al., 2006).
Dari hasil penelitian injeksi cecal inoculum
memperlihatkan tanda-tanda piloerection, periocular discharge,
tampak lesu, penurunan nafsu makan dan minum, dan diare.
Terlihat infeksi yang berlebihan, kerusakan yang hebat dan
perlengketan di sejumlah organ termasuk hepar, lien, ginjal,
serta memperlihatkan tingkat kematian sebesar 100 % selama
tujuh hari perlakuan (Diding and Guntur, 2009) dan peningkatan
jumlah limfosit dalam sirkulasi (Fu Bu et al., 2006).
Pada penelitian kali ini, akan digunakan induksi CI yang
merupakan modifikasi dari metode yang diperkenalkan oleh
Brahmhatt et al. (2005) dan Chopra (2007). Cecal inoculum
dibuat baru setiap hari dari mencit donor yang dikorbankan
dengan mensuspensikan 200 mg material cecal pada 5 mL
dextrose water 5% (D5W) steril. Pada mencit diinjeksikan cecal
inoculum 6 mg/mencit/i.p (Ren et al., 2002).
2) Polymicrobial sepsis induced by cecal ligation and puncture
(CLP)
Sejumlah tikus putih jantan dengan berat badan berkisar
120 - 150 g, di anastesi per i.p. dengan Nembutal (65 mg/Kg)
dan ditempatkan di bawah cahaya lampu. Setelah anastesi
commit to user
dengan diameter 2 cm. Cari cecum, dan keluarkan dari cavitas
abdomen. Bagian distal cecum diikat (ligation dengan 5 - 0
benang sutra, kemudian cecum yang telah diligasi ditusuk dua
kali dengan jarum gauge ukuran 18 dan ditekan dengan lembut
menggunakan aplikator sampai sedikit material cecal keluar.
Setelah itu, cecum dimasukkan kembali ke dalam peritoneum.
Bekas insisi dijahit menggunakan 5 - 0 benang sutra untuk
lapisan otot dan surgical staples (9 mm) untuk kulit. Berat
badan tikus dimonitoring secara rutin setiap hari sampai akhir
eksperimen (Fu Bu H et al., 2006).
3) Lipopolisakarida (LPS)
Lipopolisakarida (LPS) atau endotoksin glikoprotein
kompleks dan dinyatakan sebagai penyebab sepsis terbanyak.
Struktur lipid A dalam LPS bertanggung jawab terhadap reaksi
inflamasi jaringan, demam, dan syok. LPS dapat langsung
mengaktifkan sistem imun seluler dan humoral, yang dapat
menimbulkan septikemia (Guntur, 2008).
Produk yang berperan penting terhadap sepsis terutama
kandungan lipid A dalam LPS tersebut. Dalam aliran darah LPS
akan terikat pada protein yang bersirkulasi kemudian
berinteraksi dengan reseptor makrofag, limfosit, dan monosit
serta sel lain pada sistem retikuloendotelial. Hal ini akan
commit to user
komplemen dan koagulasi. Runtutan peristiwa tersebut dapat
diamati secara klinis sebagai demam, leukopenia, hipoglikemia,
hipotensi, syok, koagulasi intravaskuler hingga kematian karena
disfungsi organ (Brooks et al., 2003).
Karena kemampuannya dalam menyebabkan sepsis,
maka LPS dapat dimanfaatkan untuk menginduksi sepsis pada
percobaan. Caranya, LPS (lipopolisakarida) dari bakteri gram
negatif (E. coli paling sering digunakan), diinjeksikan secara i.p.
ke tikus putih dengan dosis 15 mg/kg. kemudian Survival dari
hewan coba dimonitor dengan interval 12 jam selama tujuh hari
(Fu Bu H et al., 2006).
3. Peranan Minyak Jinten Hitam dalam Penatalaksanaan Sepsis
a. Thymoquinone
Thymoquinone (2-isopropyl-5-methyl-1, 4-benzoquinone)
termasuk ke dalam golongan monoterpenoid keton (Nickavar et al.,
2003). Efek antinflamasi yang ditimbulkan oleh thymoquinone
berlangsung melalui mekanisme sebagai berikut (El Gazzar et
al.,2006):
1) Menghambat translokasi NF-κB ke dalam nukleus
commit to user
3) Penghambatan jalur lipoksigenase dan siklooksigenase yang
dapat menurunkan biosintesis mediator inflamasi
4) Penurunan produksi sitokin limfosit CD4+ Th2, terutama interleukin-4 (IL-4), yang berakibat langsung pada penurunan
proliferasi dan diferensiasi limfosit CD4+ Th2 dan secara tidak langsung pada proses pertumbuhan sel mast dan produksi
imunoglobulin-E (IgE)
5) Meningkatkan produksi IL-3 yang berperan sebagai
Macrophage Activating Factor (MAF)
6) Menurunkan produksi Reactive Oxygen Species (ROS) dan NO
b. Thymohidroquinone
Thymohidroquinone yang terkandung dalam Nigella sativa
memiliki akrivitas antibakterial, terutama terhadap bakteri gram
negatif, seperti Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas
aeruginosa, bakteri gram prositif seperti Bacilus subtilis,
Staphylococcus aureus serta jamur seperti Candida albicans
(Mariam and Basal, 2009)
c. Asam Linoleat
Mekanisme penghambatan reaksi inflamasi oleh asam
linoleat oleh asam linoleat adalah sebagai berikut:
commit to user
2) penurunan produksi sitokin proinflamasi (O’shea et al., 2004)
3) penurunan produksi senyaea radikal bebas (Sammon, 1999)
d. Asam Linolenat
Asam linolenat merupakan asam lemak tak jenuh majemuk
(polyunsaturated fatty acid (PUFA)) (Rolfes et al., 2006). Asam
linolenat atau asam lemak omega-3 mempunyai 18 atom karbon,
dimana ikatan rangkap pertamanya terletak pada atom karbon ke-3
dari ujung gugus metil omega (Sizer, 2006). Turunan asam lemak
omega-3 adalah Eicosapentaenoic Acid (EPA, C20:5 ω-3) dan
Decosahexaenoic Acid(DHA, c22:6 ω-6) (Almatsier, 2003).
Asam linolenat dapat meredam proses alergi inflamasi
melalui mekanisme sebagai berikut:
1) menghambat metabolisme asam arakhidonat (Barham et al.,
2000)
2) menurunkan produksi sitokin proinflamasi (Simopuolus et al.,
commit to user
B. Kerangka Pemikiran
1. Kerangka Berpikir Konseptual
2. Kerangka Berpikir Teoritis
Kandungan LPS dalam cecal inoculum ini di dalam serum darah
akan berikatan dengan antibodi membentuk kompleks
Lipopolisakarida-Antibodi (LPS-Ab) (Brahmbhatt et al., 2005). Dengan perantara reseptor
CD14+ dan Toll Like Receptor-4 (TLR-4) pada makrofag, LPS-Ab akan
ditampilkan sebagai Antigen Presenting Cell (APC) (Clark and Keterangan
: merangsang
: menghambat Cecal inoculum
Sitokin proinflamasi
kemokin Molekul
adhesi Faktor
Koagulasi
Caspase-3 Apoptosis Limfosit
Jumlah Limfosit
Nigella sativa TLR4
NF-κB
commit to user
Coppersmith, 2007). Interaksi antara LPS dan CD14+ dengan TLR-4 ini
akan membentuk suatu transduksi sinyal yang akan menginduksi aktivasi
NFκ-B (Diding dan Guntur, 2009). NFκ-B yang teraktivasi ini akan
menyebabkan peningkatan transkripsi dari sitokin proinflamasi (TNF-α,
IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ, leukotrien B4, GM-CSF, G-CSF), faktor
koagulasi (PAI-1, vWF, TF, fibrinogen), molekul adhesi serta kemokin
sehingga mengakibatkan peningkatan apoptosis limfosit (Wesche et al.,
2005). Di samping itu, sitokin proinflamasi ini juga akan mengaktifkan
caspase-3 yang akan meningkatkan apoptosis limfosit (Guo et al.,2006).
Adanya peningkatan apoptosis limfosit pada kondisi sepsis ini akan
menurunkan jumlah limfosit dalam sirkulasi.
Minyak jinten hitam (Nigella sativa) mengandung berbagai
senyawa yang berfungsi sebagai zat antibakteri, antiinflamasi dan
antioksidan. Nigella sativa mampu menghambat ekspresi NFκ-B
sehingga menurunkan produksi sitokin proinflamasi, kemokin, molekul
adhesi serta faktor koagulasi sehingga apoptosis limfosit dapat ditekan.
Dengan demikian, jumlah limfosit akan meningkat. Peningkatan jumlah
limfosit ini akan membantu menurunkan angka morbiditas dan mortalitas
akibat sepsis.
C. Hipotesis
Pemberian minyak jinten hitam (Nigella sativa ) dapat meningkatkan
commit to user
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan
rancangan penelitian the post test only controlled group design.
B. Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Histologi Fakultas
Kedokteran Universitas Sebelas Maret.
C. Subjek Penelitian
Subyek penelitian adalah mencit Balb/C dengan jenis kelamin jantan,
umur 2 - 3 bulan, berat badan + 20 - 30 gram, sehat, dan aktif. Mencit Balb/C
jantan ini diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan Universitas
Setia Budi (USB) Surakarta. Bahan makanan Mencit Balb/C berupa pakan
mencit BR.
D. Teknik Sampling
Pengambilan sampel dari populasi dilakukan secara insidental
sampling. Kemudian, sampel dibagi menjadi empat kelompok secara random
sederhana. Subjek penelitian sebanyak 24 ekor, yang dibagi menjadi empat
commit to user
kelompok perlakuan). Masing-masing kelompok terdiri atas enam ekor
mencit Balb/C jantan.
Adapun cara perhitungan besar sampel adalah dengan rumus Federer,
yaitu:
(n - 1) (t - 1) > 15 dengan n = jumlah mencit Balb/C per kelompok
t = jumlah kelompok
(n - 1) (t - 1) > 15 à t = 4
(n - 1) (4 - 1) > 15
3n - 3 > 15
3n > 18
n > 6 à n = 6 ekor
Dengan dasar tersebut, didapatkan jumlah mencit Balb/C per
commit to user
E. Alur Penelitian
Simple random
Sampel mencit Mencit Balb/C jantan umur 2-3 bulan berat badan 20 - 2-30 gram Populasi Mencit Balb/C jantan umur 2-3
bulan berat badan 20 - 30 gram
Hasil dianalisis dengan uji statistik ANOVA dilanjutkan dengan Post Hoc Test Menghitung jumlah limfosit pada setiap kelompok
24 jam setelah hari ke-13 mencit dikorbankan
Hari 8 - 13
commit to user
F. Identifikasi Variabel Penelitian
1. Variabel Bebas : minyak biji jinten hitam (Nigella sativa)
2. Variabel Terikat : jumlah limfosit
3. Variabel Perancu
a. Dapat Dikendalikan : genetik, umur, berat badan, makanan
b. Tidak Dapat Dikendalikan : suhu udara, kondisi psikologis mencit,
bioavailabilitas zat pada mencit.
G. Definisi Operasional Variabel 1. Minyak Jinten Hitam
Minyak Jinten Hitam merupakan skala kategorikal. Minyak Jinten
Hitam yang digunakan dapat diperoleh dari pasar atau supermarket
dengan merek ada pada peneliti. Penggunaan minyak Nigella sativa
untuk pemeliharaan kesehatan dan pengobatan terhadap penyakit pada
manusia adalah 30 - 45 ml perhari untuk sediaan cair. Dosis manusia
dengan berat badan 70 kg tersebut dikonversi terhadap mencit dengan
berat 20 - 30 gram adalah 0,0026 sehingga dosis untuk mencit adalah
0,078 - 0,104 ml perhari. Pada penelitian ini, dosis yang akan diberikan
kepada mencit adalah 0,1 ml perhari. Pemberian minyak jinten hitam ini
dilakukan secara peroral (El Saleh et al., 2004).
2. Cecal Inoculum
Untuk membuat model sepsis pada hewan coba digunakan injeksi
commit to user
et al., 2005). Cecal inoculum dibuat dengan mensuspensikan 200 mg
material dari cecal yang masih baru pada 5,0 mL dextrose water 5%
(D5W) steril. Selanjutnya disuntikkan dengan dosis 0,15 ml per mencit secara intraperitoneal. Material cecal diperoleh dari mencit donor sehat
yang dikorbankan dengan cervical dislocation. Pengorbanan ini
dilakukan setiap hari selama 5 hari. Cecal inoculum dibuat baru setiap
hari dan diberikan dalam waktu dua jam (Ren et al., 2002). Model cecal
inoculum mampu menggambarkan dengan baik keadaan mirip dengan
tanda-tanda piloerection, periocular discharge, tampak lesu, penurunan
nafsu makan dan minum, serta diare (Diding and Guntur, 2009). Cecal
innoculum merupakan skala kategorikal.
3. Ceftriaxone
Ceftriaxon merupakan antibiotik cephalosporin spektrum luas
semisintetik yang diberikan secara intravena (IV) atau intramuskuler
(IM). Adapun dosis yang dianjurkan untuk kasus infeksi pada manusia
adalah 1-2 gram sebanyak satu atau dua kali sehari (Petri, 2006).
Sedangkan dosis konversi dari manusia ke mencit dengan berat 20-30
gram adalah 0.0026 gram atau 26 mg. Dengan demikian, dosis
Ceftriaxon yang diberikan ke tikus adalah 0,0026-0,0052 gram atau
2,6-5,2 mg per ekor. Oleh karena itu kami mengambil dosis sebanyak 2,6-5,2
mg. Selanjutnya, Ceftriaxon ini dilarutkan dalam aquades sebanyak
hingga mencapai volume 0,05 mL dan disuntikkan secara intramuskuler.
commit to user
diperoleh di apotek rumah sakit maupun apotek swasta dengan resep
dokter. Ceftriaxon merupakan skala kategorikal..
4. Hitung Limfosit
Darah diambil dari sinus orbitalis mencit hingga mencapai
volume minimal 1ml kemudian dimasukkan ke dalam wadah yang telah
terisi EDTA sebagai antikoagulan. Hitung jenis limfosit dilakukan
dengan menggunakan alat differential lymphocite count di Klinik Budi
Sehat. Hitung limfosit ini menggunakan skala numerik
H. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat Penelitian
a. Kandang hewan penelitian
b. Sonde
c. Spuit injeksi
d. Timbangan Hewan
e. Pipet ukur
f. Termometer
g. Handscoen
h. Kertas Saring
i. Beker Glass
j. Timbangan obat
k. Tabung reaksi
commit to user
2. Bahan Penelitian
a. Hewan uji (40 ekor mencit Balb/C jantan)
b. Material cecal innoculum (10 ekor mencit Balb/C jantan)
c. Antibiotik Ceftriaxone
d. Minyak Nigella sativa
e. Dekstrose water 5%
f. Makanan hewan uji
I. Cara Kerja
1. Sebelum Perlakuan
a. Mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan
b. Kandang mencit disiapkan. Satu kandang untuk satu kelompok
mencit
c. Mencit sebanyak 40 ekor dikelompokkan secara acak menjadi 4
kelompok, masing-masing 10 ekor
d. Mencit diadaptasikan dengan lingkungan selama 7 hari
2. Pemberian Perlakuan
a. Kelompok 1 hanya diberi diet standar dan aquades peroral 0,117 ml
1 x sehari
b. Kelompok 2 diberi diet standar, aquades peroral 0,117 ml 1 x sehari
dan injeksi cecal inoculum 0,15 ml per mencit secara intraperitoneal
commit to user
c. Kelompok 3 diberi diet standar, diet standar, aquades peroral 0,117
ml satu kali sehari, injeksi cecal inoculum 0,15 ml per mencit secara
intraperitoneal perhari serta antibiotik ceftriaxone 5,2mg/0,05ml
secara intramuskuler satu kali sehari
d. Kelompok 4 diberi diet standar, aquades peroral 0,117 ml 1 x sehari,
injeksi cecal inoculum 0,15 ml per mencit secara intraperitoneal
perhari, antibiotik ceftriaxone 5,2 mg/0,05 ml secara intramuskuler
satu kali sehari serta minyak jinten hitam 0,117 ml peroral satu kali
sehari
3. Terminasi
Pada hari keempatbelas, mencit dikorbankan untuk diambil darahnya.
Darah dikumpulkan dari sinus orbitalis mencit untuk dilakukan
pengukuran hitung limfosit dengan menggunakan alat differential limfosit
count di Laoraturium Universitas Setia Budi.
J. Teknik Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan uji Analysis of
Variance (ANOVA) dan menggunakan program SPSS 16 for Windows
Release 11.5 dan p < 0,05 dipilih sebagai tingkat minimal signifikansinya.
Kemudian, dilanjutkan dengan uji Post Hoc test. Uji ANOVA adalah uji
hipotesis parametrik untuk membandingkan perbedaan mean pada lebih dari
dua kelompok. Uji ANOVA yang dipakai dalam penelitian kali ini adalah uji
commit to user
independen berskala kategorikal dengan satu variabel dependen berskala
numerik
Uji ANOVA harus memenuhi syarat berikut:
1. Varians homogen (sama)
2. Sampel kelompok independen
3. Distribusi data normal
4. Jenis data yang dihubungkan adalah ada atau tidaknya perbedaan mean
data numerik pada kelompok kategorik.
Jika uji one way ANOVA tidak terpenuhi, maka digunakan alternatif
uji hipotesis non-parametrik Kruskal-Wallis. Uji Kruskal-Wallis
membutuhkan syarat yang lebih longgar, yaitu:
1. Sampel berasal dari populasi independen, pengamatan satu dan yang
lainnya independen
2. Sampel diambil secara random dari populasi masing-masing
3. Data diukur minimal dalam skala ordinal.
Post Hoc test bertujuan untuk mengetahui lebih lanjut kelompok mana
yang berbeda meannya apabila pada penggunaan uji ANOVA dihasilkan ada
commit to user
BAB IV
HASIL PENELITIAN
A. Data Hasil Penelitian
Pada penelitian ini didapatkan data survival dari masing-masing
kelompok perlakuan. Survivalitas masing-masing kelompok disajikan pada
tabel 3.
Tabel 3. Jumlah Hewan Coba yang Masih Hidup dan yang Sudah Mati
Kontrol Negatif Kontrol Positif Perlakuan 1 Perlakuan 2
Jumlah Awal 10 10 10 10
Jumlah Hidup 10 6 8 9
Jumlah Mati 0 4 2 1
Dalam persen 100 % 60 % 80 % 90 %
Di tabel 3 terlihat bahwa jumlah akhir mencit yang paling sedikit
adalah berasal dari kelompok sepsis yang tidak diberi terapi apapun, yaitu
tersisa 6 ekor. Dan jumlah ini masih memenuhi syarat jumlah mencit
minimal, yang didapat dari penghitungan dengan rumus frederer sebelumnya.
Meskipun jumlah akhir kelompok lain lebih dari 6 mencit, namun yang
commit to user
Setelah dilakukan pemeriksaan hitung limfosit total dengan
menggunakan alat differential lymphocyte count, didapatkan data keempat
kelompok mencit adalah sebagai berikut:
Tabel 4. Hasil Hitung Limfosit Keempat Kelompok Mencit, dalam satuan % leukosit.
No. Mencit Kontrol Negatif Kontrol Positif Perlakuan 1 Perlakuan 2
1
distribusi data harus normal dan varians data harus homogen. Jika syarat tidak
commit to user
One-way ANOVA atau Kruskal Wallis menghasilkan nilai p < 0,05 maka
dilanjutkan dengan Post Hoc test.
1. Uji Normalitas
Uji normalitas dilakukan untuk mengetahui apakah distribusi data
normal. Nilai p > 0,05 menunjukkan bahwa distribusi data normal.
Hasil uji normalitas data hitung limfosit darah mencit
menunjukkan nilai p = 0,470 untuk kelompok kontrol negatif, p = 0,236
untuk kelompok kontrol positif, p = 0,902 untuk kelompok perlakuan 1
dan p = 0,708 untuk kelompok perlakuan 2. Karena semua kelompok
mempunyai nilai p > 0,05 maka dapat disimpulkan bahwa data hasil
transformasi berdistribusi normal.
2. Uji Homogenitas
Uji homogenitas digunakan untuk mengetahui varians data
homogen atau tidak. Nilai p > 0,05 menunjukkan varians data homogen.
Hasil uji homogenitas data hitung limfosit darah mencit
menunjukkan nilai p = 0,837 sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa
varians data homogen.
3. Uji One-Way ANOVA
Analisis data hitung limfosit total mencit dengan menggunakan
commit to user
0,05, maka terdapat perbedaan yang bermakna antarkelompok sehingga
dilanjutkan dengan analisis Post Hoc.
4. Uji Post Hoc
Uji Post Hoc dilakukan untuk mengetahui lebih lanjut kelompok
mana yang berbeda meannya apabila pada penggunaan uji One-way
ANOVA dihasilkan ada perbedaan yang bermakna. Dari hasil Uji Post
Hoc didapatkan terdapat perbedaan hitung limfosit secara bermakna
antara mencit kelompok kontrol negatif dengan kelompok mencit yang
diinjeksi cecal inoculum (p = 0,000). Selain itu, pada kelompok mencit
yang diinjeksi cecal inoculum dengan mencit kelompok sepsis yang
diberikan terapi antibiotik ceftriaxone (kelompok perlakuan 1), terdapat
perbedaan hitung limfosit secara bermakna (p = 0,030). Perbedaan hitung
limfosit yang bermakna (p = 0,030) juga dijumpai pada kelompok
perlakuan 1 dengan mencit kelompok sepsis yang diberikan terapi
kombinasi antibiotik ceftriaxone dan minyak jintern hitam (kelompok
perlakuan 2). Namun, tidak dijumpai adanya perbedaan hitung limfosit
yang bermakna antara kelompok kontrol negatif dengan kelompok
perlakuan 2 (p = 0,865)
Hasil Uji Post Hoc secara lengkap disajikan dalam tabel 5.
Tabel 5. Rangkuman Uji Post Hoc
commit to user
Kontrol negatif vs Kontrol Positif
Kontrol negatif vs Perlakuan 1
Kontrol negatif vs Perlakuan 2
Kontrol positif vs Perlakuan 1
Kontrol positif vs Perlakuan 2
Perlakuan 1 vs Perlakuan 2
0,000
Dari hasil penelitian ini diperoleh rata-rata persentase hitung limfosit darah
tepi mencit kelompok kontrol positif adalah 51,22 % (51,22 sel limfosit setiap 100
sel leukosit darah tepi). Nilai ini lebih rendah dibandingkan dengan kelompok
kontrol negatif (80,32 %). Hal ini membuktikan bahwa pemberian cecal inoculum
pada mencit kelompok kontrol positif mampu menyebabkan sepsis tahap awal
(early sepsis). Dari hasil penelitian, injeksi cecal inoculum secara intraperitonel
dengan dosis 6 mg/mencit/i.p/hari mampu memperlihatkan tanda-tanda
piloerection, periocular discharge, tampak lesu, penurunan nafsu makan dan
minum serta diare. Terlihat infeksi yang berlebihan, kerusakan hebat dan
perlengketan di sejumlah organ termasuk hepar, lien, serta ginjal. Pada sepsis,
commit to user
Pada sepsis, lipopolisakarida mikroorganisme pada cecal inoculum akan terikat
pada reseptor CD14+ dan Toll Like Receptor-4 (TLR-4) pada makrofag sehingga
akan mengaktivasi NFκ-B (Diding dan Guntur, 2009). NFκ-B yang teraktivasi ini
akan menyebabkan peningkatan transkripsi dari sitokin proinflamasi (TNF-α, IL
-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ, leukotrien B4, GM-CSF, G-CSF), faktor koagulasi
(PAI-1, vWF, TF, fibrinogen), molekul adhesi serta kemokin sehingga
mengakibatkan peningkatan apoptosis limfosit (Wesche et al., 2005). Di samping
itu, sitokin proinflamasi ini juga akan mengaktifkan caspase-3 yang akan
meningkatkan apoptosis limfosit (Guo et al.,2006). Selain itu, adanya pelepasan
dini dari complement 5a (C5a) pada kondisi sepsis akan mengakibatkan apoptosis
limfosit (Guo et al., 2006). Akibatnya jumlah limfosit dalam sirkulasi menurun.
Penurunan jumlah limfosit ini berhubungan dengan disfungsi imun serta Multiple
Organ Disfunction selama sepsis sehingga akan meningkatkan mortalitas. Hal ini
sesuai dengan hasil penelitian yang menunjukkan bahwa kelompok kontrol positif
mempunyai tingkat survivalitasyang paling rendah, yaitu 60 %.
Hasil uji Post Hoc menunjukkan adanya perbedaan jumlah limfosit yang
bermakna antara kelompok sepsis (kontrol positif) dengan kelompok kelompok
sepsis yang diberikan terapi antibiotik ceftriaxone (kelompok perlakuan 1).
Pemberian antibiotik ceftriaxone secara bermakna mampu meningkatkan hitung
limfosit pada hewan coba model sepsis. Hal tersebut dikarenakan antibiotik
ceftriaxone mampu membunuh bakteri tanpa menyebabkan pelepasan LPS yang
lebih banyak ke dalam darah. Berkurangnya jumlah LPS ini akan menyebabkan
pro-commit to user
inflamasi, kemokin, molekul adhesi serta faktor koagulasi. Akibatnya, terjadi
penurunan apoptosis limfosit sehingga jumlah limfosit dalam sirkulasi meningkat.
Hal tersebut dibuktikan dengan hasil penelitian yang menunjukkan rata-rata
persentase limfosit yang lebih tinggi pada kelompok perlakuan 1 (65,27 %)
dibandingkan dengan kelompok kontrol positif (51,22 %). Peningkatan rata-rata
persentase limfosit ini akan meningkatkan sekresi sitokin anti-inflamasi dan faktor
pertumbuhan sehingga akan meningkatkan survivalitas penderita sepsis. Hal
tersebut dibuktikan dengan lebih tingginya angka survivalitas hewan coba pada
kelompok perlakuan 1 (80 %) dibandingkan dengan kelompok kontrol positif (60
%).
Hasil uji Post Hoc juga menunjukkan adanya perbedaan jumlah limfosit
yang bermakna antara kelompok perlakuan 1 (kelompok sepsis yang diberikan
diberikan terapi antibiotik ceftriaxone) dengan kelompok sepsis yang diberi terapi
kombinasi antibiotik ceftriaxone dan minyak jinten hitam (perlakuan 2). Hal ini
sesuai dengan teori bahwa minyak jinten hitam mampu memperbaiki kemampuan
apoptosis limfosit. Minyak jinten hitam mengandung senyawa Thymoquinone,
asam linoleat dan asam linolenat yang bermanfaat sebagai zat antiinflamasi dan
antioksidan sehingga dapat menghambat pelepasan ROS akibat adanya stres
oksidatif pada proses inflamasi (Aniya et al., 2000). Aktivitas antiinflamasi
minyak jinten hitam dapat menurunkan aktivitas NF-κB sehingga akan
menurunkan produksi sitokin pro-inflamasi, kemokin, molekul adhesi faktor
koagulasi serta stres oksidatif. Dengan demikian, minyak jinten hitam dapat
