M Mochtar dkk. Fraksi stromal lipoaspirat pada penyembuhan luka
APLIKASI KLINIS FRAKSI STROMAL LIPOASPIRAT
NONKULTUR PADA PENYEMBUHAN LUKA
Moerbono Mochtar, Endra Yustin, Yuyun Rindiastuti, Alamanda Murasmita
SMF Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/RSUD DR. Moewardi. Surakarta
ABSTRAK
Sel stem stromal / sel stem mesenkimal jaringan adiposa dapat menjadi alternatif terapi penyembuhan luka. Isolasi fraksi stromal dari lipoaspirat relatif lebih mudah dan memungkinkan untuk memperoleh sel stromal dalam jumlah yang lebih banyak, sehingga jaringan adiposa dinilai sebagai sumber sel stem stromal nonkultur yang ideal. Isolasi sel stromal dari fraksi darah dan salin lipoaspirat dapat dilakukan secara nonenzimatis dengan biaya yang lebih murah dan waktu yang lebih singkat.
Seorang perempuan 42 tahun datang dengan ulkus regio dorsum pedis sinistra derajat III yang telah diderita selama 5 tahun. Pada pemeriksaan fisis didapatkan lesi kulit berupa luka dengan ukuran 8x4x1cm, batas tegas, basah, tidak terdapat pus, permukaan hiperemis, tidak merata, dengan dasar fasia dan jaringan fibrotik, teraba panas di sekitar luka. Diagnosis ulkus ditegakkan berdasarkan temuan klinis, sedangkan penentuan derajat ulkus ditegakkan dengan biopsi dan pemeriksaan histopatologis. Diagnosis ulkus derajat III ditegakkan berdasarkan hilangnya seluruh lapisan kulit yang disertai kerusakan jaringan subkutan.
Pasien diterapi dengan fraksi stromal lipoaspirat nonkultur yang diperoleh dari isolasi fraksi tumessen secara nonenzimatis pada permukaan luka. Aplikasi klinis ini diharapkan dapat menjadi studi awal untuk mengetahui efek fraksi stromal lipoaspirat pada penyembuhan luka. (MDVI 2011; 38/1:11-16)
Kata kunci: sel stem mesenkim jaringan adiposa, fraksi stromal, penyembuhan luka
ABSTRACT
Adipose derived stromal stem cells/ mesenchymal stem cells play a key role in skin biology such as wound healing. Adipose tissue contains a large number of stromal stem cells Because it is easy to obtain in large quantities, adipose tissue constitutes an ideal source of uncultured stromal stem cells. Non enzymatic stromal cell isolation from blood and saline fraction of lipoaspirate was cost efficient.
A 42 years old female was diagnosed having stage III ulcer in lateral area of dorsum pedis within 5 years. We found out a wound area sized 8x4x1 cm, well defined, wet without any pus, hyperemia, with fascia and fibrotic tissue in based, and mild on palpation. Ulcer is diagnosed by clinical findings, while ulcer staging determined by biopsy and histopatological review. Third degree ulcers were diagnosed based on clinical finding, a full skin loss followed by the damage of subcutaneous tissue.
The patient recieved a nonculture stromal fraction of lipoaspirate treatment which obtained from non enzimatic blood and saline fraction isolation. This clinical therapy is presumed as pre liminary investigation of lipoaspirate stromal fraction effect on wound healing. (MDVI 2011; 38/1:11-16)
Key words: adipose derived mesenchymal stem cells, stromal fraction, wound healing. .
Laporan Kasus
Korespondensi : Jl. Kol. Sutarto No.132 Surakarta
Telp. 0271-663144
MDVI Vol. 38.No.1 Tahun 2011: 11-16
PENDAHULUAN
Fraksi stromal jaringan mesenkim merupakan campuran antara eritrosit, limfosit, dan sel stromal yang memiliki karakteristik seperti sel stem multipoten sehingga sering disebut sebagai sel stem stromal maupun sel stem mesenkimal. Fraksi stromal diisolasi dari jaringan mesodermal yang meliputi sumsum tulang, otot, perikondrium, dan jaringan adiposa. Isolasi fraksi stromal dari jaringan adiposa relatif lebih mudah dan memung-kinkan untuk memperoleh sel stromal dalam jumlah lebih banyak, sehingga jaringan adiposa dinilai sebagai sumber sel stem stromal nonkultur yang ideal.1
Penelitian melaporkan efek sel stem mesenkimal jaringan adiposa terhadap proliferasi sel fibroblas yang berperan dalam biologi kulit pada proses penyembuhan luka, pembentukan jaringan parut, dan penuaan.2 Selain itu, dilaporkan pula bahwa sel stem mesenkimal sumsum tulang dan beberapa faktor pertumbuhan berhasil mempercepat penyembuhan luka pada luka kronis. Sel stem mesenkimal jaringan adiposa memiliki petanda permukaan yang serupa dengan stem cell mesenkimal sumsum tulang.1 Berkaitan dengan hal tersebut, sel stem mesenkimal jaringan adiposa dapat menjadi alternatif terapi penyembuhan luka tanpa melalui proses kultur.1,2
Sel stem stromal/sel stem mesenkimal jaringan adiposa nonkultur dapat diisolasi menggunakan metode enzimatis maupun nonenzimatis.3 Teknik enzimatis me-libatkan penggunaan kolagenase untuk mengisolasi fraksi stromal murni dari komponen lipoaspirat.4 Di lain pihak, fraksi darah dan salin lipoaspirat dinilai kaya akan sumber sel stromal karena diperoleh dari daerah perivaskular. Isolasi sel stromal dari fraksi darah dan salin dapat dilakukan secara nonenzimatis dengan biaya yang lebih murah dan waktu yang lebih singkat.3,4
Berikut dilaporkan aplikasi klinis fraksi stromal lipoaspirat nonkultur yang diperoleh dari isolasi fraksi darah dan salin secara nonenzimatis pada seorang perempuan usia 42 tahun dengan ulkus regio dorsum pedis sinistra derajat III. Aplikasi klinis ini diharapkan dapat menjadi studi awal untuk mengetahui efek fraksi stromal lipoaspirat pada penyembuhan luka kronis.
KASUS
Perempuan 42 tahun bertempat tinggal di Magetan, Jawa Timur datang ke klinik pribadi tanggal 27 November 2010 dengan keluhan utama luka pada punggung kaki kiri bagian luar. Kurang lebih 5 tahun sebelumnya pasien terjatuh dan memar pada punggung kaki sebelah kiri. Kurang lebih 1-2 bulan setelah terjatuh timbul luka pada daerah memar yang disertai bengkak saat aktivitas. Luka tersebut diperiksakan ke dokter, mendapat terapi anti-biotik, tetapi luka melebar, gatal dan tidak mengalami perbaikan.
Pasien menyangkal riwayat penyakit serupa se-belumnya. Pasien menyangkal keadaan cepat lapar, cepat haus, sering buang air kecil yang mengganggu, serta pe-nurunan berat badan yang abnormal. Pasien menyangkal adanya anggota keluarga yang menderita penyakit serupa. Pada pemeriksaan fisis didapatkan keadaan umum baik, gizi cukup. Tanda vital dalam batas normal. Pada punggung kaki kiri didapatkan lesi kulit berupa luka ukuran 8x4x1cm dengan batas tegas, basah, permukaan hiperemis tidak merata, dengan dasar fasia dan jaringan fibrotik dan daerah sekitar luka teraba panas. Diagnosis kerja pada pasien ini adalah ulkus regio dorsum pedis lateral sinistra derajat III. Diagnosis ulkus ditegakkan berdasarkan temuan klinis, sedangkan penentuan derajat ulkus melalui biopsi dan pemeriksaan histopatologis.12 Pada kasus ini, diagnosis ulkus derajat III ditegakkan berdasarkan hilangnya seluruh lapisan kulit yang disertai kerusakan jaringan subkutan.
Pasien diterapi dengan fraksi stromal lipoaspirat yang ditempelkan pada permukaan luka. Pada terapi hari pertama tidak diberikan antibiotik dan antijamur oral maupun topikal, pasien diberi edukasi tentang perawatan luka dan dianjurkan kontrol setiap 5 hari setelah terapi.
Kontrol pertama, didapatkan luka mengecil (7.5x3.5x0.7cm) dan mulai timbul jaringan granulasi yang merata pada area luka, pada hari kelima ini luka di-bersihkan dan pasien diberi antijamur oral selama 1 minggu. Kontrol hari kesepuluh, didapatkan ukuran luka mengecil (7x3x0.4cm), mulai terjadi epitelisasi pada tepi luka, luka dirawat dan antijamur oral dihentikan. Hari kelima belas, ukuran luka menjadi 6x2.5x0.1cm, epiteli-sasi semakin meluas dan mulai timbul pada bagian tengah luka; hari ke-20, ukuran sebesar 5x1.5x0.1cm epitelisasi tersebar merata pada area luka; hari ke-25, didapatkan luka menutup dan sejajar area sehat, terdapat epitelisasi di seluruh area luka dengan sedikit area fibrotik.
DISKUSI
M Mochtar dkk. Fraksi stromal lipoaspirat pada penyembuhan luka
Gambar 1. Karakteristik morfologi stem cell stromal jaringan
adiposa in vitro, formasi sel mirip fibroblas.2
Sel stromal dapat diisolasi dari jaringan adiposa dengan metode yang mudah dalam jumlah yang besar, sehingga jaringan adiposa dinilai sebagai sumber sel stromal nonkultur yang ideal.2 Sel stem stromal dapat diisolasi dari lipoaspirat yang diambil dari lemak sub-kutan daerah paha, pantat, maupun abdomen.6 Lipoaspirat diisolasi dengan metode enzimatis maupun nonenzimatis untuk memperoleh sel stromal. Lipoaspirat terdiri dari dua komponen yaitu fraksi campuran darah dan salin serta fraksi lemak pada lapisan atas.2,6 Fraksi stromal yang diisolasi dari lipoaspirat merupakan populasi campuran antara sel stromal, eritrosit, sel leukosit, dan sel endotel. Isolasi sel stromal dari fraksi lemak dilakukan secara enzimatis menggunakan enzim kolagenase, selanjutnya fraksi stromal harus dipisahkan dari eritrosit, leukosit, dan sel endotel untuk mendapatkan sel stem stromal murni.2,7 Penelitian melaporkan bahwa dalam 300 ml fraksi lemak lipoaspirat dapat diisolasi sebanyak 106 sel stromal dengan kemurnian 95%.7
Telah dilaporkan pula bahwa fraksi darah dan salin lipoaspirat merupakan sumber sel stem stromal jaringan lemak berkaitan dengan komponen ruang perivaskular yang terdapat pada tumesen.2 Isolasi fraksi darah dan salin lipoaspirat dapat dilakukan dengan metode non-enzimatis, dalam hal ini penggunaan red blood cell lysis buffer, suatu larutan yang merupakan campuran antara tris
buffer dan NH4Cl untuk melisiskan eritrosit, dapat
ditambahkan untuk membersihkan sel stromal dari kontaminasi eritrosit. Terdapat penelitian melaporkan bahwa dari 100 ml fraksi tumesen dapat diisolasi sebanyak 100.000 sel stromal.2,8
Lipoaspirat diperoleh dari sedot lemak yang dilaku-kan dengan teknis aseptik oleh dokter spesialis kulit dan kelamin. Lemak yang diambil merupakan lemak subkutan pada daerah abdomen. Area pengambilan lemak di-anestesi secara lokal dengan lidokain. Proses sedot lemak diawali dengan memasukkan larutan tumesen sebanyak 50cc (1.25ml xilokain, 0.05ml epinefrin, 0.625 natrium bicarbonat, 50ml NaCl) pada area pengambilan lemak. Pengambilan lemak dilakukan dengan kanul sehingga diperoleh lipoaspirat sebanyak 20 cc
Lipoaspirat terdiri atas fraksi tumesen dan fraksi lemak pada lapisan atas.
Sebanyak 20 ml lipoaspirat didiamkan dalam posisi vertikal selama kurang lebih 10 menit untuk memisahkan fraksi lemak dari fraksi tumessen. Fraksi lemak serta fraksi darah dan salin dipisahkan secara steril ke dalam dua tabung 15 ml. Sebanyak 12.5 ml fraksi lemak dicuci dengan NaCl dan disentrifugasi 200g selama 10 menit sebanyak 3 kali. Sedangkan 7.5 ml fraksi darah dan salin disentrifugasi dengan kecepatan 400g selama 10 menit, supernatan dibuang dan pelet ditinggalkan dalam tabung. Pelet yang mengandung fraksi stromal bersama eritrosit dan leukosit dicuci dengan NaCl dan disentrifugasi dengan kecepatan 400g selama 10 menit. Setelah sentrifugasi yang ketiga diharapkan dapat diperoleh fraksi stromal yang seminimal mungkin terkontaminasi oleh eritrosit dan leukosit. Selanjutnya, fraksi stromal yang telah diisolasi dicampurkan dengan fraksi lemak, campuran tersebut kemudian dihomogenisasikan menggunakan vortex, sehingga fraksi stromal yang dicampurkan pada lemak siap diaplikasikan pada permukaan luka kronis.
Aplikasi fraksi stromal lipoaspirat pada luka kronis. Proses penyembuhan luka secara umum meliputi proses inflamasi, proliferasi, dan regenerasi. Penyembuhan luka diawali oleh proses migrasi fibroblas yang terjadi pada fase inflamasi yang diinduksi oleh berbagai sitokin dan kemokin.4 Migrasi fibroblas pada area luka diikuti dengan proliferasi fibroblas dan peningkatan sintesis kolagen serta ekstraseluler matriks. Proses penyembuhan luka ini melibatkan interaksi antar sel, interaksi antara sel dengan sitokin, dan sel dengan lingkungan mikro (niche) pada area luka.4,8 Penyembuhan luka yang normal menghasil-kan jaringan kulit fungsional tanpa hipergranulasi dan hiperplasi.5
MDVI Vol. 38.No.1 Tahun 2011: 11-16
telah luka kering, fraksi stromal yang telah dicampurkan dengan fraksi lemak ditempelkan di atas luka tersebut, tanpa disertai dengan pemberian antibiotik dan antijamur topikal maupun oral. Kemudian luka ditutup dengan tule steril dan duoderm di atasnya, selanjutnya ditutup dengan kasa steril. Evaluasi perkembangan luka setelah terapi
dilakukan setiap 5 hari bersama dengan medikasi. Indikasi keberhasilan terapi dinilai dengan luas luka dan proses epitelisasi luka.
Perkembangan luka setelah pemberian fraksi stromal lipoaspirat nonkultur:
Hari-1. Ukuran luka:8x4x1cm Hari-5. Ukuran luka: 7.5x3.5x0.7cm
Hari-10. Ukuran luka: 7x3x0.4cm Hari-15. Ukuran luka: 6x2.5x0.1cm
M Mochtar dkk. Fraksi stromal lipoaspirat pada penyembuhan luka
Proses penyembuhan luka pada jaringan kulit me-libatkan interaksi antara fibroblas dengan sel di sekitarnya yaitu sel keratinosit, sel lemak, dan sel mast.2 Isolasi fraksi stromal dari lipoaspirat ditandai dengan kemam-puannya untuk membentuk koloni mirip sel fibroblas (fibroblast like cell: colony forming unit fibroblast; CFU-F) secara in vitro.2,4 Penelitian melaporkan bahwa hasil isolasi fraksi stromal dari lipoaspirat mampu memacu proliferasi dan aktivasi sel fibroblas.2,3 Penelitian me-laporkan bahwa stem cell stromal jaringan adiposa mampu memacu penyembuhan luka tanpa proses abnormal melalui interaksi antara sel stem stromal dengan beberapa faktor pertumbuhan yaitu platelet derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor β (FGF-β), transforming growth factor β (TGF β), dan vascular endothelial growth factor (VEGF).2,9 Ko-kultur sel fibro-blas dengan sel stem stromal menunjukkan peningkatan proliferasi dan aktivasi fibroblas serta peningkatan sintesis kolagen. Selain itu, perlukaan yang diberikan pada sel fibroblas memacu migrasi sel stem stromal menuju area perlukaan.9,10
Gambar 2. Ko-kultur sel fibroblas dengan stem cell stromal.
Terlihat efek migrasi stem cell stromal menuju area fibroblast yang mengalami perlukaan2
Aplikasi fraksi stromal non-kultur yang diperoleh dari fraksi darah dan salin lipoaspirat pada luka kronis dinilai memiliki efek pada penyembuhan luka.3 Pada aplikasi ini, didapatkan gambaran sel fibroblas yang mulai muncul pada hari kelima setelah pemberian fraksi stromal pada permukaan luka. Pada fase awal penyembuhan luka, sel fibroblas bermigrasi menuju area luka melewati lapisan fibrin matriks. Proses migrasi akan dilanjutkan oleh proliferasi dan sintesis matriks ekstraseluler untuk memulai proses regenerasi sehingga terbentuk jaringan kulit fungsional.4,5
Sel fibroblas memproduksi matriks ekstraselular berbasis kolagen yang mampu menggantikan lapisan matriks fibrin untuk memacu regenerasi yang dimulai dari bagian tepi luka melalui kapasitas kontraktilnya.6 Proses
penyembuhan luka dimulai dari tepi luka yang ditandai dengan proses epitelisasi dan penurunan ukuran luka.5,6 Pada hari kelima belum ditemukankan proses epitelisasi pada tepi luka dan tampak jaringan granulasi yang ter-sebar merata pada area luka. Pada evaluasi hari kelima ini diberikan antijamur oral selama 1 minggu sebagai pro-filaksis terhadap pertumbuhan jamur pada luka. Epiteli-sasi mulai tampak pada tepi luka pada hari kesepuluh yang disertai dengan penurunan ukuran luka. Pengamatan pada hari kesepuluh ini tidak didapatkan formasi jaringan hipergranulasi. Penelitian melaporkan bahwa sel stem stromal jaringan adiposa mempercepat penyembuhan luka tanpa proses abnormal yang ditandai dengan timbulnya jaringan hipergranulasi dan hiperplasi.8,9
Setelah migrasi fibroblas pada area luka, proses proliferasi dan sintesis kolagen tetap berlangsung sampai batas waktu yang tidak diketahui. Kolagen sebagai suatu matriks berperan sebagai salah satu komponen niche yang dapat memacu proliferasi dan interaksi antar sel.6,8 Selain itu, fraksi stromal melalui efek parakrin berinteraksi dengan niche sehingga dapat memacu proses penyembuhan luka.9 Ko-kultur sel fibroblas dengan medium terkondisi sel stem stromal menunjukkan kemampuan sel stem stromal dalam memacu proliferasi dan aktivasi fibroblas melalui jalur parakrin. Efek parakrin sel stem stromal ini meliputi peningkatan proliferasi fibroblas, peningkatan sintesis kolagen tipe I dan III, peningkatan fibronektin, dan penurunan matriks metaloproteinase 9 (MMP-9).10,11 Matriks ekstraselular, efek parakrin, interaksi antar sel, dan interaksi antara sel dengan sitokin membentuk suatu sel stem niche pada area luka yang akan memacu penyembuhan luka.11
Gambar 3. Efek medium terkondisi stem cell stromal pada
MDVI Vol. 38.No.1 Tahun 2011: 11-16
Efek parakrin dan peranan niche yang ditimbulkan oleh fraksi stromal non-kultur ini ditandai dengan se-jajarnya permukaan luka dengan area sehat di sekitarnya yang tampak pada hari ke-20. Selain itu, tampak jaringan granulasi mulai digantikan oleh proses epitelisasi yang diawali dari tepi luka dan kemudian tersebar pada bagian tengah luka. Pada evaluasi hari ke-20 didapatkan fokus epitelisasi yang tersebar merata pada area luka
Fibroblas menginduksi pembentukan matriks ekstra-selular, glikoprotein, dan beberapa molekul adesi. Melalui proses tersebut, bersama dengan interaksi antar sel serta interaksi antara sel dan sitokin, sel fibroblas akan membentuk kompleks fibroblas-keratinosit-endotelial. Kompleks ini tidak hanya berperan dalam proses penyem-buhan luka, tetapi berperan dalam mempertahankan integritas jaringan kulit.10,11
KESIMPULAN
Dapat disimpulkan bahwa pemberian fraksi stromal lipoaspirat nonkultur pada luka kronis berpengaruh terhadap penyembuhan luka yang diindikasikan dengan terjadinya epitelisasi dan penurunan ukuran luka.
DAFTAR PUSTAKA
1. Boquest AC, Shahdadfar A, Frønsdal K, Sigurjonsson O, Tunheim SH, Collas P, Brinchmann JE. Isolation and molecular profiling of human stromal stem cells derived from adipose tissue. Mol Biol Cell. In press 2005; 325: 35-46.
2. Serk Kim-Won, Soon Park-Byung, Hyuk Sung-Jong, Mo Yang-Jun, Beom Park-Seok, June Kwak-Sahng, Soo Park-Jeong. Wound healing effect of adipose derived stem cells: A critical role of secretory factors on human dermal fibroblast. J Dermatol Science 2007; 48: 15-24.
3. Fancis P. Michael, Sachs C. Patrick, Elmore W. Lynne, Holt E. Shawn. Isolating adipose derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 2010; 6:11-4 4. Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ,
Bovenkerk JE, dkk. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004; 109: 1292-8. 5. Kratchmarova I, Kalume DE, Blagoev B, Scherer PE, Podtelejnikov
AV, Molina H, dkk. A proteomic approach for identification of secreted proteins during the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes to adipocytes. Mol Cell Proteomics. 2002; 1: 213-22.
6. Li H, Fu X, Ouyang Y, Cai C, Wang J, Sun T. Adult bone-marrow derived mesenchymal stem cells contribute to wound healing of skin appendages. Cell Tissue Res. 2006; 326: 725-36.
7. Gosain A, DiPietro LA. Aging and wound healing. World J Surg. 2004; 28: 321-6.
8. Fitzpatrick RE, Rostan EF. Reversal of photodamage with topical growth factors: a pilot study. J Cosmet Laser Ther. 2003; 5:25-34. 9. Barry F, Boynton R, Murphy M, Haynesworth S, Zaia J. The SH-3
and SH-4 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001; 289: 519-24.
10. Woodbury D, Reynolds K, Black IB. Adult bone marrow stromal stem cells express germline, ectodermal, endodermal, and mesodermal genes prior to neurogenesis. J. Neurosci. Res. 2002; 69: 908-17.
11. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, dkk. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002;13: 4279-95.
