Transformasi Genetik Tanaman dengan Agrobacterium rhizogenes
Rulik Oktaviani1)1) Laboratorium Fisiologi, Kultur Jaringan, dan Mikroteknik, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang 65145, Jawa Timur, Indonesia. Email:
rulik.okt@gmail.com
ABSTRAK
Transformasi genetik pada tanaman memperkenalkan gen asing (transgen) ke dalam spesies lain. Metode transformasi genetik tidak langsung diperkenalkan melalui plasmid dengan mentransfer gen di dalamnya ke tanaman tingkat tinggi. Agrobacterium rhizogenes sebagai media transformasi Ri-plasmid ke dalam genom tanaman target yang menyebabkan munculnya akar rambut. Metode yang digunakan meliputi persiapan isolat A. rhizogenes, persiapan eksplan hipokotil/akar kecambah, transformasi A. rhizogenes pada eksplan, serta seleksi dan perbanyakan akar rambut transforman pada media selektif kanamisin. Hasil yang diperoleh dari jumlah total eksplan yang terbentuk paling besar adalah eksplan hipokotil yang ditransformasi. Jumlah akar yang terbentuk tiap eksplan menghasilkan hanya eksplan akar dan hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi 7 hari yang dapat membentuk akar dengan jumlah akar lebih banyak terbentuk pada eksplan hipokotil. Persentase pembentukan akar rambut menunjukkan eksplan yang membentuk akar rambut adalah eksplan akar dan hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi 7 hari dengan eksplan akar yang lebih besar membentuk rambut akar.
Kata Kunci: A. rhizogenes, akar rambut, Ri-plasmid, transformasi ABSTRACT
Genetic transformation in plant introduce foreign genes (transgenes) into other species. Indirect genetic transformation method introduced through plasmid with transfering genes to higher plant. Agrobacterium rhizogenes as transformation media of Ri-plasmid into genom of plant target that cause appearance of hairy roots. Methods used include A. rhizogenes isolate preparation, hypocotyl/root sprout explants preparation, A. rhizogenes transformation in explants, and the selection and propagation of transformed hairy roots on kanamycin selective media. The results obtained from the total number of explants that the most formed is transformed hypocotyl explants. The number of roots formed per explant produce only roots and hypocotyl control explants with co-cultivation period of 7 days to form roots with more number of roots formed on hypocotyl explants. The percentage of explants showed the formation of hairy roots that form hairy roots is root and hypocotyl control explants with co-cultivation period of 7 days with more number of roots formed on root explants.
Key Words: A. rhizogenes, hairy root, Ri-plasmids, transformation
PENDAHULUAN
Teknologi genetik telah membuka gaya baru dalam modifikasi tanaman pertanian dan menyediakan solusi baru untuk mengkreasikan berbagai macam gen dan seleksi sifat yang diinginkan. Transformasi genetik menyediakan alternatif yang berpotensi lebih cepat untuk pembiakan konvensional [1]. Sekarang ini, tanaman transgenik mencapai 10% dari jumlah tanaman pertanian di dunia [2].
Transformasi genetik pada tanaman merupakan alat fundamental untuk menghasilkan perbaikan genetik dengan cara memperkenalkan gen asing (transgen) ke dalam spesies yang tidak hanya memiliki hubungan kekerabatan tetapi juga bisa pada lintas kingdom seperti jamur,
virus, bakteri, maupun hewan [3]. Metode transformasi genetik dibedakan menjadi transformasi langsung atau tidak langsung. Metode biologis menggunakan bakteri termasuk dalam metode tidak langsung [4].
Penggunaan Agrobacterium rhizogenes sebagai media transformasi memungkinkan pengembangan tanaman transgenik melalui seleksi penanda berupa munculnya morfologi akar rambut sebagai indikator tanaman tersebut telah tertransformasi gen yang dibawa oleh plasmid. Jaringan tanaman terinfeksi oleh integrasi satu atau lebih dua DNA yang tertransfer (TL dan TR) dari Ri-plasmid ke dalam genom tanaman target [6]. Berdasarkan uraian diatas maka perlu adanya pengetahuan serta keterampilan tentang cara melakukan transformasi genetik pada tanaman menggunakan vektor Ri-plasmid dari Agrobacterium rhizogenes.
METODE PERCOBAAN Persiapan Isolat Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes diremajakan dengan mengambil satu ose steril lalu distreak pada suhu ruang selama 24 jam. Penentuan nilai optical density (OD) A. rhizogenes dilakukan dengan mengambil satu ose koloni tunggal dan dicampurkan ke dalam ± 35 ml, diinkubasi dalam shaker 100 rpm pada suhu ruang selama 16-24 jam. Pengukuran OD dilakukan dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 600 nm. Suspensi A. rhizogenes dengan nilai OD yang telah diketahui lalu disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Pelet disuspensikan kembali pada medium MS cair sehingga diperoleh suspensi A. rhizogenes pada medium MS dengan OD 0,5 masing-masing sebanyak 20 ml dengan konsentrasi bakteri 105 sel/ml.
Persiapan Eksplan Hipokotil/Akar Kecambah Biji tomat disterilisasi dengan larutan pemutih komersial 20% (0,25% NaCl) selama 15 menit lalu dibilas dengan akuades steril 2 kali masing-masing selama 5 menit. biji steril dikecambahkan pada media agar. Hipokotil/akar kecambah berumur 10 hari digunakan sebagai eksplan transformasi.
Transformasi A. rhizogenes pada Eksplan Hipokotil/akar kecambah tomat umur 10 hari dipotong dengan ukuran 0,5 cm, dilukai dengan jarum steril dan dimasukkan ke dalam suspensi A. rhizogenes 20 ml dengan nilai OD
0,5. Campuran eksplan dan A. rhizogenes dalam media MS cair digojok dengan shaker kecepatan 70 rpm selama 60 menit. Eksplan yang telah diinokulasi dengan A. rhizogenes diletakkan di atas kertas saring steril yang tealh dibasahi dengan medium MS cair. Sebagai kontrol, hipokotil/akar tanpa diinokulasi dengan A. rhizogenes. Eksplan diko-kultivasi pada media MS padat tanpa ZPT selama 5 dan 7 hari dalam kondisi gelap. Eksplan dicuci dengan antibiotik cefotaxim 500 ppm selama 5 menit lalu dikulturkan pada media MS padat yang telah ditambah cefotaxim 500 ppm selama 7 hari.
Seleksi dan Perbanyakan Akar Rambut Transforman pada Media Selektif Kanamisin
Eksplan pada kultur setelah 7 hari dipindahkan pada media selektif MS yang mengandung kanamisin. Kultur diinkubasi oada suhu 25OC dalam kondisi terang. Eksplan yang membentuk akar rambut menandakan bahwa eksplan telah tertransformasi dengan Ri-plasmid dari A. rhizogenes. Diamati kecepatan pembentukan akar, persentase eksplan yang membentuk akar, jumlah akar yang terbentuk tiap eksplan, panjang akar, serta berat basah akar setiap minggu selama 4 minggu.
HASIL DAN PEMBAHASAN Jumlah Total Eksplan Akar dan Hipokotil
Eksplan akar dan hipokotil dihitung banyaknya akar yang terbentuk selama 4 minggu dan didapatkan hasil pada gambar 1.
juga mengalami peningkatan jumlah eksplan.pada minggu II, sedangkan pada wakti ko-kultivasi 7 hari tidak mengalami peningkatan jumlah eksplan hingga pengamatan minggu IV. Berbeda dengan eksplan akar, eksplan hipokotil memiliki jumlah total eksplan yang lebih banyak pada periode ko-kultivasi 5 hari. Sementara eksplan akar yang ditransformasi dengan A. rhizogenes menunjukkan jumlah total yang tidak mengalami peningkatan jumlah total eksplan pada periode ko-kultivasi 5 hari, begitupun juga dengan periode ko-kultivasi 7 hari yang diamati hingga minggu IV. Namun, jumlah total eksplan hipokotil akar transforman lebih tinggi pada kecambah yang digunakan dapat menjadi faktor lebih banyaknya jumlah total eksplan pada periode kultivasi 5 hari dari pada periode ko-kultivasi 7 hari. Menurut Forbes dan Watson (1992) kemampuan eksplan untuk beregenerasi sangat ditentukan oleh media dan komposisi zat pengatur tumbuh dalam media. Zat pengatur tumbuh merupakan komponen kritikal dalam menentukan alur perkembangan sel tanaman. Zat pengatur tumbuh yang banyak digunakan dalam kultur sel atau jaringan adalah auksin dan sitokinin. Eksplan akar dan hipokotil yang ditransformasi A. rhizogenes lebih besar jumlah total eksplan yang tumbuh dari pada eksplan kontrol.
Jumlah Akar yang Terbentuk pada Tiap Eksplan Akar dan Hipokotil
Eksplan yang ditumbuhkan pada media MS dengan antibiotik membentuk akar primer terlebih dahulu sebelum membentuk akar rambut.
Eksplan yang berhasil membentuk akar didapatkan pada eksplan akar kontrol dan
hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi masing-masing 7 hari. Eksplan akar kontrol membentuk akar sebanyak 4 akar pada minggu I dan tidak mengalami perubahan hingga minggu IV. Sementara eksplan hipokotil kontrol membentuk akar sebanyak 4 akar pada minggu I dan meningkat menjadi 6 akar pada minggu II serta tidak mengalami perubahan jumlah akar hingga minggu IV. Eksplan yang tidak berhasil membentuk akar dapat disebabkan oleh beberapa faktor salah satunya adalah tidak ditambahkan zat pengatur tumbuh pada media MS.
Kurangnya lama waktu infeksi dapat menghasilkan eksplan transforman dalam jumlah kecil, dimana jangka waktu lebih lama untuk eksplan dalam medium infeksi mungkin menyebabkan kondisi hipertonik dan membuat sel pecah keluar jaringan, atau mungkin karena aktivitas berlebihan dalam mekanisme pertahanan yang menyebabkan kematian pada sel sehingga jumlah eksplan transforman menjadi rendah. Sel tanaman membutuhkan beberapa waktu untuk mengadopsi DNA asing membuat periode waktu menjadi sangat penting [8]. Kurangnya periode waktu ko-kultivasi kurang memaksimalkan integrasi dan kerja transfer DNA. Sementara periode waktu yang lebih lama juga dapat mematikan eksplan karena pertumbuhan berlebih dari Agrobacterium yang bersifat parasit pada eksplan dan menyebabkan pengurangan kandungan nutrisi dalam media [9].
Persentase Eksplan yang Membentuk Akar
Gambar 3. Persentase eksplan hipokotil dan akar yang membentuk akar rambut
hari. Eksplan akar kontrol membentuk akar rambut dengan persentase sebesar 40% pada minggu I dan tidak mengalami peningkatan hingga pengamatan sampai minggu IV. Sementara eksplan hipokotil kontrol memiliki persentase membentuk akar rambut sebesar 10% pada minggu I lalu meningkat menjadi 20% pada minggu II dan tidak mengalami peningkatan hingga pengamatan minggu IV. Persentase tertinggi eksplan yang membentuk akar rambut didapatkan pada eksplan akar kontrol dengan periode ko-kultivasi 7 hari, yakni 40%.
Gambar 4. Pengamatan minggu I eksplan (a) akar kontrol, pengamatan minggu II eksplan (b) hipokotil kontrol dan (c) akar kontrol dengan periode ko-kultivasi 7 hari yang membentuk akar rambut (AR: Akar Rambut)
Pengamatan eksplan hipokotil kontrol minggu I membentuk empat akar dan terdapat satu eksplan yang membentuk akar rambut. Pengamatan pada eksplan hipokotil kontrol minggu II terdapat enam akar pada masing-masing eksplan dengan tiga eksplan yang berhasil membentuk akar rambut. Eksplan akar kontrol didapatkan empat akar pada masing-masing eksplan dan semua akar berhasil membentuk akar rambut.
Eksplan yang membentuk akar rambut semuanya didapatkan pada eksplan dengan periode ko-kultivasi 7 hari. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Zia dkk., (2010) transformasi menggunakan Agrobacterium pada kedelai. Periode ko-kultivasi yang digunakan adalah 3 hari, 4 hari, dan 5 hari. Hasil maksimal ditunjukkan pada periode 5 hari. Sehingga periode ko-kultivasi mempengaruhi hasil eksplan yang membentuk rambut akar [10]. Eksplan yang paling banyak membentuk akar rambut adalah eksplan akar kontrol.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan, eksplan akar dan hipokotil yang ditransformasi A. rhizogenes lebih besar jumlah total eksplan yang tumbuh dari pada eksplan kontrol. Eksplan yang berhasil membentuk akar didapatkan pada eksplan akar kontrol dan hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi masing-masing 7 hari. Pembentukan akar lebih
banyak pada eksplan hipokotil. Eksplan yang membentuk akar rambut didapatkan pada eksplan akar kontrol dan hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi 7 hari. Pembentukan akar rambut lebih banyak pada eksplan akar.
DAFTAR PUSTAKA
[1] de Padua, V.L.M., Pestana M.C., Margis-Pinheiro M., de Oliveira D.E., dan Mansur E. 2000. Electroporation of intact embryonic leaflets of peanut: gene transfer and stimulation of regeneration capacity. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 36(5): 374-8. [2] Schlegel, R.H.J. 2007. Introduction to the
history of crop development: theories, methods, achievements, institutions, and persons. Binghamton. New York.
[3] Ow, D.W., K.V. Wood, M. Deluca, De Wet J.R., Helinski D.R., dan Howell S.H. 1986. Transient and stable expression of the firefly luciferaceae gene in plant cells and transgenic plants. Science. 234(4778): 856-859.
[4] Qayyum, A., Bakhsh A., Kiani S., Shahzad K., Ali Shahid A., dan Husnain T. 2009. The myth of plant transformation. Biotechnology Adv. 27(6): 753-63. transformed genotype and phenotype. Cell. 37(3): 959-967.
[7] Forbes, J.C. dan R.D. Watson. 1992. Plant in agriculture. Great Britain at the University Press. Crambrige.
[8] Mannan, A., Tooba N.S. dan Bushra M. 2009. Factors affecting agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Artemisia absinthium L. Pak. J. Bot. 41(6): 3239-3246 [9]Vergauwe, A., E. Van Geldre, D. Inze, M. Van
Montagu dan E. Vanden. 1998. Factors influencing Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Artemisia annua L. Plant Cell Rep. 18: 105-110.
