3. METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan selama enam bulan mulai dari bulan Juni hingga November 2011. Pengambilan sampel tunikata dan air dilakukan di Pulau Onrust, Teluk Jakarta. Penelitian ini juga mencakup kegiatan
pengukuran beberapa parameter kualitas perairan. Sampel tunikata yang diambil kemudian dianalisis di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas MIPA, IPB. Sedangkan analisis kualitas perairan di Laboratorium Produktivitas Lingkungan, Departemen MSP, FPIK, IPB. Secara rinci, referensi geografi tempat pengambilan sampel terletak pada koordinat 6°02,02' LS dan 106°44,2' BT yang dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Peta Lokasi Pengambilan Sampel Biota dan Sampel Air di Pulau Onrust, Teluk Jakarta
3.2. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Alat dan Bahan yang digunakan dalam Tahapan Penelitian
Tahapan Alat Bahan
1. Koleksi dan Pengambilan Sampel Biota dan Air
- Cool Box
- GPS - Botol sampel - Van Dorn water
sampler - Air laut - Tunikata - Formalin 4% - HCl 2N - HNO3 2. Analisis Kualitas Perairan - Termometer - DO Meter - pH Meter - Refraktometer - Spektrofotometer - Membran miliophore - Timbangan analitik - Vacuum pump - Vortex - AAS - Air Laut - HNO3 - H2SO4 pekat - APDC 2% - MIBK - Bruscine - Pewarna nitrit - Sodium Nitrofusit - Oksidation solution - Fenol 3. Isolasi dan Pemurnian Isolat Bakteri - Cawan petri - Jarum ose - Shaker - Autoclave - Pipet mikro - Media SWC - Spirtus - Akuades - Garfis - PbNO3 4. Uji Morfologi Bakteri - Mikroskop cahaya - Kaca objek - Bunsen - Jarum ose - Isolat bakteri - Nutrien broth
- Zat warna basa (Kristal violet) - Iodin - Alkohol 90% - Larutan safranin - Malachite green 5. Uji Fisiologi Bakteri - Cawan petri - Inkubator - Jarum ose - Kaca objek - Tabung Reaksi - Tabung Durham - Erlen Meyer - Pipet - Media Oksidative
Fermentative semi padat
- Media Starch Agar - Iodin
- Nutrien Agar (NA) - Indikator Neutral Red - Media Skim Milk Agar
(SMA) - 3% H2O2
- Media Trypticase Soy
Agar (TSA)
- Media Tryptone Broth - Pereaksi Kovac’s - Media Triple Sugar Iron
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri asosiasi pada tunikata dalam skala laboratorium. Metode penelitian yang dilakukan dikelompokkan menjadi lima tahap, yaitu: (1) koleksi dan pengambilan sampel; (2) analisis kualitas perairan; (3) isolasi dan pemurnian bakteri asosiasi tunikata; (4) perhitungan total bakteri; dan (5) karakterisasi bakteri. Secara ringkas alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.
Tahap pertama yaitu koleksi pengambilan sampel biota dan air di lapangan. Pengambilan sampel dilakukan pada kedalaman 1,5 m dari permukaan. Pengambilan sampel tunikata disertai dengan pengambilan sampel air di perairan Pulau Onrust, Kepulauan Seribu, DKI Jakarta yang diambil pada koordinat 6°02.02' LS dan 106°44.2' BT dengan SCUBA Set. Segera setelah pengambilan, sampel dimasukkan ke dalam plastik tahan panas steril dan dalam keadaan biota terendam seluruh tubuhnya dengan air laut dan diberi oksigen, lalu dibawa ke permukaan air secara perlahan. Sampel kemudian disimpan dalam coolbox yang berisi es dan selanjutnya sampel segar dibawa ke laboratorium untuk dianalisis secara mikrobiologis. Untuk pengambilan sampel air digunakan Van Dorn Water Sampler yang kemudian dimasukkan ke dalam botol sampel untuk mengetahui kualitas perairan secara kimiawi, sedangkan untuk parameter fisik perairan dilakukan secara in situ.
Tahap kedua yaitu analisis kualitas perairan untuk mengetahui parameter fisik perairan, kadar logam berat dan parameter kimia perairan lainnya. Metode yang digunakan adalah metode APHA (American Public
perairan kimia yang dianalisis adalah nitrat, nitrit, ammonia, TSS, serta kandungan logam berat Pb.
Tahap ketiga yaitu isolasi yang dilakukan untuk mendapatkan mikroba simbion dan isolat murni dari jaringan tunikata. Metode yang digunakan dalam isolasi bakteri ini adalah metode cawan tuang dengan media Sea
Water Completed (SWC) yang ditambahkan logam berat dan metode cawan
sebar. Komposisi dari media SWC dapat dilihat pada Lampiran 1. Isolat bakteri dikatakan murni jika bentuk morfologi koloni dan sel bakteri tersebut seragam. Biakan murni yang diperoleh disimpan di dalam media yang sama dan disimpan pada suhu beku (freezer). Biakan murni ini yang menjadi stok kultur untuk digunakan dalam menguji sifat-sifat fisiologis dan morfologinya.
Tahap ke empat yaitu perhitungan total bakteri yang bertujuan untuk mengetahui jumlah total bakteri asosiasi pada tunikata yang sudah diisolasi (biakan campuran). Metode perhitungan total bakteri ini menggunakan metode Total Plate Count (TPC) dengan media yang sama dalam tahap isolasi bakteri.
Tahap kelima yaitu karakterisasi bakteri yang bertujuan untuk memperoleh informasi mengenai morfologi koloni dan sel bakteri serta karakter fisiologinya. Pengamatan morfologi bakteri meliputi pengamatan morfologi koloni seperti bentuk atas, bentuk penonjolan, dan warna isolat, sedangkan morfologi sel meliputi uji pewarnaan Gram, uji pewarnaan spora, dan uji motilitas. Pengamatan sifat fisiologi bakteri dilakukan dengan uji hidrolisis pati, uji hidrolisis protein, uji hidrolisis lemak, uji katalase, uji oksidase, uji indol, uji H
2S, dan uji fermentasi gula (glukosa,manosa, laktosa,
bakteri tersebut diduga jenisnya dengan menggunakan tabel identifikasi dari
Bergey’s mannual (Holt et al, 1994).
3.4. Prosedur Analisisis
3.4.1. Analisis parameter lingkungan perairan
Tabel 2. menyajikan parameter lingkungan perairan yang diukur beserta alat yang digunakan.
Tabel 2. Parameter Fisika dan Kimia yang diukur Secara In Situ Maupun di Laboratorium Beserta Peralatan yang digunakan
Parameter Unit Alat/Bahan Keterangan
Fisika
Suhu °C Termometer Pengukuran Langsung
Salinitas ppt Refraktometer Pengukuran Langsung Kimia
TSS mg/L Pengukuran Laboratorium
Nitrat mg/L Pengukuran Laboratorium
Nitrit mg/L Pengukuran Laboratorium
pH pH Meter Pengukuran Laboratorium
Pb mg/L Pengukuran Laboratorium
Amonia mg/L Pengukuran Laboratorium
Parameter lingkungan perairan yang diukur adalah parameter fisika dan kimia. Parameter perairan yang diukur secara in situ adalah parameter fisika, sedangkan parameter kimia perairan dianalisa di laboratorium. Pengukuran secara langsung meliputi parameter suhu air laut (oC) dan salinitas (ppt). Prosedur analisis untuk parameter kimia perairan dapat dilihat pada Lampiran 2 hingga Lampiran 6.
Pengukuran tidak langsung dilakukan dengan cara mengambil contoh air laut. Analisis parameter kimia dilakukan di Laboratorium Produktivitas
Lingkungan, Departemen MSP, FPIK, IPB. Pengambilan contoh air laut digunakan untuk penentuan nilai parameter zat padat tersuspensi/TSS (mg/L), Nitrat (mg/L), Nitrit (mg/L), Amonia (mg/L) dan analisis logam berat Pb terlarut (mg/L). Contoh air diambil dengan menggunakan Van Dorn Water
Sampler yang terbuat dari bahan organik (PVC) dan memiliki kapasitas 2
liter, Sampel air diambil dari kedalaman 1 meter dari permukaan air.
Kemudian contoh air disimpan dalam cubitainer 1 liter. Untuk analisa logam berat, contoh air laut diawetkan dengan menambahkan HNO3 (pH < 2)
sebanyak 1 ml, dan disimpan dalam ice box untuk dianalisis lebih lanjut di laboratorium menggunakan prosedur APHA, 1992 in Hutagalung et al., 1997. Logam berat (kecuali Hg) yang terkandung dalam air laut, dalam keadaan asam, bereaksi dengan amonium pirolidin ditiokarbonat (APDC) dan membentuk senyawa kompleks organik yang tidak larut dalam fase air. Senyawa kompleks yang terbentuk kemudian dilarutkan dengan
menambahkan pelarut organik metal iso butyl keton (MIBK). Kompleks logam berat dan APDC dipecah dengan HNO3 pekat, sehingga terbentuk ion
dan larut kembali ke dalam fase air. Fase air yang ditampung kemudian diukur konsentrasi logam beratnya.
3.4.2. Isolasi bakteri yang berasosiasi dengan tunikata
Permukaan sampel tunikata dibilas dengan air laut steril sebanyak tiga kali (triturasi). Hal ini bertujuan agar hanya bakteri dengan daya simbiosis kuat yang akan terambil (Amstrong et al, 2001 dalam Abu Bakar, 2009). Tunikata diambil tiga bagian yang berbeda yaitu bagian atas tunikata, bagian tengah tunikata, dan bagian bawah tunikata dengan berat masing-masing 0,5 gr. Selanjutnya dibuat suspensi dari tunikata dengan
pengenceran 10-1 sampai 10-5 . Sebanyak 0,1 ml diambil secara aseptik dan diteteskan serta disebar ke dalam cawan petri yang telah berisi media padat SWC dan logam berat. Perlakuan ini dilakukan pada pengenceran 10-3,10-4, dan 10-5 dengan masing-masing tiga kali ulangan. Media yang digunakan sebagai perlakuan adalah K- yang merupakan media SWC yang tidak mengandung logam berat Pb, K+ adalah media SWC yang mengandung logam berat Pb sebesar 0,008 mg/L (Baku Mutu KEPMEN LH untuk biota laut), dan P adalah media SWC yang mengandung Pb sebesar 0,05 mg/L (keadaan logam Pb pada lokasi penelitian). Isolat yang sudah ditumbuhkan kemudian diinkubasi selama tiga hari pada inkubator dengan suhu 37 oC dengan posisi cawan terbalik dan diamati pertumbuhan koloni bakteri yang tumbuh pada media tersebut. Setiap koloni bakteri yang tumbuh dipisahkan berdasarkan warna dan bentuk koloni serta dimurnikan dengan
menggunakan media yang sama.
Koloni yang tumbuh terpisah kemudian digoreskan pada agar miring yang berisi media yang sama dengan menggunakan jarum ose dan
diinkubasi pada suhu 37 oC selama satu hari. Isolat bakteri tersebut kemudian diuji dengan menggunakan pewarnaan Gram untuk mengetahui kemurniannya. Isolat dikatakan murni jika bentuk morfologi koloni sel bakteri tersebut seragam. Isolat bakteri yang telah murni tersebut kemudian
disegarkan dengan menumbuhkannya pada media yang sama untuk kemudian dikarakterisasi berdasarkan sifat morfologi dan fisiologinya.
3.4.3. Perhitungan total bakteri (Fardiaz, 1992)
Perhitungan total bakteri biakan campuran dilakukan setelah masa inkubasi selesai untuk melihat seluruh bakteri yang berasosiasi dengan
Phallusia sp. Tahapan perhitungan total bakteri dapat dilihat pada Lampiran
7.
Berikut rumus untuk menghitung jumlah koloni : Jumlah koloni per gram = jumlah koloni per cawan x
3.4.4. Karakterisasi bakteri
Karakterisasi bakteri dilakukan dengan dua tahapan yaitu dengan uji morfologi dan uji fisiologi.
3.4.4.1. Uji morfologi
Pengamatan morfologi bakteri meliputi pengamatan morfologi koloni dan morfologi sel yang dilakukan untuk mengetahui sifat-sifat morfologi dari isolat bakteri.
a. Morfologi koloni
Pengamatan morfologi koloni dilakukan untuk mengetahui bentuk koloni dari atas, bentuk tepi, bentuk elevasi, dan warna koloni secara visual. b. Morfologi sel
Pengamatan morfologi sel meliputi bentuk sel, pewarnaan Gram, pewarnaan spora dan uji motilitas.
(1) Bentuk sel
Hasil preparat bakteri yang telah dibuat kemudian diamati bentuk
selnya menggunakan mikroskop cahaya sehingga dapat diketahui bentuknya (kokus, batang atau spiral).
(2) Pewarnaan Gram (Lay, 1994)
Pewarnaan Gram ini bertujuan untuk menentukan karakteristik mikroskopik setiap galur bakteri baik reaksinya maupun bentuknya. Pewarnaan Gram menggunakan empat jenis larutan yaitu zat warna basa (Kristal violet), mordant (lugol), pencuci zat warna (alkohol), dan zat warna lain (countersain) yaitu larutan safranin. Tahap-tahap pewarnaan Gram dapat dilihat pada Lampiran 8. Bentuk sel bakteri yang diamati
menggunakan mikroskop cahaya pada perbesaran 100 x10. Bakteri dinyatakan bersifat Gram positif apabila warna selnya berwarna ungu dan Gram negatif apabila selnya berwarna merah.
Perbedaan reaksi atau sifat bakteri ini ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Bakteri Gram positif struktur dinding selnya lebih tebal dan
mengandung lebih banyak protein serta kandungan lipid yang rendah. Karena protein pada bakteri Gram positif yang banyak maka zat pewarna kristal violet yang ditambahkan akan tertahan di protein. Pemberian alkohol menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarna safranin tidak dapat masuk ke dalam sel karena masih tertahannya zat pewarna kristal violet di protein sehingga sel tetap bewarna ungu. Sedangkan bakteri Gram negatif memiliki struktur dinding sel yang lebih tipis dan kandungan lipid tinggi serta rendah protein. Kristal violet yang terikat di protein akan hilang ketika dibilas dengan alkohol karena rendahnya kadar protein. Sel yang kosong tersebut akan meyerap pewarna safranin sehingga sel menjadi berwarna merah (Pelczar, 1986).
(3) Perwarnaan spora (Hadioetomo,1985)
Pewarnaan spora hanya dilakukan pada bakteri yang memiliki bentuk sel batang dan sifat Gram positif. Tahap pewarnaan spora dapat dilihat pada
Lampiran 9. Kemudian preparat tersebut diamati dibawah mikroskop. Spora bakteri akan terlihat bewarna hijau sedangkan sel vegetatif akan bewarna merah.
(4) Uji motilitas
Uji motilitas dilakukan terhadap semua isolat untuk melihat pergerakan bakteri. Bila pertumbuhan bakteri menyebar maka bakteri tersebut bergerak (motil) dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar dan hanya berupa satu garis, maka bakteri tersebut tidak bergerak (non-motil). Tahap uji motilitas dapat dilihat pada Lampiran.10.
3.4.4.2. Uji fisiologi
Sifat fisiologi bakteri dilakukan dengan uji hidrolisis pati, uji hidrolisis protein, uji hidrolisis lemak, uji katalase, uji oksidase, uji indol, uji H
2S, dan uji fermentasi gula (Lampiran 11 - 18). Komposisi media untuk uji
