Pengenalan Teknik Dasar Mikrobiologi (Metode Aseptik)
I. Tujuan
Menentukan keberhasilan metode aseptik pada teknik penyiapan media padat, spread method, dan streak method.
II. Teori Dasar
Steril merupakan kondisi suatu media yang terbebas dari kontaminasi oleh mikroorganisme. Salah satu teknik sterilisasi yang sering digunakan adalah pemanasan dengan autoclave pada suhu 1210C. Teknik ini mengaplikasikan suhu yang tinggi dan tekanan yang tinggi pada wadah terisolasi sehingga protein mikroorganisme dapat mengalami kerusakan dan mati.
Teknik aseptik sangat penting dalam pengerjaan mikrobiologi yang memerlukan ketelitian dan keakuratan disamping kesterilan yang harus selalu dijaga agar terbebas dari kontaminan yang dapat mencemari. Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan komplek. Udara merupakan media masuknya suatu kontaminan ke dalam wadah kultur bakteri. Keragaman yang luas dalam hal tipe nutrisi di antara bakteri, diimbangi oleh tersedianya berbagai macam media yang banyak macamnya untuk kultur murni.
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
Media merupakan suatu bahan yang terdiri dari campuran zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan dan pertumbuhan mikroba. Fungsi media antara lain, untuk isolasi, untuk memperbanyak, untuk pengujian sifat-sifat fisiologi,
untuk perhitungan jumlah mikroba. Agar mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak di dalam media, diperlukan persyaratan tertentu bagi media, yaitu : 1. Harus mengandung semua unsur hara yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan
perkembangan mikroorganisme.
2. Mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme.
3. Dalam keadaan steril, artinya sebelum diinokulasi mikroorganisme yang dimaksud tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme yang tidak diinginkan.
III.Cara Kerja
Sebelum dilakukan percobaan ini, meja disterilisasi menggunakan etanol 70 %. Kemudian, api Bunsen dinyalakan dan diatur berwarna biru.
3.1 Penyiapan Media Padat dalam Cawan Petri
Cawan petri kosong steril disiapkan beserta tabung reaksi steril berisi 10 mL media padat steril dan diletakkan di dekat api Bunsen. Cawan petri dibuka dari pembungkus dalam keadaan bagian bawah dan atas cawan masih tertutup.
Satu tabung reaksi berisi media padat diambil dan dibuka tutupnya (sebaiknya dicek dulu suhunya). Mulut tabung segera dipanaskan di api Bunsen, tutup cawan petri dibuka (di dekat api). Isi tabung reaksi dituang ke cawan petri dan segera ditutup kembali. Teknik ini diulang untuk pasangan cawan petri kosong dan media padat dalam tabung lain. Pengujian teknik aseptik ini yaitu cawan petri diinkubasi pada 37 oC selama ± 24 jam. Setelah itu, pertumbuhan mikroorganisme diamati.
Tutup tabung reaksi berisi kultur murni dibuka dan mulut tabung dipanaskan. Jarum ose diambil dan dipanaskan hingga membara, didinginkan sesaat pada media padat dalam cawan petri. Kultur diambil dengan jarum ose, mulut tabung dipanaskan dan segera ditutup. Tabung diltekakan kembali pada rak, tabung agar miring diambil. Tutup tabung dibuka, mulut tabung dipanaskan dan ujung ose segera digesekkan di atas agar dari bagian dasar tabung ke mulut tabung. Mulut tabung dipanaskan dan ditutup kembali. Pengerjaan diulang untuk media agar miring lainnya. Tabung diinkubasi pada 37 oC, diamati keesokan harinya.
3.3 Penggunaan Batang L
Media padat dalam cawan petri disiapkan beserta pipet ukur, filler cuplikan air, 50 mL etanol 70 %, dan batang L. Media padat, pipet ukur, dan cuplikan air diatur berada di sebelah kiri api Bunsen, sedangkan filler, etanol, dan batang L di kanan api Bunsen.
Pembungkus pipet ukur bagian pangkal dibuka dan disambungkan dengan filler. Mulut tabung berisi cuplikan air dipanaskan, dipipet sebanyak 0,1 mL air, mulut tabung dipanaskan, segera ditutup dan diletakkan pada rak. Cawan petri diambil dan dibuka tutupnya, cairan dari pipet dipindahkan ke cawan petri dan segera ditutup. Pipet diletakkan ke wadah habis pakai berisi desinfektan. Batang L diambil dan dicelupkan bagian pendeknya ke dalam etanol, dilewatkan di api untuk menghilangkan alcohol, didinginkan sesaat. Batang L digesekkan di atas cuplikan air sambil memutar petri searah jarum jam agar cuplikan merata. Cawan petri diinkubasi pada 37 oC, keesokan harinya diamati pertumbuhan mikroba.
IV. Data Pengamatan
4.1 Penyiapan Media Padat dalam Cawan Petri
Gambar 4.1.a. Media padat dalam cawan petri
Metode Pengamatan
Penyiapan media padat dalam cawan petri
Pada media padat tidak ditemukan koloni bakteri, tetapi ada koloni jamur.
Gambar 4.2.b. Koloni Bacillus megaterium pada media padat
Metode Tempat Pengamatan
Streak Method
Tabung reaksi (agar miring)
Koloni Bacillus megaterium yang terbentuk sesuai dengan jalur streak. Tidak teramati adanya
kontaminan/
mikroorganisme lain.
Cawan petri Koloni Bacillus megaterium yang terbentuk sesuai jalur streak pada 4 kuadran. Tidak teramati adanya kontaminan mikroorganisme lain. Kuadran 3 dan 4
kurang jelas jalur streak-nya.
Gambar 4.3.a. Hasil metode spread air kran pada media padat
Metode Sampel Pengamatan
Spread Method Air Keran Teramati koloni dari mikroorganisme berbentuk lingkaran berwarna putih. Jumlahnya tidak terlalu banyak karena terlihat dari titik-titik putih pada agar yang sedikit.
V. Pembahasan
Pada praktikum ini dilakukan beberapa percobaan untuk mengenal teknik dasar mikrobiologi ialah metode aseptik. Percobaan – percobaan tersebut yaitu penyiapan media padat pada cawan petri, streak method dengan jarum ose, dan spread method dengan batang L.
Pada percobaan digunakan Bacillus megaterium adalah virgate gram-positif yang digunakan sebagai inokulan tanah di bidang pertanian dan hortikultura. Bacillus megaterium adalah bakteri berbentuk batang dan salah satu Eubacteria terbesar ditemukan di dalam tanah. Bacillus megaterium mampu bertahan dalam beberapa kondisi ekstrim seperti lingkungan gurun karena membentuk spora.Bakteri ini berbentuk streptobasil. Bacillus megaterium menghasilkan enzim penisilin amidase yang digunakan untuk membuat penisilin. Bakteri ini juga memiliki enzim untuk memodifikasi kortikosteroid, serta beberapa enzim dehydrogenase untuk asam-asam amino.
Metode streak dilakukan dengan menggunakan jarum ose dan menggoreskan kultur murni dengan pola tertentu sehingga dapat ditentukan keberhasilannya dengan melihat koloni yang tumbuh di luar jalur goresan. Metode spread dilakukan dengan menggunakan batang L untuk meratakan sampel air pada
Pada percobaan ini digunakan pembakar bunsen sebagai media pemanasan karena panas dari bunsen dapat menyebabkan mikroorganisme mengalami koagulasi protein. Selain itu, nyala Bunsen cenderung lebih stabil dan mudah diatur tingkat panasnya dibandingkan pembakar spiritus.
Etanol teknis 70% merupakan senyawa digunakan dalam metode aseptik karena sifat toksisitasnya rendah untuk manusia, tetapi dapat melisis dinding sel dan membran sel mikroorganisme. Kadar etanol 70% dipilih karena kadar tersebut optimum untuk sterilisasi dan tidak mudah menguap.
The Agar LB (Luria Bertani, Miller) merupakan media kaya nutrisi yang digunakan untuk memelihara dan menumbuhkan strain rekombinan Escherichia coli. Media menyediakan semua kebutuhan gizi dari mikroorganisme yang telah diturunkan dari coli, Escherichia K12 yang kekurangan produksi vitamin B. Escherichia coli tumbuh lebih cepat pada media ini daripada media konvensional, karena media ini menyediakan asam amino, prekursor nukleotida, vitamin dan metabolit lain.
Media dapat digolongkan berdasarkan bentuk, susunan kimia, dan fungsinya. Berdasarkan bentuk atau konsistensinya, media terdiri atas:
1. Media padat (solid medium/ media NA), tidak mengandung agen cair.
2. Media cair (liquid medium/ media Broth ).
3. Media semi padat (semi solid medium), medium cair yang ditambahkan agar solid.
Berdasarkan susunan bahan kimianya, media dapat digolongkan menjadi:
1. Media sintetik/ media siap saji, adalah media yang dibuat dari bahan-bahan yang susunan kimianya diketahui dengan pasti. Media ini diproduksi dan dibuat oleh pabrik/ industri seperti: Difco, oxoid, dan merck.
2. Media non sintetik/ media alami yang dibuat dari bahan-bahan yang susunan kimianya belum diketahui secara pasti, seperti: daging, kentang, tauge, dan lain-lain.
1. Media pengaya, ialah media yang ditambahkan zat-zat tertentu (serum, darah, ekstrak tumbuhan) sehingga dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof tertentu. Contoh: media buatan loeffler ditambah serum (memiara basil difteri), media ditambah air tomat untuk menumbuhkan Lactobacillus.
2. Media khusus, adalah media untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan kemampuannya untuk mengadakan perubahan kimia tertentu.
3. Media penguji, adalah media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian vitamin, asam amino, antibiotik, dan sebagainya .
4. Media selekif, adalah media yang ditambahan zat-zat tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain. Contohnya kristal violet menumbuhkan bakteri gram negatif saja, sehingga menghambat pertumbuhan bakteri gram positif.
5. Media differensial, adalah media yang ditambahkan zat kimia tertentu sehingga suatu mikroba membentuk pertumbuhan tertentu dan dapat dibedakan tipe-tipenya.
6. Media perhitungan mikroba, adalah media yang spesifik untuk perhitungan jumlah mikroba.
Pada percobaan ini digunakan media NB (nutrient broth) yang mengandung unsur C, N, dan mineral yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Media NB merupakan tipe media pengaya. Untuk menambah keselektifan media ialah menggunakan antibiotik maupun asam amino tertentu yang hanya cocok untuk jenis mikroorganisme tertentu. Pada percobaan juga digunakan media agar dalam bentuk agar miring dan media dalam cawan petri. Agar miring lebih tahan lama daripada media padat dalam cawan petri. Agar miring bisa dipakai hingga skala bulanan, sedangkan media agar padat dalam cawan petri hanya digunakan
dari koloninya. Koloni dari Bacillus megaterium berbentuk melingkar dan berwarna putih. Percobaan kali ini penyiapan media kosong tak terlihat adanya titik-titik koloni bakteri namun terdapat koloni jamur yang tumbuh. Hal ini disebabkan pengerjaan yang kurang steril sehingga muncul kontaminan tersebut. Hasil metode streak pada agar miring dan cawan petri menunjukkan adanya koloni berwarna putih di sepanjang jalur streak saja. Jalur koloni terlihat jelas pada kuadran 1 dan 2 karena jumlah koloninya masih banyak. Pada kuadran 3 dan 4, jalur koloni kurang jelas karena banyak bakteri yang mati. Pada hasil metode spread, dari sampel air kran terlihat adanya titik-titik putih yang menunjukkan koloni bakteri. Hal ini menunjukkan air kran tersebut mengandung koloni bakteri tertentu.
Seusai percobaan, destruksi terhadap media dilakukan sebelum dibuang karena bakteri yang digunakan adalah hasil dari proses rekayasa sehingga dikhawatirkan apabila dilepas ke lingkungan akan terjadi polusi genetik pada mikroorganisme yang bersangkutan. Destruksi agar dilakukan dengan memanaskannya bersamaan dengan desinfektan hingga mencair. Peralatan direndam terlebi dulu beberapa saat dengan desinfektan sebelum dilakukan pencucian.
VI. Simpulan
Berdasarkan hasil percobaan dapat ditarik simpulan bahwa pada penyiapan media kosong tidak terbentuk koloni bakteri setelah inkubasi, namun terbentuk koloni jamur. Pada metode streak (agar miring dan cawan petri), koloni hanya muncul pada jalur streak setelah diinkubasi. Pada metode spread dengan sampel air kran menunjukkan adanya koloni bakteri berbentuk lingkaran berwarna putih setelah inkubasi.
VII. Daftar Pustaka
http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3031-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-protocol, diakses pada 20 Februari 2013 pukul 01:32 WIB.
