LAPORAN AKHIR
PRAKTIKUM HEMATOLOGI
OLEH :
MAHASISWA SEMESTER IV
POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR
JURUSAN ANALIS KESEHATAN
PEMBUATAN DAN PEWARNAAN
SEDIAAN HAPUSAN DARAH
Hari, tanggal : Senin, 14 & 21 Maret 2016
Tempat praktikum : Laboratorium Hematologi JAK Poltekkes Denpasar
I. TUJUAN
a. Tujuan Umum
- Mahasiswa dapat mengetahui cara pembuatan dan pewarnaan sediaan hapusan darah.
b. Tujuan Khusus
- Mahasiswa dapat membuat sediaan hapusan darah.
- Mahasiswa dapat melakukan pewarnaan sediaan hapusan darah.
II. METODE
Metode yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah metode hapusan darah (Blood Smear).
III. PRINSIP
Darah + antikoagulan diteteskan pada objek glass dan dibuat hapusan menyerupai lidah, kemudian sediaan diwarnai dengan warna Giemsa atau Wright lalu dibaca pada mikroskop.
IV. DASAR TEORI
4.1 Darah
Darah adalah jaringan cair yang terdiri atas dua bagian yaitu plasma darah dan sel darah. Sekitar 55% adalah plasma darah, sedangkan 45% sisanya terdiri dari sel darah. Volume darah secara keseluruhan adalah satu per dua belas berat badan atau kira-kira lima liter (Dwijastuti, Sri.2015).
Darah tersusun dari beberapa komponen yaitu sel darah, plasma darah, dan serum.
1. Sel darah, terdiri dari :
Eritrosit berbentuk bulat gepeng dengan permukaan gepeng (bikonkaf) dan tidak berinti. Eritrosit mengandung hemoglobin yang berfungsi sebagai pengikat O2 dan sebagai
pemberi warna merah pada darah. b. Sel darah putih (leukosit)
Leukosit memiliki bentuk yang tidak tetap (ameboid), tidak berwarna dan memiliki inti. Fungsi sel darah putih untuk melindungi tubuh dari infeksi. Leukosit terdiri dari sel yang bergranula (eosinofil, basofil, neutrofil) dan sel tidak bergranula (monosit, linfosit)
c. Keping darah (trombosit)
Bentuk keping darah tidak tetap. Trombosit berfungsi dalam proses pembekuan darah dengan membentuk benang fibrin yang akan menutup luka sehingga perdarahan akan terhenti.
(Susilo, Reki Usman. 2014) 2. Plasma darah
Plasma darah merupakan bagian cair darah. Cairan ini didapat dengan membuat darah tidak beku dan sel darah tersentrifugasi. Plasma terdiri dari 90% air, 7-8% protein,dan di dalam plasma terkandung pula beberapa komponen lain seperti garam-garam, karbohidrat, lipid, dan asam amino. Pada pemeriksaan plasma, digunakan darah yang mengandung EDTA dan sebaiknya dilakukan segera. Penyimpanan darah EDTA dalam waktu yang terlalu lama dapat menyebabkan terjadinya hemolisis, sehingga hemoglobin lepas ke dalam medium sekelilingnya (plasma).
3. Serum
Serum adalah komponen yang bukan berupa sel darah, juga bukan faktor koagulasi, serum adalah plasma darah tanpa fibrinogen. Serum terdiri dari semua protein (yang tidak digunakan untuk pembekuan darah) termasuk cairan elektrolit, antibodi, antigen, hormon, dan semua substansi exogenous. Serum merupakan salah satu bentuk protein. Protein memiliki molekul yang cukup besar.
Jika darah didiamkan dalam waktu yang cukup lama atau dapat diputar dengan sentrifuge, maka zat protein tersebut akan mengendap, sisa berupa cairan bening/jernih yang disebut serum.
(Susilo, Reki Usman. 2014). IV.2 Sediaan Hapusan Darah
Untuk melihat struktur sel-sel darah dengan mikroskop cahaya pada umumnya dibuat sediaan apus darah. Sediaan apus darah tepi adalah suatu cara yang sampai saat ini masih digunakan pada pemeriksaan di laboratorium. Prinsip pemeriksaan sediaan apus ini adalah dengan meneteskan darah lalu dipaparkan di atas objek glass, kemudian dilakukan pengecatan dan diperiksa dibawah mikroskop (Anonim. 2011)
Guna pemeriksaan apusan darah:
1. Evaluasi morfologi dari sel darah tepi (eritrosit, trombosit, dan leukosit)
2. Memperkirakan jumlah leukosit dan trombosit
3. Identifikasi parasit (misal : malaria. Microfilaria, dan
Trypanosoma)
(Anonim. 2011) IV.3 Jenis apusan darah :
Terdapat 2 jenis sediaan hapusan darah, yaitu sediaan hapusan darah tipis dan sediaan hapusan darah tebal.
1. Sediaan darah tipis
Ciri- ciri apusan sediaan darah tipis yaitu lebih sedikit membutuhkan darah untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tebal morfologinya lebih jelas. bentuk parasit plasmodium berada dalam eritrosit sehingga didapatkan bentuk parasit yang utuh dan morfologinya sempurna. Serta lebih mudah untuk menentukan spesies dan stadium parasit dan perubahan pada eritrosit yang dihinggapi parasit dapat dilihat jelas.
2. Sediaan darah tebal
Ciri- ciri apusan sediaan darah tebal yaitu membutuhkan darah lebih banyak untuk pemeriksaan dibanding dengan apusan darah tipis, sehingga jumlah parasit yang ditemukan lebih banyak dalam satu lapang pandang, sehingga pada infeksi ringan lebih mudah ditemukan. Sediaan ini mempunyai bentuk parasit yang kurang utuh dan kurang begitu lengkap morfologinya.
IV.4 Pewarnaan Sediaan Hapusan Darah
Pewarnaan darah apus merupakan pewaraan yang terwarnai pada preparat darah apus tepi, misalnya dengan menggunakan pewarnaan menurut Romanowsky ada empat macam pewarnaan preparat darah apus yaitu pewarnaan wright’s stain, pewarnaan lieshman, pewarnaan may grunwald, pewarnaan giemsa (Anonim.2012)
Pewarnaan preparat darah apus yang sering digunakan untuk melakukan pengecatan preparat darah apus kebanyakan menggunakan metode pewarnaan Romanowsky diantaranya :
a. Pewarnaan Giemsa
Pewarna Giemsa 10% sebagai pewarna yang umum digunakan agar sediaan terlihat lebih jelas. Pewarnaan ini sering disebut juga pewarnaan Romanowski. Metode pewarnaan ini banyak dipakai untuk mempelajari morfologi darah, sel-sel sumsum dan juga untuk identifikasi parasit-parasit darah misalnya dari jenis protozoa. Zat ini tersedia dalam bentuk serbuk atau larutan yang disimpan di dalam botol yang gelap (Anonim.2011)
b. Pewarnaan wright
Pewarnaan wright adalah zat warna yang digunakan dalam metode Romanowsky, merupakan campuran eosin Y, Azure B, metilen blue, dan metal alkohol dalam konsentrasi tinggi. Sediaan apus yang telah dikeringkan diudara, tidak perlu mengadakan fiksasi tersendiri, karena telah mengandung metil alkohol dalam konsentrasi tinggi dan di cat wright langsung ditambah penyanggah pH 6,4 sama banyak dan membiarkan selama 15- 20 menit. Preparat apus yang yang telah selesai dibuat kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x (Anonim.2012)
V. ALAT, BAHAN, DAN REAGEN
a. Alat
Rak pewarna Botol semprot Ball Pipet
Pipet ukut Stop watch
b. Bahan
- Sampel darah EDTA - Tissue - Buffer Phospfat pH 7,0 - Giemsa pekat - Methanol p.a - Alkohol 70% - Aquadest
VI. CARA KERJA
a. Pembuatan Sediaan Hapusan Darah
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan dan dipastikan alat dan bahan dalam keadaan siap.
2. Diteteskan sampel darah pada objek glass
3. Diratakan sampel darah dengan bantuan objek glass yang lain. 4. Didorong objek glass ke depan dengan membentuk sudut 30-400
5. Dikering anginkan sediaan yang telah dibuat. b. Pewarnaan Sediaan Hapusan Darah
1. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan 2. Diletakkan sediaan darah pada rak pewarnaan. 3. Diteteskan methanol selama 5 menit pada sediaan.
4. Diteteskan sediaan dengan giemsa yang sebelumnya telah diencerkan dengan buffer phosfat (1:4).
5. Didiamkan larutan pewarna pada sediaan selama 30 menit. 6. Dibilas sediaan yang diwarnai dengan aquadest.
7. Dikering anginkan sediaan. - Pewarnaan dengan Wright
1. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan 2. Diletakkan sediaan darah pada rak pewarnaan. 3. Diteteskan methanol selama 5 menit pada sediaan.
4. Diteteskan Wright sebanyak 20 tetes dan didiamkan selama 2 menit.
5. Diteteskan buffer hingga menutupi seluruh hapusan. 6. Didiamkan buffer selama 20 menit
7. Dicuci dengan air yang mengalir.
VII. HASIL PENGAMATAN
Gb.1 Proses penetesan darah di atas objek glass
Gb. 2 Dihapuskan darah dengan bantuan objek glass lain
Gb. 3 Didorong objek glass ke depan
G
Gb. 5 Sediaan hapusan darah tipis menggunakan pewarnaan Giemsa.
VIII. PEMBAHASAN
Darah adalah jaringan cair yang terdiri atas dua bagian yaitu plasma darah dan sel darah. Sekitar 55% adalah plasma darah, sedangkan 45% sisanya terdiri dari sel darah (Dwijastuti, Sri.2015). Untuk melihat struktur sel-sel darah dengan mikroskop cahaya pada umumnya dibuat sediaan hapusan darah. Prinsip pemeriksaan sediaan hapusan darah ini adalah dengan meneteskan darah lalu dipaparkan di atas objek glass, kemudian dilakukan pengecatan dan diperiksa dibawah mikroskop (Anonim. 2011).
Terdapat 2 jenis sediaan hapusan darah, yaitu sediaan hapusan darah tipis dan sediaan hapusan darah tebal. Pada praktikum kali ini, dilakukan pembuatan sediaan hapusan darah tipis. Mula-mula, disiapkan alat dan bahan terlebih dahulu, dan dipastikan dalam keadaan siap digunakan. Darah yang digunakan dalam praktikum ini adalah darah dengan antikoagulan EDTA. Pertama-tama, dibersihkan terlebih dahulu objek glass yang akan digunakan untuk membuat sediaan hapusan darah tepi. Hal ini berfungsi untuk menghilangkan lemak-lemak yang menempel pada objek glass agar tidak mengganggu saat proses pengamatan hapusan. Setelah itu, diteteskan darah ke atas objek glass dengan menggunakan pipet tetes. Kemudian objek glass atau kaca penutup yang lain disentuhkan ke tetesan darah hingga darah melebar. Selanjutnya dengan membentuk sudut 30-400,
digerakkan objek glass atau kaca penutup ke depan membentuk hapusan darah yang tidak terlalu tipis ataupun terlalu tebal, karena jika terlalu tebal maka saat pengamatan di bawah mikroskop akan terlihat kurang jelas karena sel darah bertumpuk.
a. Sediaan tidak melebar sampai tepi kaca objek glas, panjang ½ sampai 2/3 panjang kaca.
b. Mempunyai bagian yang cukup tipis untuk diperiksa, pada bangian itu eritrosit tersebar rata berdekatan dan tidak saling bertumpukan
c. Pinggir sediaan rata, tidak berlubang-lubang atau bergaris-garis.
d. Penebalan eritrosit yang baik tidak berkumpul pada pinggir atau ujung sedimen (Anonim.2012) Sediaan hapusan darah tepi dapat digunakan untuk berbagai macam pemeriksaan, misalnya evaluasi morfologi dari sel darah tepi (eritrosit, trombosit, dan leukosit), memperkirakan jumlah leukosit dan trombosit, maupun identifikasi parasit (misal : malaria. Microfilaria, dan Trypanosoma) (Anonim. 2011).
Setelah mendapat sediaan yang bagus (tidak tebal dan tipis), maka sediaan hapusan darah dibiarkan kering dalam suhu ruang. Setelah itu, dilakukan proses pewarnaan. Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan Giemsa dan Wright pada sediaan hapusan darah. Pada pewarnaan Giemsa, mula-mula diteteskan methanol ke atas sediaan hingga bagian yang terlapisi darah tertutup semuanya. Fungsi methanol adalah untuk memfiksasi darah sehingga darah tetap menempel pada objek glass sehingga tidak hilang saat diamati. Fiksasi juga berfungsi untuk mempertahankan struktur dari sel darah agar tetap normal. Proses fiksasi ini dilakukan selama 5 menit. Selanjutnya sediaan diteteskan dengan larutan giemsa yang sebelumnya telah diencerkan dengan buffer pH 7 dengan perbandingan 1:4, dimana 1 mL Giemsa dilarutkan dalam 4 mL buffer pH 7. Fungsi giemsa adalah untuk mewarnai darah sehingga mudah dibedakan dan dapat terlihat jelas saat diamati. Waktu perendaman ini sebaiknya jangan terlalu lama karena darah bisa tidak terlihat akibat pewarnaan yang terlalu pekat.
Sedangkan dalam pewarnaan Wright, mula-mula sediaan hapusan darah difiksasi dengan methanol selama 5 menit pada sediaan. Sebenarnya, fiksasi tidak perlu dilakukan karena dalam larutan Wright sudah terdapat metil alkohol dalam konsentrasi tinggi. Kemudian diteteskan Wright sebanyak 20 tetes dan didiamkan selama 2 menit. Setelah itu diteteskan buffer pH 7 hingga menutupi seluruh hapusan dan dibiarkan selama 20 menit lalu dibersihkan cat warna dengan air yang mengalir.
Berdasarkan penelitian perbedaan hasil pewarnaan giemsa dan wright terhadap morfologi eritrosit dan kualitas cat pada preparat darah apus didapatkan
hasil bahwa cat giemsa memiliki kualitas pewarnaan lebih baik dibandingkan cat wright. Baik pewarnaan giemsa maupun wright keduanya tidak mempengaruhi morfologi eritrosit pada preparat darah apus (Carascallo, Maryo Vegas.2013)
Dalam praktikum ini, terdapat beberapa kesalahan dalam pembuatan sediaan hapusan darah. Diantaranya adalah darah yang diteteskan terlalu banyak sehingga sediaan hapusan darah menjadi terlalu tebal sehingga sel-sel eritrosit menutupi satu sama lain sehingga mempersulit proses pengamatan. Selain itu, saat mendorong atau spreading, praktikan sering ragu-ragu sehingga terbentuk sediaan yang bergaris-garis, berlubang, dan terkadang terdapat ekor pada bagian ujung hapusa. Hal ini disebabkan oleh kurangnya latihan dan teknik yang dimiliki oleh praktikan.
Terdapat beberapa hal yang harus diperhatikan dalam mengencerkan Giemsa, dimana dari air pengencer yang digunakan harus jernih dan tidak berbau. Selain itu, derajat keasaman pengencer hendaknya berada 6,8 - 7,2 perubahan, hal ini berguna karena pH pada larutan giemsa berpengaruh pada sel-sel darah. Dalam praktikum kali ini digunakan buffer pH 7 untuk mengencerkan Giemsa.
IX. SIMPULAN
Berdasarkan praktikum mengenai pembuatan dan pewarnaan sediaan hapusan darah, dapat ditarik simpulan sebagai berikut:
1. Pembuatan sediaan hapusan darah dapat dilakukan dengan cara meneteskan darah ke atas objek glass kemudian objek glass yang lain disentuhkan ke tetesan darah hingga darah melebar lalu digerakkan objek glass atau kaca penutup ke depan membentuk hapusan darah yang baik. 2. Pewarnaan sediaan hapusan darah tepi yang sering dilakukan adalah
dengan pewarnaan Giemsa dan Wright. Pewarnaan ini berfungsi dalam evaluasi morfologi dari sel darah tepi, memperkirakan jumlah leukosit dan trombosit, dan untuk identifikasi parasit.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2012. METODE PEMBUATAN HAPUSAN DAN PENGECATAN
PREPARAT MALARIA (BLOOD SMEAR). [online]. Tersedia:
http://habibi.staff.ub.ac.id/files/2012/11/blood-smear.pdf. [Diakses: 27 Maret 2016; 13.32 WITA]
Anonim.2011. BAB II TINJAUAN PUSTAKA [online]. Tersedia: http://digilib.unimus.ac.id/download.php?id=12611. [Diakses: 27 Maret 2016; 13.42 WITA]
Anonim.2011. BAB II TINJAUAN PUSTAKA.[online]. Tersedia: http://digilib.unimus.ac.id/download.php?id=11251. [Diakses: 27 Maret 2016; 13.55 WITA]
Carascallo, Maryo Vegas.2013. Perbedaan Hasil Pewarnaan Giemsa dan Wright
terhadap Morfologi Eritrosit dan Kualitas Cat pada Preparat Darah Apus.
[online].Tersedia: http://digilib.unimus.ac.id/gdl.php? mod=browse&op=read&id=jtptunimus-gdl-maryovegas-6908. [Diakses: 27 Maret 2016; 15.40 WITA].
Dwijastuti, Sri.2015.Preparasi Sampel Darah dan Urin.[online].Tersedia : http://dokumen.tips/documents/preparasi-sampel-darah-dan-urine.html. (diakses : 8 Maret 2016. 09:30 wita)
LEMBAR PENGESAHAN Pembimbing II (Rini Riowati, B.Sc.) Mengetahui, Pembimbing I (Dr. dr. Sainny Herawati, Sp. PK) Pembimbing III
(I Ketut Adi Santika, A.Md. A.K.)
Pembimbing IV
(Luh Putu Rinawati, S.Si.)
Pembimbing V
