PENDAHULUAN PENDAHULUAN
Darah adalah cairan tubuh yang bersirkulasi melalui arteri dan vena, Darah adalah cairan tubuh yang bersirkulasi melalui arteri dan vena, memasok jaringan dengan oksigen, dan menghilangkan karbon dioksida untuk memasok jaringan dengan oksigen, dan menghilangkan karbon dioksida untuk dibuang. Hal ini juga bertanggung jawab untuk memberikan nutrisi ke jaringan. dibuang. Hal ini juga bertanggung jawab untuk memberikan nutrisi ke jaringan. Darah dari donor atau sampel dapat dipisahkan menjadi komponen yang berbeda: Darah dari donor atau sampel dapat dipisahkan menjadi komponen yang berbeda: protein,
protein, sel sel darah darah merah, merah, sel sel darah darah putih, putih, faktor faktor pembekuan, pembekuan, dll, dll, dan dan digunakandigunakan untuk tujuan masing-masing. Demikian pula, plasma dan serum diperoleh dari untuk tujuan masing-masing. Demikian pula, plasma dan serum diperoleh dari darah dengan sentrifugasi, yang sebelumnya koagulasi dan lainnya, setelah darah darah dengan sentrifugasi, yang sebelumnya koagulasi dan lainnya, setelah darah telah benar-benar beku. Perbedaan utama antara plasma dan serum terletak pada telah benar-benar beku. Perbedaan utama antara plasma dan serum terletak pada faktor pembekuan mereka (Koolman 2005).
faktor pembekuan mereka (Koolman 2005). Zat yang
Zat yang membedakat serum membedakat serum dan plasma dan plasma adalah fibrinogenadalah fibrinogen. Zat . Zat sangatsangat penting dalam
penting dalam pembekuan darah. pembekuan darah. Plasma Plasma darah mdarah mengandung fibrinogen engandung fibrinogen ini. ini. PadaPada dasarnya, ketika serum dan plasma dipisahkan dari darah, plasma masih dasarnya, ketika serum dan plasma dipisahkan dari darah, plasma masih mempertahankan fibrinogen yang membantu dalam pembekuan sementara serum mempertahankan fibrinogen yang membantu dalam pembekuan sementara serum adalah bagian dari darah yang tersisa setelah fibrinogen ini dihilangkan. Serum adalah bagian dari darah yang tersisa setelah fibrinogen ini dihilangkan. Serum sendiri mengandung protein (kecuali fibrinogen), mineral darah, dan zat zat lain sendiri mengandung protein (kecuali fibrinogen), mineral darah, dan zat zat lain yang tidak ada didalam plasma darah (Campbell et al
yang tidak ada didalam plasma darah (Campbell et al 2003).2003).
Mineral mineral yang ada didalam darah yang paling banyak adalah Mineral mineral yang ada didalam darah yang paling banyak adalah fosfor. Fumgsi fosfor adalah untuk fungsi otot dan sel-sel darah merah, fosfor. Fumgsi fosfor adalah untuk fungsi otot dan sel-sel darah merah, pembentukan
pembentukan adenosine adenosine trifosfat trifosfat (ATP) (ATP) dan dan 2,3-difosfogliserat 2,3-difosfogliserat (DPG), (DPG), dandan pemeliharaan
pemeliharaan keseimbangan keseimbangan asam-basa, asam-basa, juga juga untuk untuk sistem sistem saraf saraf dan dan perantaraperantara metabolisme karbohidrat, protein, dan lemak. Kadar normal serum fosfor berkisar metabolisme karbohidrat, protein, dan lemak. Kadar normal serum fosfor berkisar 2,5 dan 4,5 mg/dl dan dapat setinggi 6 mg/dl pada bayi dan anak-anak. Fosfor 2,5 dan 4,5 mg/dl dan dapat setinggi 6 mg/dl pada bayi dan anak-anak. Fosfor merupakan anion utama dalam cairan intraseluler. Sekitar 85% fosfor terletak merupakan anion utama dalam cairan intraseluler. Sekitar 85% fosfor terletak dalam tulang dan gigi, 14% dalam jaringan lunak, dan kurang dari 1% dalam dalam tulang dan gigi, 14% dalam jaringan lunak, dan kurang dari 1% dalam cairan ekstraseluler (Mima M dan Horne 2001).
cairan ekstraseluler (Mima M dan Horne 2001). Metode yang
Metode yang digunakan ddigunakan dalam alam Metode Fardiaz. Metode Fardiaz. Prinsip penetapan Prinsip penetapan kadarkadar fosfor yaitu dengan mereaksikan bahan atau sampel dengan asam sitrat untuk fosfor yaitu dengan mereaksikan bahan atau sampel dengan asam sitrat untuk mengubah semua metafosfat dan pirofosfat menjadi ortofosfat, yang kemudian mengubah semua metafosfat dan pirofosfat menjadi ortofosfat, yang kemudian diperlakukan dengan asam molibdat dan asam vanadat sehingga ortofosfat akan diperlakukan dengan asam molibdat dan asam vanadat sehingga ortofosfat akan bereaksi
bereaksi dengan dengan asam asam molibdat molibdat dan dan asam asam vanadat vanadat dan dan melalui melalui reaksireaksi kompleksometri akan terbentuk kompleks asam vanadimolibdifosfat yang kompleksometri akan terbentuk kompleks asam vanadimolibdifosfat yang berwarna
berwarna kuning kuning orange. orange. Setelah Setelah itu, itu, sampel sampel yang yang telah telah direaksikan direaksikan diukur diukur nilainilai serapan cahaya atau absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada serapan cahaya atau absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
panjang gelombang gelombang 420 420 nm nm dan dan dibandingkan dibandingkan dengan dengan standar standar fosfor fosfor yang yang telahtelah diketahui konsentrasinya, sehingga kadar fosfor pada bahan tersebut dapat diketahui konsentrasinya, sehingga kadar fosfor pada bahan tersebut dapat diketahui (Rahmalisa
diketahui (Rahmalisa et alet al 2014).2014). Pereaksi
Pereaksi Vanadat-Molibdat Vanadat-Molibdat merupakan hasil merupakan hasil pelarutan pelarutan antara antara amoniumamonium vanadat, amonium molibdat, asam nitrat pekat, dan air suling. Pencampuran vanadat, amonium molibdat, asam nitrat pekat, dan air suling. Pencampuran pereaksi
pereaksi vanadat dan vanadat dan molibdat molibdat harus harus dilakukan beberapa dilakukan beberapa hari hari sebelum sebelum digunakandigunakan karena cenderung mengendap. Bahan bahan organik yang turut tercampur harus karena cenderung mengendap. Bahan bahan organik yang turut tercampur harus terlebih dahulu dihilangkan agar tidak mengganggu warna yang dihasilkan terlebih dahulu dihilangkan agar tidak mengganggu warna yang dihasilkan menggunakan
menggunakan pereaksi pereaksi pengoksidasi. pengoksidasi. Penggunaan pereaksi Penggunaan pereaksi vanadat vanadat molibdatmolibdat bertujuan
bertujuan agar agar terbentuk terbentuk kompleks kompleks asam asam vanadimolibdifosfat vanadimolibdifosfat yang yang berwarnaberwarna kuning orange, sehingga dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang kuning orange, sehingga dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm.Asam sitrat berfungsi untuk mengubah warna larutan gelombang 400 nm.Asam sitrat berfungsi untuk mengubah warna larutan ortofosfat yang terbentuk menjadi kuning orange dan membentuk kompleks asam ortofosfat yang terbentuk menjadi kuning orange dan membentuk kompleks asam vanadimolibdifosfat. Intensitas warna yang terbentuk inilah yang dapat digunakan vanadimolibdifosfat. Intensitas warna yang terbentuk inilah yang dapat digunakan
untuk menetapkan kadar fosfor. Kelebihan dari metode ini adalah ketepatan dan ketelitian sangat tetinggi, tetapi mempunyai kelemahan metode ini sangat memakan waktu dan biaya (Rahmalisa et al 2014).
Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mengerti prinsip biokimia yang digunakan pada analisis kalsium darah. Mahasiswa dapat meakukan analisis kalsium darah. Selain itu, agar mahasiswa mengetahui manfaat analisis darah untuk mengetahui keadaan fungsi tubuh
METODE PRAKTIKUM Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum dilakukan pada hari Selasa, 3 Maret 2015 pukul 08.00 – 11.00 WIB di Laboratorium Pendidikan Departemen Biokimia IPB.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah larutan fosofr standar dengan berbagai konsentrasi, serum darah, larutan molibdovandat dan satu bagian volume HCl 5 M, TCA 5 %, serta akuades. Peralatan yang digunakan dalam percobaan ini adalah Pipet mikro, mikroplate, Sentrifuge, nano spektrofotometer.
Prosedur Penelitian
Reagen campuran yang terdiri dari satu bagian volume larutan molibdovanadat dan satu bagian HCl 5 M, larutan fosfor standar dalam beberapa konsentrasi dari 0- 120 mikrogram per mg. Sebanyak 1 mL serum ditambahkan dengan 4 mL TCA 5% kemudian divortex selama 15 menit untuk diambil supernatannya sebanyak 2 mL. Kemudian takaran,blanko, standar serta sampel diatur dengan ketentuan sebagai berikut :
Filtrat terdiri dari 2 mL sampel dan 6 mL akuades. Standar terdiri dari 2 mL larutan fosfor dan 6mL akuades. Blanko terdiri dari 8 mL akuades. Ketiga perlakuan diberikan persamaan perlakuan yaitu dengan menambahkan reagen
campuran sebanyak 2 mL setelah pengocokan. Kemudian seluruh rangkaian perlakuan diuji serapannya pada panjang gelombang 400 nm.
HASIL DAN PEMBAHASA
Prinsip penentuan kadar fosfor dengan spektrofotometer adalah berdasarkan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa konsentrasi larutan standar berbanding langsung dengan nilai serapan cahaya (absorban). Penggunaan pereaksi vanadat molibdat bertujuan agar terbentuk kompleks asam
vanadimolibdifosfat yang berwarna kuning orange, sehingga dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm (Bintang 2010).
Senyawa kompleks tersebut dihasilkan melalui reaksi kompleksometri, yaitu reaksi ortofosfat darah dengan vanadat-molibdat. Penambahan asam klorida bertujuan untuk membentuk suasana asam sehingga reaksi pembentukan warna kuning cepat terjadi. Penambahan TCA bertujuan mengendapkan protein agar fosfat dapat larut terpisahkan ketika disentrifugasi (Rahmalisa et al 2014).
Penentuan kadar fosfor berdasarkan reaksi antara fosfor yang terkandung dalam serum dengan molibdovanadat dan HCl sehingga menimbulkan kompleks warna yang diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm. Hasil pengukuran absorbansi dapat dilihat pada Tabel 1 dan 2.
Tabel 1 Pengukuran absorbansi larutan fosfat pada panjang gelombang 400 nm No Sampel Absorbansi Terbaca (A) Absorbansi Koreksi (A)
1 Blanko 0.666 0,000 2 Standar 1 (20 µg/mL) 1.360 0.694 3 Standar 2 (40 µg/mL) 0.455 -0.211 4 Standar 3 (80 µg/mL) 0.896 0.230 5 Standar 4 (120 µg/mL) 2.576 1.910 6 Standar 5 (160 µg/mL) 1.701 1.305 7 Standar 6 (180 µg/mL) 1.798 1.132
Contoh perhitungan (Standar 1)
Absorbansi terkoreksi = Absorbansi terbaca – Absorbansi blanko = 1.360 A – 0.666 A
= 0.694 A
Gambar 1 Hubungan konsentrasi standar dan absorbansi Tabel 2 Konsentrasi fosfor serum darah
Sampel A Terbaca A Terkoreksi [Fosfor] (μg/mL)
Blanko 0.666 0.000 -Sampel 1 0.593 -0.073 -1.052 Sampel 2 0.667 0.001 -0.078 Sampel 3 0.433 -0.233 -3.157 Sampel 4 0.479 -0.187 -2.474 Sampel 5 0.834 0.168 2.118 Sampel 6 0.498 -0.168 -2.118
Contoh perhitungan (ulangan sampel ke-5)
Absorbansi terkoreksi = Absorbansi terbaca – Absorbansi blanko = 0.834 A – 0.666 A
= 0.168 A
y = 0.007 + 0.076 x
Absorbansi terkoreksi = 0.007 + 0.076 [fosfor] 0.168 = 0.007 + 0.076 [fosfor] [Fosfor] = [Fosfor] = 2.118 μg/mL y = 0,0077x + 0,076 R² = 0,4159 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 50 100 150 200 A b s o r b a n s i T e r b a c a ( A ) Konsentrasi (ug/mL)
Hasil dari data di atas di peroleh persamaan regresi yang tidak linier dan nilai R yang rendah. Nilai R yang rendah akan mengakibatkan data yang didapatkan kurang akurat.Nilai minus pada data juga dapat mengakibat data yang tidak akurat. Semua itu dikarenakan kesalahan oleh alat atau juga praktikan yang keleahan. Kadar fosfor dalam darah yang didapat dari percobaan ini sebesar 2.118 μg/mL. Kadar fosfor normal pada plasma darah sapi adalah 5.34 – 7.38 mg/dL Kadar fosfor dalam manusia yaituo 2.5-4.5 mg/dL (Poedjiadi 2009). Sedangkan kadar fosfor yang terhitung dalam percobaan lebih rendah dari literatur yang ada.
Kadar fosfor yang rendah akan mengakibatkan hipofosfatemia. ipofosfatemia adalah konsentrasi fosfor anorganik dibawah normal. Meskipun keadaan ini sering menunjukkan defisiensi fosfor, keadaan ini dapat terjadi dalam berbagai situasi dimana penyimpangan fosfor tubuh adalah normal. Sebaliknya, defisiensi fosfor mengacu pada suatu rendahnya kandungan fosfor secara abnormal dalam jaringan otot dan bisa terjadi dalam keadaan tidak adanya hipofosfatemia. Sebagian besar tanda dan gejala defisiensi fosfor tampak terjadi akibat defisiensi adenosin trifosfat (ATP), atau 2,3-difosfogliserat (DPG), atau keduanya. defisiemsi ATP merusak sumber energi seluler, dan 2,3-DPG merusak pengiriman oksigen (Brunner & Suddarth, 2001).
Gejala neurologis yang luas dapat terjadi, seperti peka rangsang, gelisah, kelemahan, kebas, parestesia, kelam pikir, kejang, dan koma. Kadar 2,3-DPG yang rendah mengakibatkan aneksia jaringan. Hipoksia kemudian mengarah pada peningkatan frekuensi pernapasan dan alkalosis respiratorik, sehingga
menyebabkan fosfor berpindah ke dalam sel-sel dan menguatkan hipofosfatemia. Pemeriksaan diagnostiknya yaitu dengan pemeriksaan dilaboratorium untuk melihat fosfor serum: akan kurang dari 2,5 mg/dl (1,7 mEq/L), untuk hipofosfatemia sedang kurang dari 1,0-2,5 mg/dl, untuk hipofosfatemia berat kurang dari 1,0 mg/dl. Pemeriksaan terhadap kadar hormon paratiroid (PTH), magnesium, fosfatase alkalin, dan pemeriksaan dengan sinar X. Serta pemeriksaan rontgen untuk melihat perubahan skeletal asteomalasia atau riket. Pada penderita hipofosfatemia sering terjadi komplikasi yaitu osteomalasia atau riket. Ini terjadi karena defisiensi vitamin D yang menyebabkan penurunan kalsium dan fosfor (Brunner & Suddarth, 2001).
Hormon yang berpengaruh dalam metabolisme fosfat adalah parathormon (PTH) dan vitamin D (1,25-dihidroksi-kolekalsiferol/1,25-(OH)2D3). Kerja PTH
pada tulang adalah membebaskan kalsium ke dalam aliran darah, fosfat dan konstituen juga dimobilisasi. Dalam ginjal, PTH meningkatkan reabsorpsi Ca2+ di tubulus ginjal, dan menekan reabsorpsi fosfat sehingga terjadi penurunan ekskresi kalsium dan peningkatan pengeluaran fosfat, sedangkan vitamin D, mulanya prekusor-prekusor vitamin D mengalami hidroksilasi di hati dan kemudian diubah oleh ginjal menjadi bentuk dihidroksi. Produk ginjal ini mengalir ke organ-organ sasarannya, usus halus dan tulang. Penyerapan kalsium dan fosfat dari makanan ditingkatkan oleh 1,25-(OH)2D3 yang juga meningkatkan efek PTH dalam
mobilisasi kalsium dan fosfor tulang. Kadar fosfat serum yang rendah mendorong pembentukan 1,25-(OH)2D3 oleh ginjal, hipokalsemia merangsang pembentukan
PTH, kemudian meningkatkan sintesis 1,25-(OH)2D3di ginjal (Lawrence 2000).
Metode yang digunakan dalam percobaan ini cukup akurat untuk memberikan data mengenai konsentrasi dari suatu larutan karena pengukurannya menggunakan nano spektrofotometer yang mampu mengukur absorbansi dalam
volume skala yang kecil. Kelemahan dari metode ini adalah metode ini mudah diganggu oleh kontaminan, senyawa dari luar atau peralatan yang dapat menghalangi fosfor untuk teroksidasi sehingga fosfor juga terperangkap dan terendapkan pada pelet dan tidak dapat diukur saat diukur menggunakan spektrofotometer. Selain metode Fardiaz metode lain yang dapat digunakan adalah metode Briggs yang berprinsip pengendapan protein dahulu dengan larutan TCA. Filtrat yang diperoleh akan memiliki pH rendah sehingga reaksinya dengan asam molibdat membentuk senyawa kompleks. Kompleks ini kemudian direduksi oleh larutan hidrokuinon membentuk warna biru. Untuk menstabilkan warna digunakan Na-tiosulfat 20%. Serapan diukur dengan spektrofotometer (Bintang 2010).
SIMPULAN
Hasil pengukuran dengan menggunakan spektrofotonano menunjukkan bahwa regresi yang diperoleh tidak bagus karena Nilai R sangat rendah, sehingga praktikan mengaitkan data dengan literatur bahwa serum uji memiliki kondisi
kekurangan fosfat atau hipofosfatemia.
DAFTAR PUSTAKA
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta (ID): Erlangga Medical Series.
Brunner & Suddarth. 2001. Keperawatan Medikal Bedah, Edisi 8. Jakarta : EGC. Campbell et al . 2003. Biology. New York: Mc Graw Hill.
Koolman J, Roehm KH. 2005. Colour Atlas of Biochemistry. Thieme New York: 333 Seventh Avenue.
Lawrence Kaplan. 2000. Clinical Chemitstry Fourth Edititon. St Louis (USA) : Mosby.
Mima M dan Horne. 2001. Keseimbangan Cairan Elektrolit dan Asam. Jakarta: EGC.
Poedjiaji A. 2009. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta (ID): UIP.
Rahmalisa T. A., Hanifah S., Anita. 2014. Analisis Nitrogen , Fosfor dan Kalium Pada Sedimen Kolam Instalasi Pengilahan Air Limbah (IPAL TPA Muara Fajar Pekanbaru. Jurnal Universitas Riau Vol : 2 : 1-6.
