1 LATIHAN III
PREPARAT POLLEN
Tujuan : Membuat preparat pollen Hibiscus rosa-sinensis dan Lilium sp.
Bahan : Antera Hibiscus rosa-sinensis dan Lilium sp.
Preparat : Preparat tumbuhan Dicotyledonae dan Monocotyledonae Metode : Asetolisis
Cara Kerja :
Hari ke I : Fiksasi :
Pollen-pollen yang diambil dari antera dikumpulkan dalam botol flakon yang sudah diisi dengan asam asetat glasial.
Hari ke II : Bahan dipindah dalam tabung sentrifuge dan disentrifuge selama ± 5 menit. Setelah itu, cairan dituang dan diganti dengan campuran asam asetat glasial dengan asam sulfat pekan dengan perbandingan 9:1 (ingat dalam membuat cairan ini, asam sulfat pekat harus ditambahkan setetes demi setetes kedalam asam asetat glasial.) dan dipanaskan dalam waterbath selama ± 3 menit. Setelah itu, pemanasan dihentikan dan tabung diambil dan didiamkan selama ± 15 menit.
Setelah dingin, disentrifuge dan cairan dituang diganti dengan akuades dan diforteks dan disentrifuge lagi.Ulangi 2-3 kali dimana setiap pencucian harus disentrifuge lagi.
Pewarnaan: dengan safranin 1% dalam akuades ± 2 tetes dan ditambah dengan sedikit akuades diforteks dan disentrifuge lagi. Safranin dituang dan diganti dengan gliserin jeli dengan menggunakan batang gelas sambil dipanaskan, tetapi dijaga jangan sampai mendidih.
Ambil bahan menggunakan batang gelas, taruh diatas gelas benda kemudian ditutup dengan gelas penutup yang disudut-sudutnya diberi potongan parafin dan dipanaskan lagi hingga parafin meleleh.
Pemberian label : disebelah kiri gelas penutup dilekatkan etiket dan diberi keterangan : nama spesies, organ bersangkutan, dsb.
2 HASIL DAN PEMBAHASAN
a.) Hasil
A B
Gambar . Preparat pollen Lillium sp. (A) dan Hibiscus rosa-sinensis perbesaran 400 x
Berdasarkan hasil pengamatan terlihat bahwa preparat pollen Lillium sp. berbentuk bulat telur dan tepian pollen halus atau rata, sedangkan pada pollen
Hibiscus rosa-sinensis berbentuk bulat dengan tepian pollen membentuk tonjolan-tonjolan spina
b.) Pembahasan
Benang sari (stamen) memiliki bagian-bagian antara lain kepala sari (anthera) yang terletak di ujung tangkai sari (filamen). Tangkai sari merupakan suatu badan yang berbentuk jorong , bulat atau dapat juga bulat telur. Serbuk sari merupakan bahan yang sangat lembut dan mudah beterbangan jika tertiup angin. Dinding pollen terdiri dari dua bagian atau lapisan, yaitu:
Intin Lapisan dalam dinding pollen yang mengandung selulose, pektin, kalose, polisakarida lain dan protein.
Eksin Lapisan terluar dinding pollen yang mengandung sporopolenin dan glikokaliks. Sporopolenin merupakan polimer kompleks antara karotenoid dan ester karotenoid dengan oksigen.
3 Sporopolenin menyebabkan dinding pollen menjadi tebal yang tahan terhadap asam atau basa kuat. Dengan adanya sporopolenin tersebut maka dalam pembuatan preparat pollen digunakan metode acetolysis, yaitu melarutkan didnding sel anthera dengan asam sulfat sehingga akan tampak transparan dan diawetkan oleh asam asetat. Pollen yang digunakan dalam praktikum ini adalah pollen Hibiscus rosa-sinensis dan
Lilium sp.
Fiksasi
Fiksasi merupakan suatu proses preparasi yang mengkondisikan bahan mendekati kondisi yang sama seperti waktu masih hidup dan perubahan post-mortem , sehingga ketika sel diamati keadaannya masih sama seperti kondisi saat masih hidup dengan struktur yang tampak jelas pula. Fiksasi jugabertujuan untuk mematikan aktivitas seluler dan menguatkan bahan. Fiksasi juga dapat menyebabkan pigmen khlorofil ilang. Fiksatif yang digunakan pada acara ini adalah Asam asetat glasial. Pollen-pollen yang diperoleh dari Hibiscus rosa-sinensis dan Lillium sp. dikumpulkan dan dimasukkan kedalam botol flakon yang berisi asam asetat glasial yang berfungsi untuk penyesuaian pada proses selanjutnya, untuk pembengkakan pollen dan untuk mengawetkan pollen. Dinding pollen mengandung karotenoid sehingga membutuhkan fiksatif yang kuat seperti asam asaetat glasial. Karotenoid juga sebagai antioksidan yang dapat mengikat oksigen. Fiksatif akan masuk kedalam sel dan bereaksi dengan protein atau enzim yang berada didalamnya. Reaksi ini menyebabkan adanya perubahan struktur atau komposisi meliputi perubahan sifat fisika, kimia dan biologis. Protein atau enzim tersebut akan terdenaturasi sehingga sel menjadi mati dan mengalami koagulasi. Koagulan yang mengendap tersebut akan menguatkan sel sehingga sel tidak mudah larut dan molekul tetap pada posisinya.
Sentrifugasi
Setelah difiksasi, bahan dipindahkan dalam tabung sentrifus dan selanjutnya disentrifugasi. Sentrifugasi merupakan metode pemisahan zat berdasarkan ukuran partikel. Sentrifugasi bertujuan untuk mengendapkan pollen, sehingga pada akhir proses sentrifugasi pollen akan berada di dasar tabung karena memiliki berat molekul yang lebih tinggi. Selanjutnya cairan yang ada ditabung bersama pollen dituang,dan penuangan dilakukan langsung sekali waktu agar pollen tidak ikut keluar.
4 Kemudian ditambahkan campuran AAG (Asam asetat glasial) dengan asam sulfat pekat dengan perbandingan 9:1. Saat pembuatan larutan campuran, penambahan asam sulfat pekat harus secara perlahan agar tidak terjadi reaksi secara spontan. Pencampuran larutan sebaiknya dilakukan di lemari asam karena larutan yang digunakan bersifat asam kuat (Asm sulfat).
Asam asetat glasial berfungsi sebagai fiksatif yang akan mengawetkan pollen, sedangkan asam sulfat pekat berfungsi untuk melisiskan dinding sel pollen. Penambahan AAG dengan asam sulfat pekat merupakan proses asetolisis yang berfungsi menjernihkan pollen dengan melarutkan dinding sel karena awalnya pollen berupa bahan yang tidak transparan.
Pollen yang telah disentrifus kemudian dipanaskan. Pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi asetolisis dan untuk membuka pori-pori pollen. Pada awalnya, pollen akan menjadi transparan setelah di fiksasi karena khlorofil telah larut oleh fiksatif. Namun, pollen akan dapat menjadi gelap kembali jika proses asetolisis terlalu singkat karena zat kimia akan menempel pada pollen. Setelah itu pemanasan dihentikan dan dilakukan pendinginan selama agar pollen tidak pecah saat di sentrifugasi kembali. Apabila telah dingin tabung disentrifus dan cairan dituang dan diganti dengan aquades sebagai pelarut dan untuk menghilangkan kotoran yang mungkin timbul selama proses asetolisis. Selanjutnya dilakukan homogenasi larutan dengan cara diforteks dan disentrifugasu lagi. Dilakukan pengulangan sebanyak 2-3 kali dan setiap pencucian harus disentrifus lagi.
Pewarnaan
Pewarnaan pollen dilakukan dengan menggunakan safranin 1% dalam aquades ±2 tetes dan ditambahkan sedikit aquades agar warna yang didapat tidak terlalu pekat.Safranin dipilih karena apabila menggunakan pewarna yang memiliki konsentrasi tinggi,pollen transparan akan menjadi gelap.Dilakukan forteks dan sentrifus lagi.Forteks bertujuan untuk meratakan proses pewarnaan pollen.
Penutupan
Tahap selanjutnya safranin dibuang dan digantikan dengan gliserin jelly dengan menggunakan batang gelas sambil dipanaskan tetapi dijaga usahakan jangan sampai mendidih karena suhu tinggi dapat merusak polen dan timbul gelembung udara.Gelembung udara akan menyebabkan preparat menjadi kurang bagus karena
5 gliserin jeli adalah Gelatin 150 gram (sebagai perekat), Gliserin 150 cc (penutupan), phenol 7 gram (anti mikroorganisme) dan akuades 175 cc (pelarut gelatin). Fungsi pemberian gliserin jelly adalah untuk menjaga kesegeran dan kelembaban,meningkatkan indeks bias,dan mencegah preparat agar tidak bergeser-geser karena gliserin jelly (gelatin) berbentuk padat pada suhu ruang.
Bahan diambil dengan batang gelas lalu ditaruh gelas benda kemudian ditutup dengan gelas penutup yang zat-zatnya diberi potongan parafin.Dipanaskan kembali agar potongan parafin meleleh.Parafin yang telah leleh digunakan sebagai perekat atau penyegel agar preparat tidak bergeser-geser.. Fungsi pemberian gliserin jelly adalah untuk menjaga kesegeran dan kelembaban,meningkatkan indeks bias,dan mencegah preparat agar tidak bergeser-geser karena gliserin jelly (gelatin) berbentuk padat pada suhu ruang.
Pemberian nama
Dilakukan disebelah kiri gelas penutup diletakkan etiket dan diberikan keterangan nama spesies,organ yang bersangkutan dan sebagainya.
Berdasarkan hasil percobaan dapat dilihat bahwa pollen H. rosa-sinensis berukuran lebih besar dari pollen Lilium sp.Pada pollen H. rosa-sinensis terlihat bagian tepinya tidak rata dan tampak struktur yang menonjol keluar. Sedangkan, pada pollen Lilium sp. bagian tepinya rata dan halus, tidak ada tonjolan-tonjolan.Pollen/spora memiliki sifat tahan terhadap degradasi, asam/basa kuat, asetolisis.Sehingga, sebenarnya pollen tidak memerlukan fiksasi.
Kesimpulan
Adanya sporopolenin tersebut maka dalam pembuatan preparat pollen digunakan metode acetolysis,Dalam pembuatan preparat pollen memiliki beberapa tahap yaitu : fiksasi,sentrifugasi,pewarnaan,penutupan dan pemberian nama.
