BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
Serangkaian penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui peningkatan kelarutan kurkumin dengan memodifikasi strukturnya menggunakan asam sitrat. Variasi konsentrasi serbuk kunyit yang diuji adalah 1,1%; 2,2% dan 30% dengan masing-masing konsentrasi asam sitrat sebagai modifier sebesar 0,8% (terhadap pelarut).
Polimer misel dibentuk dengan metode pemanasan reflux. Metode ini memiliki langkah yaitu kurkumin (KUR) dari kunyit sebagai bahan aktif yang non-polar dimodifikasi menggunakan agen hidrofilik asam sitrat (AST) kemudian dilarutkan ke dalam suatu pelarut hingga homogen dan dilanjutkan dengan pemanasan menggunakan sistem refluks. Selanjutnya, proses penguapan pelarut dilakukan menggunakan rotary evaporator. Massa kering yang dihasilkan kemudian diuji kelarutannya dan dianalisa dengan uji Spektrofotometri UV-Vis dan HPLC.
Penetapan kadar kurkumin dengan Spektrofotometri UV-Vis
Verifikasi metode yang dilakukan pada penelitian ini adalah akurasi dan presisi. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan untuk menentukan panjang gelombang di mana larutan analit memberikan serapan maksimal. Pada penelitian ini didapatkan panjang gelombang maksimum kurkumin hasil screening yaitu 430 nm dalam pelarut etanol 90% dan pelarut buffer fosfat pH 6. Hasil panjang gelombang maksimum pada penelitian ini sesuai dengan apa yang didapatkan dalam penelitian oleh Mondal pada tahun 2016 (Mondal et al., 2016)
Akurasi adalah nilai yang menunjukan derajat kedekatan hasil teranalisa dengan kadar analit yang sebenarnya. Syarat nilai presentase recovery yang dapat diterima untuk konsentrasi 0,1 μg/mL hingga 10 μg/mL adalah dalam rentang batas 80-110% (Latimer, 2016). Pada penelitian ini, nilai presentase recovery yang didapatkan antara 98,73-102,75% (Tabel 5) dan telah dinyatakan memenuhi persyaratan mengenai akurasi metode.
Tabel 5. Perhitungan nilai akurasi Konsentrasi larutan
standar (ppm) Absorbansi
Rataan konsentrasi
terukur (ppm) SD
Recovery (%) 0,101
0,5 0,103 0,502 0,0102 100,52
0,1
0,499
3,2 0,514 3,228 0,0546 100,89
0,512 0,663
4,2 0,666 4,244 0,0532 101,06
0,651 0,943
6,2 0,956 6,195 0,0485 99,933
0,955
Sedangkan presisi merupakan ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel homogen yang sama. Syarat uji presisi yang dinyatakan dalam Relative Standard Deviation (RSD) adalah nilai RSD lebih kecil dari 2%
(Mulyati et al., 2011).
Tabel 6. Uji Presisi berdasarkan nilai Relative Standard Deviation (RSD)
Rata-rata konsentrasi SD RSD (%)
0,503 0,0102 0,02
3,229 0,0546 0,017
4,244 0,0532 0,03
6,196 0,0485 0,008
Pada penelitian ini, RSD yang didapatkan antara 0,008-0,03% (Tabel 6) dan telah memenuhi persyaratan mengenai presisi metode. Dengan didapatkan hasil presentase recovery dan nilai RSD yang memenuhi syarat, maka dapat disimpulkan bahwa metode analisis yang digunakan sudah akurat dan teliti.
Uji kelarutan misel KUR-AST
Kadar kurkumin terlarut dalam ppm ditentukan dengan mensubtitusikan nilai absorbansi, yang didapatkan dari hasil uji kelarutan, ke dalam persamaan linear dari kurva baku.
Tabel 7. Hasil pengukuran kadar kelarutan kurkumin
% (b/v) Serbuk Kunyit Waktu pemanasan refluks (min) Absorbansi Kadar (ppm)
0,64 20,00 0,140 0,7682
1,10 10,00 0,213 1,2500
1,10 30,00 0,140 0,7638
2,20 5,86 0,256 1,5408
2,20 20,00 0,176 1,0027
2,20 20,00 0,163 0,9178
2,20 20,00 0,148 0,8196
2,20 20,00 0,155 0,8620
2,20 20,00 0,163 0,9156
2,20 34,14 0,297 1,5675
3,30 10,00 0,256 1,5385
3,30 30,00 0,217 1,2770
3,76 20,00 0,295 1,7997
Kadar kurkumin yang didapatkan kemudian dianalisa dengan program Design Expert ver.
10. Analisa data dilakukan untuk menentukan model prediksi dan uji lack of fit yang didasarkan dengan uji ANOVA (P < 0,05). Optimasi dilakukan dengan metode Respon Surface Methodology (RSM). Desain optimasi menggunakan 23 central composite design (CCD) dengan 2 peubah dan tiga level faktor. Sebagai peubah yaitu konsentrasi serbuk kunyit dalam asam sitrat (X1) dan waktu pemanasan refluks (X2). Faktor X1 meliputi konsentrasi serbuk kunyit dalam asam sitrat sebesar 1,1; 2,2; dan 3,3 % (b/v). Faktor X2 meliputi waktu pemanasan refluks selama 10, 20, dan 30 menit.
Setiap variabel dan faktor diberi kode -1,41; -1,00; 0,00; +1,00; + 1,41. Nilai model prediksi dan uji lack of it ditentukan berdasarkan uji ANOVA (P < 0,05). Model yang signifikan digunakan untuk optimasi dengan kondisi optimal prediksi yang dipilih adalah yang memiliki desirability paling tinggi.
Berdasarkan hasil analisa, model yang disarankan dari program untuk respon kadar kurkumin adalah quadratic dengan p-value yang dimiliki kurang dari 0,05. Pemilihan model didasarkan dengan syarat memiliki nilai standar deviasi terendah, R2 tertinggi, adjusted R2 tertinggi, prediction R2 tertinggi dan nilai PRESS terendah (Apriani et al., 2013).
Tabel 8. Model Summary Statistics Respon Kadar Kurkumin
Source Std. Dev R2 Adj-R2 Pred-R2 PRESS Ket
Linear 0,30 0,4541 0,3327 -0,1523 1,76
2FI 0,31 0,4828 0,2889 -0,3153 2,01
Quadratic 0,060 0,9861 0,9744 0,959 0,063 Suggested
Cubic 0,069 0,9876 0,9659 +
Model kuadratik terpilih sebagai model statistik yang tepat berdasarkan program Design Expert ver. 10 dalam menjelaskan hubungan antara konsentrasi serbuk kunyit dan waktu
pemanasan refluks terhadap kadar kurkumin terlarut.
Tabel 9. Hasil Analisa Ragam (ANOVA) Source Sum of
Square
df Mean Square
F-value p-value Prob > F
Model 1,51 5 0,3 84,86 < 0,0001 Significant
X1-konsentrasi 0,86 1 0,86 241,47 < 0,0001 X2-waktu 2,6E-004 1 2,7E-004 0,075 0,7931
X1X2 0,15 1 0,15 41,24 0,0007
X12 0.22 1 0,22 62,53 0,0002
X22 0,66 1 0,66 187,2 < 0,0001
Residual 0,021 6 3,5E-003
Lack of fit 2,35E-003 2 4,7E-003 0,25 0,7915 Not significant Berdasarkan uji ANOVA, model prediksi yang didapatkan bersifat signifikan sehingga dapat digunakan untuk memprediksi hasil. Nilai lack of fit yang bersifat not-significant menandakan bahwa model yang diperoleh sesuai dengan data yang ada atau dapat memodelkan data secara tepat dimana antara nilai aktual dan prediksi tidak berbeda signifikan (Lenth, 2010).
Variabel yang berpengaruh secara signifikan adalah konsentrasi dan interaksi antara konsentrasi dan waktu pemanasan, serta kuadrat antar level konsentrasi dan waktu pemanasan.
Respon dari analisa ANOVA menghasilkan suatu persamaan model yang dapat digunakan untuk mengetahui nilai respon kadar kurkumin yang didapatkan jika adanya variasi konsentrasi serbuk kunyit dan waktu pemanasan refluks yang berbeda. Persamaan regresi untuk respon kadar kurkumin ditunjukkan sebagai berikut.
𝑦 = 3,14238 − 0,077812𝑋1− 0,17675𝑋2+ 2,24522 ∙ 10−3𝑋1𝑋2+ 1,5288 ∙ 10−3𝑋12 + 3,2006 ∙ 10−3𝑋22
Ket : a. y : Kadar KUR (μg/mL) b. X1 : Konsentrasi (%)
c. X2 : Waktu pemanasan refluks (min)
Persamaan ini dapat digunakan dalam memprediksikan respons untuk tingkat tertentu dari setiap faktor. Koefisien X1 dan X2 menunjukkan besarnya kenaikan atau penurunan nilai Y. Jika koefisien X bernilai negatif maka akan menurunkan nilai Y, sedangkan jika koefisien X bernilai positif maka nilai Y akan meningkat.
Berdasarkan persamaan tersebut dapat disimpulkan bahwa konsentrasi serbuk kunyit dengan p-value < 0,05 (significant) bernilai negatif mengartikan bahwa peningkatan variabel berpengaruh menurunkan kadar kurkumin terlarut. Berbeda halnya dengan variabel waktu pemanasan refluks yang memiliki p-value > 0,05, hal ini menyatakan bahwa variabel ini tidak mempengaruhi kadar kurkumin terlarut. Sedangkan interaksi antara konsentrasi serbuk kunyit dengan waktu pemanasan refluks berpengaruh terhadap peningkatan kadar kurkumin terlarut. Hal ini dibuktikan dengan nilai variabel interaksi keduanya memiliki tanda positif. Oleh karena itu, dari interaksi keduanya dimungkinan akan terbentuknya sistem misel. Hubungan antara interaksi variabel dengan respon ditunjukkan dengan kurva 3D Surface yang digambarkan sebagai berikut.
Gambar 3. 3D Surface
Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Kadar KUR (ug/mL)
Design points above predicted value Design points below predicted value 1.79973
0.763787
X1 = A: Konsentrasi X2 = B: Waktu
10 15 20 25 30
11 16.5
22 27.5
33 0.6
0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2
Kadar KUR (ug/mL)
A: Konsentrasi (%) B: Waktu (menit)
Kurva kuadratik dengan karakteristik minimum tersebut menunjukkan bahwa kadar kurkumin dengan nilai tertinggi berada pada sekitar nilai maksimal konsentrasi serbuk kunyit dan waktu pemanasan refluks.
Kondisi sampel prediksi yang optimal didapatkan adalah sebesar 3,3% (w/v) serbuk kunyit dalam pelarut dengan waktu pemanasan refluks selama 30 menit, hal ini diperoleh berdasarkan optimasi hasil analisa data yang dilakukan dengan bantuan software Design Expert versi 10.
Sampel optimal ini memiliki kadar terprediksi sebesar 2,040 ppm, kemudian sampel diuji kelarutannya dan diukur nilai absorbansinya.
Nilai absorbansi kemudian dikonversikan menjadi jumlah kadar kurkumin terlarut. Kondisi prediksi optimal yang telah dicoba secara aktual dalam eksperimen laboratorium, hasilnya dibandingkan dengan nilai aktual menggunakan uji t pada selang kepercayaan 95%.
Tabel 10. Absorbansi terukur untuk sampel optimal
Sampel optimal Absorbansi (abs) Kadar kurkumin (ppm)
3,3% sampel
0,335 2,067649
0,330 2,041590
0,331 2,040857
0,329 2,027461
Model ini didapatkan dengan uji lack of fit yang memberikan hasil P > 0,05 yang mana hasil yang diprediksi (predicted) tidak berbeda nyata dengan hasil sesungguhnya (actual).
Penetapan kadar kurkumin dalam serbuk kunyit dan sampel KUR-AST yang optimal
Kadar kurkumin dalam serbuk kunyit standar ditentukan dengan sistem HPLC. Serbuk kunyit dilarutkan dalam pelarut etanol 90% (0,1% w/v). Kurkumin memiliki kelarutan tertinggi dalam pelarut etanol (Degot et al., 2021). Sehingga akan dibandingkan kadar kurkumin pada serbuk kunyit-etanol dengan serbuk kunyit termodifikasi sebagai misel.
Gambar 4. Kromatogram serbuk kunyit tanpa modifikasi (kurkumin puncak 12, tR = 7,800 min)
Pada kromatogram, terdapat tiga peak yang terekam dalam sistem HPLC. Kurkumin ditunjukkan pada peak bernomor 12, sedangkan pada peak bernomor 10 dan 11 menunjukkan bisdemetoksikurkumin dan juga demetoksikurkumin. Bisdemetoksikurkumin sebagai senyawa yang terekam lebih awal menandakan bahwa senyawa ini lebih polar, diikuti dengan demetoksi dan kurkumin sebagai senyawa yang lebih nonpolar (Zahar et al., 2019).
a. Penetapan kadar kurkumin pada sampel KUR-AST yang optimal secara HPLC dengan pelarut buffer fosfat pH 6
Sampel kering kurkumin optimal termodifikasi dilarutkan dalam pelarut buffer pH 6 (0,1%
w/v). Larutan sampel kemudian ditentukan kadar kurkumin yang terkandung dalam sampel secara HPLC lalu dibandingkan dengan kadar terhitung pada serbuk kunyit 0,1%.
Gambar 5. Kromatogram sampel misel dengan pelarut buffer fosfat (kurkumin = puncak 1, tR = 7,800 min)
Tabel 11. Kadar kurkumin teruji secara HPLC Sampel Konsentrasi uji
(μg/mL)
Area (mAu.mnt)
Kurkumin uji (μg/ml)
Kurkumin sampel (%w/w)
Sampel A 1000 2295840 10,2455 1,0246
Sampel B 1000 5546 NQ NQ
Ket : a. Sampel A : Serbuk kunyit 0.1% ekstraksi etanol b. Sampel B : Misel KUR-AST 0.1%
c. NQ : Not quantified
Nilai kadar kurkumin dalam sampel A diketahui memiliki nilai yang lebih besar. Hal ini dikarenakan kurkumin memiliki nilai kelarutan tinggi dalam pelarut etanol. Kadar kurkumin yang terkandung dalam sampel termodifikasi sebagai misel dinyatakan sebagai NQ (not quantified). Hal ini menandakan bahwa kurkumin yang terkandung sangat kecil dan berkisaran di bawah LOQ dan di atas LOD, yang menyebabkan nilainya tak dapat terhitung dalam sistem HPLC. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kurkumin memiliki nilai kelarutan yang rendah dalam buffer fosfat pH 6.
Hasil modifikasi kurkumin dengan asam sitrat ternyata belum dapat meningkatkan kelarutan kurkumin dalam larutan buffer fosfat pH 6. Pada kondisi ini, asam sitrat dimungkinkan berinteraksi dengan ion-ion komponen buffer seperti Na+ dan K+ yang mana setiap ion ini akan berikatan dengan gugus COO- dari asam sitrat. Ion sitrat diketahui dapat bereaksi dengan logam alkali seperti ion natrium dan ion kalium (Matzapetakis et al., 1998). Asam sitrat yang berinteraksi dengan ion lain ini menyebabkan kurkumin tidak termodifikasi sempurna sehingga tidak terjadinya peningkatan kelarutan.
b. Penetapan kadar kurkumin sampel KUR-AST yang optimal secara HPLC dengan pelarut air
Metode yang digunakan pada uji kelarutan ini adalah dengan metode ultrasonikasi dengan pelarut air. Dua sampel kering yaitu sampel misel KUR-AST (Sampel A) dan sampel kontrol yaitu ekstrak etanol kunyit tanpa modifier (Sampel B) disiapkan, kemudian masing-masing dilarutkan dalam pelarut air dan diekstraksi secara sonikasi bertingkat. Kedua sampel kemudian diuji secara HPLC. Kromatogram hasil uji HPLC masing-masing sampel ditunjukkan pada Gambar 6 dan 7.
Gambar 6. Kromatogram sampel misel-kurkumin dengan modifier (kurkumin = puncak 3, tR = 7,800 min)
Gambar 7. Kromatogram sampel misel-kurkumin tanpa modifier (kurkumin = puncak 3, tR = 7,800 min)
Berdasarkan luas area puncak kurkumin, maka ditentukan kadar kurkumin terlarut dalam air. Data hasil kadar kurkumin terlarut dalam air disajikan pada Tabel 12.
Tabel 12. Kadar kurkumin teruji secara HPLC Sampel Konsentrasi uji
(μg/mL)
Area (mAu.mnt) Kurkumin terlarut (µg/mL)
Sampel A 1000 41858 134,6
Sampel B 1000 3570 NQ
Ket : a. Sampel A : Sampel optimal misel KUR-AST dengan asam sitrat sebagai modifier b. Sampel B : Sampel kontrol ekstrak etanol kunyit tanpa modifier
c. NQ : Not quantified
Berdasarkan hasil tersebut, kurkumin uji dalam sampel kontrol (sampel B) tidak terkuantitasi pada sistem HPLC, sedangkan sampel misel KUR-AST dengan modifier (sampel A) memiliki kadar kurkumin uji sebesar 134,6 µg/mL. Hal ini menunjukan bahwa terjadinya peningkatan kelarutan kurkumin pada sampel misel KUR-AST. Kenaikan kelarutan ini terhitung hingga 134,6 kali lipat dibandingkan dengan sampel kontrol tanpa adanya modifier.
Hal ini sesuai dengan teori yang menyatakan bahwa asam sitrat merupakan salah satu senyawa yang dapat digunakan sebagai template dalam pembentukan misel, dengan gugus aktif OH- pada asam sitrat dihipotesiskan akan membentuk polimer misel dengan kurkumin melalui konjugasi ikatan ester (Nangare et al., 2021).
Pada polimerisasi misel dalam pemanasan refluks ini reaksi yang dimungkinkan terjadi adalah reaksi esterifikasi (dehidrasi) antara kurkumin dengan asam sitrat sebagai modifier (Nayunigari et al., 2016). Asam sitrat dapat diesterifikasi pada satu atau lebih dari tiga gugus asam karboksilatnya untuk membentuk struktur baru (Bergeron et al., 1997). Dengan panas yang diberikan reaksi akan berjalan lebih cepat, selain itu peningkatan suhu menjadi salah satu faktor dari ditentukannya konsentrasi kritis misel (Mohajeri & Noudeh, 2012).
Misel terbentuk ketika konsentrasi modifier sebagai surfaktan memiliki nilai yang lebih besar daripada critical micelle concentration (CMC), dan suhu pada sistem lebih besar daripada suhu kritis misel, atau suhu Krafft (B. P. K. Reddy et al., 2015). Semakin rendah nilai CMC, maka semakin cepat juga terbentuknya misel dalam sistem (Kapse et al., 2020).
Gambar 8. Penambahan kurkumin dengan asam sitrat
Termodinamika merupakan prinsip yang dapat menjelaskan terjadinya pembentukan misel. Proses ini dapat terjadi secara spontan karena adanya kesetimbangan antara entropi dan entalpi. Pada konsentrasi modifier yang sangat rendah, misel yang terbentuk hanya berupa monomer dalam larutan (Egorova & Kaba, 2019).
+
Asam sitrat dikatakan sebagai agen modifier non-ionik, hal ini menyebabkan nilai CMC akan menurun dengan adanya peningkatan suhu (Kim & Lim, 2004). Hal ini disebabkan peningkatan penghancuran ikatan hidrogen antara molekul air dan gugus hidrofilik surfaktan (Mohajeri & Noudeh, 2012). Sehingga pemanasan pada refluks akan mendukung terjadinya pembentukan misel.
Gambar 9. Bentuk ion dari kurkumin dan asam sitrat
Dengan dehidrasi, karbon yang melepas OH- pada asam sitrat akan bermuatan positif dan berikatan dengan atom O yang bermuatan negatif pada rantai fenolik pada kurkumin. Sehingga struktur akhir yang dihipotesakan adalah sebagai berikut.
Gambar 10. Produk reaksi modifikasi struktur kurkumin-sitrat
Reaksi ini terjadi karena kurkumin memiliki 2 gugus aktif hidroksida (OH-) yang dapat dimanfaatkan untuk membentuk suatu konjugasi melalui ikatan ester. Gugus aktif tersebut direaksikan dengan asam organik melalui reaksi esterifikasi. Asam sitrat yang memiliki banyak gugus OH akan membentuk ikatan polimer misel melalui konjugasi ikatan ester (Chen et al., 2020).
Gambar 11. Polimer misel KUR-AST (dokumen pribadi)
+
Karbonpada asam sitrat berikatan dengan bagian non-polar pada kurkumin yaitu cincin metoksi fenolik. Pada cincin fenolik ini diasumsikan asam sitrat akan berikatan yang kemudian menghasilkan struktur akhir misel.
