Kode/Nama Rumpun Ilmu
: 362 / Bidang Kesehatan Umum Lain yang belum tercantum Tema : Kesehatan, penyakit tropis, gizi
dan obat-obatan
LAPORAN AKHIR
PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL
LAMA WAKTU KOLONISASI LACTOBACILLUS SP F213 PADA SALURAN PENCERNAAN DIANALISIS MENGGUNAKAN SIDIK DNA MIKROBIOMIK FESES DALAM PENGEMBANGAN
PROBIOTIK UNTUK MENURUNKAN KOLESTEROL
Ketua/Anggota Tim
Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc., Ph.D. NIDN: 00312 6651 (Ketua) Drs. Yan Ramona, M.App.Sc, Ph.D. NIDN: 0022106401 (Anggota) Ir. K. Ayu Nocianitri, M.Agr.Sc. NIDN: 0008036801 (Anggota)
Dibiayai oleh Direktorat Riset dan Pengabdian kepada Masyarakat Direktorat Jenderal Penguatan Riset dan Pengembangan, Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi, sesuai dengan Surat Perjanjian
Penugasan Pelaksanaan Penelitian Nomor :
486.175/UN14.2/PNL.01.03.00/2016, Tanggal 16 Mei 2016
UNIVERSITAS UDAYANA
OKTOBER 2016
RINGKASAN
Penaykit tidak menular akibat pola makan dan gaya hidup seperti penyakit jantung koroner (PJK) dan tekanan darah tinggi semakin meningkat di Indonesia.
Diperkirakan sebanyak 150 orang dalam 10.000 penduduk meninggal akibat PJK.
Oleh karena itu diperlukan upaya-upaya pemanfaatan biodivesitas Indonesia guna menurunkan PJK. Penelitian ini secara umum bertujuan untuk mengembangkan probiotik endogen Indonesia dalam pencegahan PJK melalui penurunan dan atau pengendalian kandungan kolesterol darah. Secara khusus, pada tahun pertama penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan sistem deteksi spesifik untuk melancak kolonisasi dan populasi Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan manusia, melalui pendekatan berbasis DNA mikrobiomik pada feses. Pengembangan sekuen pelacak khusus Lactobacillus sp F213 didasarkan pada susunan nukleotida pada bagian intrageneic spacer region (IGS) pada rDNA Lactobacillus sp F213 dan dari sekuan pita khusus yang diperoleh dari random amplified DNA polymorphism (RAPD).
Pada tahap pengembangan pendeteksi khusus ini dilakukan PCR terhadap IGS Lactobacillus sp F213 yang dibandingkan dengan Lactobacillus rhamnosus, Pediococcus spp, serta strain dari golongan non-bakteri asam laktat. Hasil penelitian menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 mempunyai panjang IGS yang spesifik, berbeda dengan L rhamnosus, Pediocoocus serta strain non-BAL, namun demikian IS Lactobacillus sp F213, L rhamanosus, dan Pediococcus spp menunjukkan pita ganada (mempunyai 2 buah IGS dengan panjang yang berbeda). Pita IGS ini sudah berhasil dipisahakan menjadi pita tunggal dan akan dilakukan sekeunsing dan selanjutnya merancang primer dan oligo probe specific untuk Lactobacillus sp F213.
Pada tahun ke dua ini telah dilakukan optimasi PCR spesifik serta optimasi isolasi DNA. Hasil menunjukkan bahwa PCR masih belum spesifik di mana limit deteksi dnegan memeprgunakan primer spesifik sekitar 103-104 sel. Untuk deteksi F21 dalam feses dilakukan dnegan DGGE dan diperoleh bahwa LbF213 terdeteksi pada feses serta terlihat pemberian LbF213 menciptakan lingkungan saluaran cerna lebih baik dutandai dnegan semakin beragamnya pita DNA bakteri saluran cerna dibandingkan dengan sebelum pemberian LbF213. Namun demikian, lama kolonisasi LbF213 belum dapat ditentukan secara pasti dan akan dievalusi kembali dengan mempergunakan metagnomik analisis dengan pyrsequenicng (new generation DNA sequencing). Pada saat ini penelitian sedang dalam masa adminitsratsi LbF213 pada subyek manusia sehat.
PRAKATA
Puji syukur kami panjatkan, karena atas rachmat-Nya laporan kemajuan ini dapat diselesaikan. Laporan kemajuan ini meruapakan capaian sementara dari serangkaian rencana penelitian pada tahun 2016. Tim peneliti mengucapkan terimakasih kepada Dirjen DIKTI melalui Litabmas, yang telah membiayai penelitian ini, Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Univ Udayana yang telah memfasilitasi dari pengususlan proposal sampai pada pencairan dana. Pada laporan kemajuan ini, masih banyak hal yang belum tercapai, sehingga peneliti akan bekerja keras untuk merampungakn penelitian tahun pertama ini sesuai kontrak yang etlah disepakati.
Semoga laporan kemajuan ini bermanfaat bagi kita semua.
Bukit Jimbaran, 31 Oktober 2016 Tim Peneliti
DAFATR ISI
Halaman
HAL PENGESAHAN --- ii
RINGKASAN --- iii
PRAKATA --- iv
DAFTAR ISI --- v
DAFTAR GAMBAR --- vi
DAFTAR TABEL --- vii
BAB I. Pendahuluan --- 1
BAB II. Tinjauan Pustaka --- 5
BAB III. Metode --- 12
BAB IV. Hasil --- 24
BAB V. Simpulan dan Saran --- 30
PUSTAKA --- 31
BAB I. PENDAHULUAN
Latar Belakang
Modernisasi memberikan andil pada pergeseran pola makan masyarakat dari makanan tradisional berserat tinggi ke makanan gaya barat dengan lemak tinggi dan rendah serat. Konsumsi makanan dengan kandungan asam lemak jenuh (asal hewani) yang tinggi merupakan salah satu faktor resiko penyebab penyakit jantung koroner (PJK), pembunuh nomor satu di dunia, sebagai akibat penimbunan kolesterol pada pembuluh darah. Data WHO menunjukkan bahwa pada tahun 2002 diperkirakan PJK menyebabkan 7 juta kematian di seluruh dunia dan pada tahun 2020 diperkirakan akan naik menjadi 11 juta jiwa. Dan di Indonesia diperkirakan 150 orang dalam 10.000 penduduk meninggal akibat PJK (Anon, 2008).
Pembentukan asam empedu merupakan mekanisme utama untuk megekskresikan kolesterol dari tubuh. Garam empedu (tauro-kolat dan gliko-kokolat) merupakan produk antara metabolisme kolesterol. Hidrolisis garam empedu oleh mikroorganisme saluran pencernaan yang mempunyai enzim bile salt hidrolase (BSH) menghasilkan taurin atau glisin serta asam empedu bebas. Asam empedu bebas ini berisfat tidak larut dan tidak direabsorbsi tubuh sehingga akan diekskresikan melalui feses (Kurdi et al., 2000). Semakin banyak asam empedu yang dibuang melalui siklus enterohepatik semakin banyak pula kolesterol darah digunakan untuk sintesis asam empedu baru (Brisson, 1981).
Penurunan kolesterol darah dilaporan dapat dilakukan dengan mengkonsumsi susu terfermentasi oleh Lactobacillus (Agerbaek et al., 1995; Bertolami et al, 1999;
Larsen et al, 2000; Schaafsma et al., 1998), walaupun secara mekanistik belum diketahui secara pasti bagaiaman Lactobacillus berperan dalam proses ini di dalam tubuh (De Rose dan Katan, 2000). Dari serangkaian hasil penelitian in vitro, diduga bahwa mekanisme penurunan kolesterol oleh Lactobacillus dan Bifidobacterium meliputi efek fisiologis dari asam lemak rantai pendek (short chain fatty acids) dalam saluran pencernaan (Kurdi et al, 2000; 2003), asimilasi kolesterol oleh Lactobacillus
dan Bifidobacterium (Klaver et al., 1993; Gilliland et a.l, 1985), pengikatan kolesterol pada permukaan sel Lactobacillus dan Bifidobacterium (Lin dan Cheh, 2000) serta dekonjugasi enzimatis garam empedu oleh Lactobacillus dan Bifidobacterium (Tahri et al., 1985; Tahri et al., 1996).
Mengingat bahaya dari kandungan kolesterol yang terlalu tinggi pada darah sebagai penyebab utama penyempitan pembuluh darah dan PJK sementara di terapi medis yang dilakukan dengan mempergunakan obat-obatan yang sangat mahal, maka dipandang perlu dilakukan penelitian untuk menggali potensi mikrobial alam Indonesia guna menanggulangi masalah kolesterol dan PJK. Probiotik merupakan salah satu pilihan yang menjanjikan.
Serangkaian penelitian untuk mengembangkan probiotik telah dilakukan secara in vitro dan in vivo. Penelitian in vitro dari aspek ketahan pada kondisi saluran pencernaan meliputi ketahan Lactobacillus sp F213 pH rendah, enzim pencernaan, dan asam empedu. Dari aspek keamanan meliputi bahwa Lactobacillus sp F213 tidak melakukan transformasi asam empedu primer (tidak memicu kolon kanker), tidak menyebabkan kerusakan pada saluran pencernaan, sifat tidak beracun (tidak me-lisis sel darah meras) serta Lactobacillus sp F213 tidak akut pada larva udang. Aspek fungsional meliputi kemampuan Lactobacillus sp F213 melekat pada epitel saluran pencernaan mencit untuk mencegah diare dan stimulasi sistem imun serta Lactobacillus sp F213 mampu menghidrolsisi garam empedu sebagai potensi dalam menurunkan kolesterol darah. Potensi in vitro telah teruji dalam penelitian in vivo seperti kemampuan berkompetisi untuk melekat apda saluaran pencernaan mencit yang diinfeksi dengan E coli O157, sehingga Lactobacillus sp F213 berpotensi untuk mencegah diare (Sujaya et al. 2010); Lactobacillus sp F213 mampu bertahan dalam saluran pencernaan tikus putih (Nocianitri et al., 2010) dan menurunkan 35% dari total kolesterol tikus (Nursini et al., 2010). Penelitian pada subjek manusia menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 terdeteksi pada sidik DNA mikrobiomik feces, serta dapat menurunkan 6,29% kolesterol dan dapat menurunkan TNF alfa sebanyak 35,87% (dari 9,2 pg menjadi 0,59 pg, sebelum dan setelah pemberian Lactobacillus sp F213). Disamping itu pemberian Lactobacillus sp F213 dapat
meningkatkan kenyamanan buang air besar (mencegah konstipasi) (Sujaya et al., 2012, 2013).
Rumusan Masalah
Setelah melakukan serangkaian penelitian untuk mengembangankan Lactobacillus sp F213 sebagai probiotik dengan potensi dapat menurunkan kolesterol, serta berdasarkan persyaratan WHO bahwa probiotik adalah mikroorganisme hidup yang dikonsusmsi dan dapat memberikan manfaat kesehatan bagi host, maka probiotik harus mampu bertahan dan berkembang biak pada saluran pencernaan. Oleh karena itu, rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :
Apakah Lactobacillus sp F213 dapat tumbuh pada saluran pencernaan dan berapakah populasi Lactobacillus sp F213 pada feses?
Berapa lamakah Lactobacillus sp F213 dapat berada pada saluran pencernaan manusia sehat ?
Bagaimankan efek pemberian Lactobacillus sp F213 terhadap profile lipid darah subjek yang diberikan Lactobacillus sp F213 ?
Tujuan Penelitian Tujuan Umum :
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan probiotik endogen Indonesia dalam pencegahan PJK melalui penurunan dan atau pengendalian kandungan kolesterol darah.
Tujuan khusus penelitian:
Untuk mengembangkan metode deteksi spesifik yang dapat diperguankan untuk diagnostik Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan ?
Untuk mengetahui lama waktu kolonisasi dan populasi Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan (feses)?
Untuk mengetahui efek fungsional pemberian Lactobacillus sp F213 terhadap profile lipid darah.
Manfaat khusus:
Manfaat dari penelitian ini adalah, secara teoritis, dapat menjelaskan bagaimana prilaku (aktivitas) dan pengaruh Lactobacillus sp F213 terhadap kesehatan saluran pencernaan serta profile lipid pada darah.
Manfaat aplikasinya adalah dapat menjadi salah satu pilihan dalam terapi biologis dalam penanggulangan masalah kolesterol darah dan berkontribusi dalam menurunkan kejadian penyakit PJK di Indonesia.
Urgensi (Keutamaan) Penelitian
Lactobacilli adalah golongan strain probiotik yang banyak dikembangkan dan dipercaya merupakan golongan bakteri menguntungkan bagi kesehatan manusia.
Keberadaan bakteri ini di dalam saluran pencernaan dipakai sebagai indikator tingkat kesehatan saluran pencernaan manusia. Di negara-negara maju, aplikasi probiotik tidak hanya ditujukan untuk menjaga kesimbangan bakteri menguntungkan saluran pencernaan manusia normal, tetapi juga untuk tujuan khusus seperti untuk penyembuhan penyakit khusus seperti atopy dan diare pada anak-anak, lactose intolerant (maldigession), kanker usus besar, imun modulator dan bahkan menurunkan tekanan darah tinggi. Oleh karena itu, aplikasi probiotik untuk tujuan penyehatan yang sangat spesifik semakin menjadi perhatian berbagai pihak.
Pergeseran pola makan ke arah western type diet dengan kandungan lemak dan protein tinggi berangsur-angsur semakin merambah masyarakat Indonesia. Pola konsumsi makan cepat saji juga semakin berkembang searah dengan modernisasi dan kesibukan masyarakat modern. Pola konsumsi dengan kandungan lemak hewani tinggi akan meningkatkan kadar kolesterol dalam darah dan akan menyebabkan penyakit yang berhubungan dengan tekanan darah dan jantung. Laporan WHO menyebutkan bahwa penyakit jantung koroner merupakan pembunuh nomor satu dan kecendrungan jumlah manusia meninggal akibat PJK semakin meningkat.
Kecendrungan serupa juga terjadi di Indonesia yang disertai dengan prilaku dan pola
makan yang kurang sehat seperti merokok serta konsumsi makanan yang mengandung lemak hewani yang tinggi. Sehingga PJK ini menjadi salah satu prioritas dalam bidang kesehatan. Mengingat terapi dan pengobatan penyakit ini sangat mahal maka perlu dicarikan alternatif pengobatan yang lebih murah.
Biodiversitas alam Indonesai memberikan peluang dalam penanggulangan PJK di Indonesia. Telah diketahui bahwa PJK erat kaitannya dengan kadar kolesterol di dalam tubuh serta secara mekanistik ekskresi kolesterol jahat di dalam tubuh erat kaitannya dengan aktivitas mikroorganisme di dalam saluran pencernaan manusia.
Dengan demaikian salah satu altenatif penurunan kolesteol darah adalah melalui modifikasi bakteri saluran pencernaan melalui konsumsi bakteri hidup yang apabila dalam jumlah yang memadai akan dapat memberikan dampak menyehatkan bagi manusia (Probiotik menurut WHO-FAO 2001). Untuk tujuan tersebut, serangaian penelitiantelah dilakukan untuk mengetahui potensi probiotik Lactobacillus sp F213 untuk menutunkan kolesterol dan mencegah diare termasuk aspek keamananya pada hewan coba. Penelitian ini dilakukan untuk pengembangan probiotik endogen Indonseia guna menurunkan kadar kolesterol darah sehingga dapat dipakai sebagai pilihan dalam terapi dan pengobatan PJK. Penelitian ini diharapkan akan mampu memberikan kontribusi dalam penatalaksanaan PJK serta pengembangan paket pengetahuan dan teknologi dalam eksplorasi potensi alam Indonesia, khususnya dalam bidang pengembangan makanan fungsional untuk food terapi PJK yang murah dan menyenangkan. Disamping itu, penelitian ini juga penting dalam peningkatan penguasaan ilmu dan teknologi bagi sumber daya manusia yang nantinya berkontribusi dalam pengembangan iptek di Universitas Udayana.
Luaran
Secara umum luaran dari penelitain ini adalah produk probiotik yang mengandung Lactobacillus sp F213, yang diisolasi dari saluran pencernaan bayi sehat, dengan efek fungsional dapat menurunkan kolesterol darah.
Guna mencapai tujuan /luaran umum tersebut, dalam rangkaian 2 tahun penelitain ini diharapkan luaran khusus adalah sebagai berikut:
1. Tahun 1,
Publikasi ilmiah/makalah/bahan ajar terkait sistem deteksi spesifik yang dapat membedakan Lactobacillus sp F213 dengan strain lainnya.
2. Tahun ke 2,
Publikasi ilmiah/makalah/bahan ajar terkait lama waktu kolonisasi
Lactobacillus sp F213 dalam saluran pencernaan serta dampaknya terhadap profile lipis darah.
BAB II. STUDI PUSTAKA Kasus Penyakit Jantung Koroner
Penyakit jantung koroner (PJK) telah menjadi penyebab utama kematian di dunia dewasa ini. Badan Kesehatan Dunia (WHO) mencatat lebih dari 7 juta orang meninggal akibat PJK di seluruh dunia pada tahun 2002. Angka ini diperkirakan meningkat hingga 11 juta orang pada tahun 2020. Di Indonesia, kasus PJK semakin sering ditemukan karena pesatnya perubahan gaya hidup. Meski belum ada data epidemiologis pasti, angka kesakitan/kematiannya terlihat cenderung meningkat.
Hasil Survei Kesehatan Nasional tahun 2001 menunjukkan 3 dari 10.000 penduduk Indonesia menderita PJK (Anon., 2008).
Penyakit jantung koroner (PJK) terjadi karena penyempitan/ penyumbatan pembuluh darah koroner yang berfungsi mendistribusikan darah dan oksigen ke otot jantung. Penyumbatan (plak aterosklerosis) disebabkan tertumpuknya endapan lemak (terutama kolesterol LDL), sel-sel otot polos pembuluh darah dan matriks ekstraseluler lainnya di sepanjang dinding arteri sebagai hasil proses yang berlangsung bertahun-tahun. Jika aliran darah berkurang secara bermakna, maka penderita perlu segera mendapat tindakan medis. Karena pentingnya penyakit ini dan kecendrungan peningkatan kasus dari tahun ke tahun maka telah diterbitkan pedoman teknis penemuan dan penatalaksanaan penyakit hipertensi yang merupakan salah satu faktor resiko dari PJK (Anon 2006, Depkes)
Kejadian PJK bervariasi antar negara dan lebih umum terjadi di negara-negara industrialis sehingga penyakit ini juga dipandang sebagai akibat gaya hidup dan pola makan. Western diet dengan kandungan lemak jenuh tinggi cenderung berasosiasi pada PJK. Di Inggris (UK) ditemukan bahwa 27% kematin disebabkan oleh PJK serta 12% disebabkan oleh strok, walaupun mortality rate PJK bervariasi antar negara.
Mortality rate PJK ii Jepang dilaporkan sebesar 15 per 100.000 penduduk, sementara di Finland sebanyak 198 per 100.000 penduduk (Marila-Sandholm dan Saarela, 2003).
Metabolisme kolesterol
Beberap studi epidemiologi menunjukkan bahwa ada korelasi positif antara kandungan kolesterol khususnya low dencity lippprotein (LDL) dengan PJK.
Akumulasi LDL pada plasma menyebabkan penumpukan kolesterol pada dinding pembuluh darah arteri, proses yang berhubungan dengan oksidasi LDL. LDL teroksidasi akan diambil oleh makrofag yang segera menjadi gelembung sel yang merupakan plak awal. Sehingga diperkirakan setiap kenaikan 1% LDL kolesterol setara dengan peningkatan 2-3% resiko PJK (Lovegrove dan Jackson, 2003). Tetapi sebaliknya, high dencity lipoprotein (HDL) memberikan efek yang berlawanan dengan LDL terhadap resiko PJK sehingga HDL dianggap sebagai kolesterol baik.
Kolesterol merupakan penyebab utama hipertensi dan PJK, oleh karena itu dalam penatalaksanaan PJK dan hipertensi kadar kolesterol dalam serum menjadi salah satu acuan. Individu dengan kandungan kolesterol darah 8.0 mmol/lt dan atau triasil gliserol di atas 3.0 mmol/lt tidak hanya memerlukan modifikasi diit tetapi juga disarankan mengkonsumsi obat penurun kandungan lemak dalam darah untuk membantu menurunkan faktor resiko PJK dan hipertensi. Pemberian obat yang ada efektif pada beberapa hal yaitu: menurunkan sintesis very low dencity lippprotein (VLDL) dan LDL, meningkatkan penghilangan VLDL, meningkatkan penghilangan LDL dan penghambatan enzim hidroksi metil glutaril CoA reduktase (Martilla- Sandholm dan Saarela, 2003).
Sintesis dan metabolisme kolesterol merupakan jalur metabolik utama dalam penaggulangan PJK. Kolesterol homeostatis dipelihara dalam tubuh mamalia melalui pengaturan tiga jalur metabolisme. Dua jalur metabolik adalah bagaimana mensuplai kolesterol ke dalam sel yang meliputi endogenus sintesis kolesterol dari prekursornya (asetat) dan eksogenus sintesis dimana LDL yang merupakan pembawa kolesterol pada darah (Ramirez et al., 1994). Ketiga jalur metabolik adalah konversi kolesterol yang melibatkan konversi kolesterol menjadi asam empedu. Kelainan pada regulasi metabolisme kolesterol berimplikasi pada penyakit karena jalur metabolisme utama dalam ekskresi kolesterol pada mamalia adalah melalui pembentukan asam empedu.
Sehingga eliminasi kolesterol merupakan faktor kritis pada beberapa penyakit seperti atherosclerosis, gallstone diseases, dan penyakit selain pada penyimpanan lemak (Ramirez et al., 1994).
Empedu merupakan produk utama metabolisme kolesterol yang tersimpan di dalam kantung empedu yang terdiri dari asam empedu, kolesterol, pospolipid dan pigmen bilirubin. Empedu disintetsis dalam sel hati dan akan disekresikan ke usus dua belas jari setelah adanya makanan yang masuk. Sehingga fungsi utama dari empedu adalah sebagai detergent biologis dan pelarut lemak dalam tubuh. Empedu juga berfungsi sebagai salah satu zat antimikrobial dalam tubuh (Begley et al., 2006).
Probiotik dan kolesterol
Persyaratan pengembangan probiotik baru
Probiotik didefinisikan sebagai bakteri hidup yang apabila dikonsumsi dalam jumlah yang memadai akan memberikan efek yang menguntungkan bagi yang mengkonsumsinya (FAO-WHO, 2001). Pada awal perkembangan era probiotik, L.casei strain Shirota (Yakult) serta L. rhamnosus GG, merupakan dua strain lactobacilli yang mengawali (pionir) perkembangan probiotik bakteri. Seiring dengan kemajuan teknologi, beberapa strain baru dikembangkan sebagai probiotik dengan berbagai keunggulan spesifik pada aspek kesehatan yang diharapkan (Klaenhammer dan Kullen, 1999).
Probiotik memberikan dampak menyehatkan pada individu yang mengkonsumsinya. Beberapa aspek menyehatkan probiotik antara lain: ekslusi, antagonis terhadp patogen, sebagai imun stimulator dan modulator, antikarsinogenik dan mutagenik, peningkatan simpton laktosa intoleran, menurunkan kolestrol darah, menurunkan tekanan darah, menghambat dan mencegah diare, mencegah vaginitis dan memelihara integritas mukosa usus (Sanders, 1998; Tannock, 1999; Mattilla- Shandholm et al., 1999). Adanya berbagai aspek menyehatkan tersebut, maka memberi potensi baru dalam pengembangan makanan fungsional dan bahkan formula
makanan khusus untuk bayi dan manusia usia lanjut seperti yang telah dikembangkan di Jepang melalui konsep FOSHU (food and ingredient for spesified health use).
Dalam pengembangan probiotik, strain yang dipergunakan sebaiknya telah teridentifikasi dengan baik, umumnya dengan susunan gen 16S rDNA sudah terdepositkan di bank data internasional. Adanya data genetik memungkinkan untuk mengembangkan sistem monitoring untuk menentukan secara spesifik populasi probiotik bakteri yang dikonsumsi di dalam saluran pencernaan agar efek fungsional yang ditimbulkan bisa dijelaskan dengan lebih baik. Disamping identifikasi strain dan sistem deteksi, ada beberapa kriteria yang diharapkan dalam pengembangan probiotik baru seperti: (1) kecocokan (untuk probiotik konsumsi manusia sebaiknya diisolasi dari saluran pencernaan manusia sehingga mengurangi resiko toksisitasnya); (2) kecocokan dalam teknologi pengembangan/produksi dimana diharapkan mudah diproduksi secara masal/skala besar, viabilitas yang tinggi, tidak mengganggu nilai sensoris bahan pangan apabila diikutkan dalam bahan pangan tertentu, stabil secara genetis dan memungkinkan dilakukan rekayasa genetika; (3) kemampuan bersaing (competitiveness) seperti mampu bertahan dan berkembang biak di dalam saluran pencernaan, tahan terhadap kondisi saluran pencernaan (asam empedu, pH rendah), mampu bersaing dengan flora normal di dalam saluran pencernaan, dan mampu melakukan adhesi pada sel epitel saluran pencernaan; (4) efek fungsional seperti mampu menimbulkan dampak menyehatkan, antagonis terhadap patogen, produksi zat antimikrobial, imunstimulator, anti karsinogenik dan anti mutagenik, produksi bioaktif (enzyme, vaccines, peptida) (Klaemhammer dan Kullen, 1999).
Guna memahami peranan dari probiotik Lactobacillus sp F213 pada kesehatan manusia dan marker biologi, merupakan hal penting untuk mengetahui efeknya terhadap komunitas bakteria pada saluran pencernaan manusia yang diberikan Lactobacillus sp F213. Pada penelitian ini perhatian difokuskan pada deteksi Lactobacillus sp F213 dan lama waktu kolonisasinya pada saluran pencernan yang dilihat dari DNA mikrobiomik feses serta pengaruh fungsional kesehatan yang ditimbulkannya.
Probiotik dan mekanisme penurunan kolesterol
Hiperkolesterolemia (peningkatan kadar kolesterol di dalam darah) telah diketahui sebagai salah satu pemicu PJK. Beberapa jenis obat-obatan telah tersedia untuk mengobati PKJ, namun demikian masih dipandnag belum optimal karena harganya yang relatif mahal serta adanya efek samping yang tidak diinginkan.
Konsumsi oral dari probiotik mampu menurunkan 22-33% dari total kolesterol darah (De Smet et al. 1994:1998: Torano et al., 1998). Efek penurunan kolesterol ini dapat disebabkan oleh aktivitas BSH (Kluver et al., 1993; Liong dan Saha, 2005). Asam empedu yang telah mengalami dekonjugasi mempunyai kelarutan yang lebih rendah dari pada bentuk garamnya sehingga menyebabkan ekskresi asam empedu bebas lebih banyak dalam feses. Asam empedu bebas juga mempunyai kemampuan yang kurang baik dalam melarutkan lemak serta kurang bisa diabsorbsi untuk dipergunakan kembali (siklus enterohepatik). Dengan demikian dekonjugasi garam empedu mempunyai peranan penting dalam menurunkan kolesterol di dalam darah.
Karakter inilah menyebabkan adanya BSH dalam strain probiotik memberikan keuntungan ganda guna menurunkan kolesterol darah dan menjaga keseimbangan bakteri saluran pencernaan.
Pemberian susu terfermentasi dengan mempergunakan Lactobacillus menurunkan kolesterol darah dari pasukan Masai pria sebanyak 9.8% (Lovegrove dan Jackson, 2003). Disamping itu, yoghurt yang difermentasi dengan mempergunakan Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus dapat menurunkan total serum kolesterol dan LDL (Jasper et al., 1984). Hal ini menunjukkan bahwa probiotik memberikan kontribusi dalam penurunan kolesterol darah.
Beberapa mekanisme telah diusulkan, yang meliputi efek fisiologis dari asam lemak rantai pendek yang terbentuk akibat aktivitas probiotik, kolesterol asimilasi, pengikatan kolesterol pada sel bakteri, serta aktivitas dekonjugasi garam empedu (Lovegrove dan Jackson, 2003). Mekanisme lain yang diperkirakan erat kaitannya dengan penurunan kolesterol darah adalah melalui transport kolat oleh Lactobacillus dan Bifidobacterium (Kurdi et al., 2000:2003), dimana asam kolat dapat terakumulasi
di dalam sel dan kemudian ikut terbawa feses. Aktifitas fermentatif probotik cenderung menyebabkan pH saluran pencernaan menjadi lebih asam. Asam empedu umumnya mempunyai derajat disosiasi pada pH agak netral (pH 64-6,5, untuk asam kolat dan deoksi kolat). Sehingga pada pH saluran pencernaan relatif rendah (lebih rendah dari pH 6,4) maka asam empedu akan mengendap dan terbawa feses. Hal ini akan menyebabkan penurunan kolestrol darah.
Studi pendahulaun dan Hasil yang sudah dicapai
Serangkaian penelitian untuk mengembangkan probiotik telah dilakukan.
Penelitian in vitro dari aspek ketahanan pada kondisi saluran pencernaan meliputi ketahan Lactobacillus sp F213 terhadap pH rendah di lambung, enzim pencernaan, dan asam empedu. Dari aspek keamanan ditemukan bahwa Lactobacillus sp F213 tidak dapat mentransformasi asam empedu primer (sehingga diduga tidak memicu kolon kanker), tidak menyebabkan kerusakan pada saluran pencernaan (histolgi saluran pencernaan mencit), bersifat tidak beracun (tidak me-lisis sel darah) serta tidak akut diuji menggunakan larva udang. Aspek fungsional meliputi kemampuan Lactobacillus sp F213 melekat pada epitel saluran pencernaan mencit untuk mencegah diare dan diduga dapat menstimulasi sistem imun. Ditemukan juga bahwa Lactobacillus sp F213 mampu menghidrolisis garam empedu dan berpotensi menurunkan kolesterol darah.
Potensi in vitro tersebut di atas telah teruji dalam penelitian in vivo seperti kemampuan berkompetisi untuk melekat (competetive exclusion) pada saluran pencernaan mencit yang diinfeksi dengan E coli O157, sehingga Lactobacillus sp F213 berpotensi untuk mencegah diare (Sujaya et al. 2010); Lactobacillus sp F213 mampu bertahan dalam saluran pencernaan tikus putih (Nocianitri et al., 2010) dan menurunkan 35% dari total kolesterol pada tikus hiperkolesteromik (Nursini et al., 2010). Penelitian pada subjek manusia menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 terdeteksi pada sidik DNA mikrobiomik feces, serta dapat menurunkan 6,29%
kolesterol darah, serta menurunkan TNF alfa sebanyak 35,87% (dari 9,2 pg menjadi 0,59 pg, sebelum dan setelah pemberian Lactobacillus sp F213). Lebih jauh diperoleh
bahwa pemberian Lactobacillus sp F213 pada subjek manusia dapat meningkatkan kenyamanan buang air besar (berpotensi untuk mencegah konstipasi) (Sujaya et al., 2012, 2013).
Output:
Lactobacillu s sp F213
4. Safety assesment
a. Uji in vivo atau pada hewan
Toksisitas pada larva udang
Kerusakan salaruan pencernaan mencit
b. Studi pada manusia
(Fase 1)
Stimulasi pertumbuhan bakteri menguntungkan
Populasi dan durasi 3. Karakterisasi fungsional
Uji in vitro
Bile salt hydrolase (penurun kolesterol)
Adhesi pada epitel (mencegah pelekatan patogen spt E coli dll) Studi pada hewan
Menurunkan kolesterol
Menghalangi pelekatan E coli O157
Output:
Probiotik
5. Double blind, randomized, placebo- controlled (DBPC)
pengujian pada manusia atau dengan desain lain untuk mengetahui efikasi produk
(Fase 2)
6. Percobaan yang lebih efektif, untuk
membandingkan probiotik dengan standar terapi dalam kondisi yang spesifik (Fase 3)
Pelabelan :
Contents : penandaan genus, spesies, strain
Jml. minimum bakteri hidup
Kondisi penyimpanan
Layanan informasi konsumen
Fase 4: Post Marketing 2. Identifikasi strain
Fenotip: API50 CHL Genotif : Seq. 16S rDNA
Genus, spesies, strain ISOLAT
Lactobacillus sp koleksi UNUDCC
1. Skrining karakteristik probiotik
Ketahanan pada kondisi saluran pencernaan : pH rendah, asam empedu, enzim pencernaan
Produksi zat antimikrobial
Ketahan terhadap antibiotika
Modifikasi asam empedu primer
Output:
Probiotic foods
2006 – 2011 (1-4a) 2012 – 2017 (fase 1. 4b)
Strain disimpan di International Culture Collection
Penelitian yg disusulkan
Sudah dilakukan
Gambar 1. Peta jalan penelitian pengembangan probiotik (disesuaikan dengan guide line pengembangan probiotic foods FAO&WHO 2002)
BAB III. METODE PENELITIAN
Usulan Tahun 1. Pengembangan metode deteksi Lactobacillus sp F213 Untuk mengembangkan metode diagnostik Lactobacillus sp F213 ada beberapa target gen yang akan dipergunakan (Gambar 2).
Gambar 2. Ilustrasi target gen dalam pengembangan sistem deteksi molekuler Lactobacillus sp F213.
Pada ilustrasi Gambar 2 terlihat bahwa kemungkinan target adalah berdasarkan variasi susunan basa nukleotida seperti variable region 1-3 pada 16S rDNA pada Lactobacillus sp F213. Namun dalam penelitian sebelumnya 16S rDNA dari Lactobacillus sp F213 menunjukan 99.9% homology dengan strain lain sehingga pendekatan yang akan dipergunakan adalah bagian intragenik spacer region (IGS), molekul 23S rDNA, 5,8S rDNA dan bahkan bagian tertentu dari keseluruhan DNA genom Lactobacillus sp F213.
Pada penelitian ini akan dicoba beberapa kemungkinan yaitu (1) sekuensing IGS serta (2) pita spesifik yang diperoleh dengan Random Amplified DNA Polymorpism (RAPD).
Usulan Tahun 2: Lama waktu Kolonisasi Lactobacillus sp F213 dalam saluran pencernaan
Lama waktu kolonisasi Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan adalah lama waktu masih terdeteksinya Lactobacillus sp F213 pada feces setelah pemberian probiotik Lactobacillus sp F213 dihentikan pada subjek manusia.
Pemberian probiotik Lactobacillus sp F213 pada subjek mengikuti etika penelitian pada manusia di Univ Udayana (dan juga protocol Helsinki). Sebelum penelitian dimulai, subjek diberikan penjelasan detail mengenai maksud dan tujuan percobaan, termasuk kemungkinan ketidaknyamanan yang muncul. Setelah itu barulah diperolh inform concenrn (Lampiran 5).
Rancangan penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan pretest-post test design:
O1---P---O2
O1 (pengukuran variabel sebelum dilakukan perlakuan/pemberian Lactobacillus sp F213)
O2 (pengukuran variabel setelah perlakukan/pemberian probiotik Lactobacillus sp F213)
Populasi target dan sampel
Populasi adalah orang yang secara sukarela mengikuti penelitian ini.
Sampel diambil secara konsecutif sampling sampai target penelitian terpenuhi, berjumlah sebanyak 30 oarng yang memenuhi kriteria inklusi yaitu sehat, usian 20-30 tahun.
Kriteria ekslusi adalah subjek tidak mendertia penyakit kronis, tidak mengkonsumsi probiotik, tidak sedang masa penyembuhan penyakit tertentu, tidak dalam mengkonsumi antibiotika dua minggu sebelum penelitain dimulai.
Prosedur Penelitian:
Strain dan kondisi pembiakan strain bakteri
merupakan strain potensial probiotik. Selain strain Lactobacillus sp F213 juga dipergunakan strain lain yang merupakan koleksi UNUDCC.
Strain Lactobacillu spp. dibiakkan dalam MRS broth, dalam keadaan anaerob (menggunakan anaerobic OXOID gas pouch) dan diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37oC.
Persiapan Probiotik (Enkapsulasi Lactobacillus sp. F2.13)
Pembuatan produk mikrokapsul Lactobacillus sp. F2.13 dengan konsentrasi maltodekstrin 10% dilakukan dengan cara sebagai berikut: maltodekstrin dimasukkan dalam air bebas ion pada suhu 50oC, diaduk sampai terbentuk larutan. Larutan didinginkan sampai suhu kamar dan dibiarkan selama 12 jam untuk meningkatkan hidrasi. Suspensi Lactobacillus sp. F2.13 (10% dari larutan enkapsulan) dicampurkan pada larutan enkapsulan dan dihomogenesasi selama 5 menit pada 2.000 rpm. Emulsi yang terbentuk selanjutnya dikeringkan dengan freeze dryer (Ilshin freeze dryer) dengan suhu –52 oC (Bylaite et al., 2001 yang dimodifikasi). Sebanyak kurang lebih 100 mg sel Lactobacillus sp F213 yang telah dienkapsulasi dimasukken ke dalam cangkang kapsul 100mg secara aseptis. Setelah itu kasul Lactobacillus sp F213 siap diadministrasiknkan kepada subjek (Sujaya et a., 2010).
Penghitungan viabilitas Lactobacillus sp F2.13
Setelah dilakukan enkapsulasi, populasi Lactobacillus sp F2.13 dihitung dengan mempergunakan MRS agar mengandung 60 ppm BCP sehingga diketahui viabel sel setiap gram produk enkapsulan (Sujaya et al., 2001).
Pemberian Lactobacillus sp F2.13 pada subjek manusia
Penelitian pada subjek manusia mempergunakan pre dan post analisis di mana subjek dianalisis kadar kolesterol darahnya sebelum dan sesudah admnistrasi Lactobacillus sp.
F213. Sebanyak 30 orang subjek secara sukarela dipergunakan dalam penelitian ini.
Subjek diberikan kapsul Lactobacillus sp. F213 mengandung 100mg sel kering (setara dengan +108 sel hidup) satu kapsul per hari. Kapsul diadministrasikan pada pagi hari setelah makan. Sebelumnya, subjek diberikan inform concern mengenai maksud dan
tujuan penelitian dan kerahasiaan subjek akan terjaga. Penggunaan manusia sebagai subek penelitian, mengikuti panduan penggunaan manusia dalam penelitian (Litbang, FK, Unud). Skema alur penelitian administrasi Lactobacillus sp F213 pada manusia dapat dilihat pada Gambar 5.
Pemberian probiotik LbF213
H-1 1 2 3 4 H+14
Pengambilan sampel darah
Analisis feses H+1
Pengambilan sampel dan feces
Gambar 3. Diagram pemberian Lactobacillus sp F213 pada subjek manusia.
Pengambilan diambil pada H-1 (satu hari sebelum administrasi F213), H+1 (satu hari setelah administrasi F213). H+14 (empat belas hari setelah administrasi F213 (fase wash out)).
Analisis Bakteri Asam Laktat pada feces
Bakteri asam laktat dianalisis pada feses subjek sebelum dan setelah pemberian probiotik Lactobacillus sp F213. Sample diambil sengan mempergnakan fecal sampler (Oxoid) dan dibawa ke laboratprium. Total BAL dihiting dengan mempergunakan MRS agar mengandung 60 ppm BCP.
Analisis Lactobacillus sp F213 Isolasi DNA feses
Sampel feces yang dipergunakan adalah sebelum pemberian Lactobacillus sp F213, setelah pemberian selama 28 hari; serta hari ke 3, 6, 9, dan 14 setelah pemberian probiotik dihentikan.
Isolasi DNA fese dilakukan dengan mepergunakan DNA isolation kit (MoBio).
Sampel sebanyak 0,1-0,3 gr ditimbang dan ditambahkan lizozym 50 ug dan dinkubasi pada huhu 37oC selama 30 menit. Selanjutnya sel mikroba dihancurkan dengan mepergunakan beadbeater (BioRad) pada kecepatan 3.000 rpm selama 15
diberikan dalam Kit.
Sebanyak 5 µl suspensi DNA di elektroforesis dan kosnnetrasi DNA diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelompang 260nm ( 1 skala OD660 setara dengan 1 ng DNA). DNA disimpan pada shu -20oC sampai dipergunakan dalam analisis selanjutnya.
Real Time PCR (RT-PCR)
Pengukuran konsentrasi sel dan jumlah DNA
Lactobacillus sp F213 ditumbuhkan dalam MRS broth selama 24-48 jam. Suspensi Lactobacillus sp F213 kemudain disebar dalam MRS agr untuk menentukan jumlah sel/ul broth. Sel Lactobacillus sp F213 dipanen dari 1 ml broth dengan sentrifugasi.
Kemudain DNA Lactobacillus sp F213 diisolasi dengan mempergunakan DNA isolation kit. Setelah itu konsentrasi DNA diukur dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 260nm ( 1 OD260 = 50 ng DNA). Dari konsentrasi DNA yang diperoleh dikalkulasi jumlah sel yang ada.
Kurva standar RT-PCR dan penenentuan jumlah sel Lactobacillus sp F213 pada feses
Kurva standar berbagai konsetrasi DNA (sumbu X) dengan intensitas flourisensi (sumbu Y) dibuat dan selanjutnya dipakai untuk menentukan jumlah DNA Lactobacillus sp F213 pada sampel yang ada dengan melakukan plot dari intensitas flourisensi hasil PCR sample terhadap konsentrasi DNA (sumbu X).
Analisis data
Data lama waktu kolonisasi Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan (feses) dianalisis secara deskriptif, populasi LbF213 pada saluran feces dianalisis dengan mempergunakan unji t dneagn taraf signifikansi 1 dan 5%.
IV. HASIL
Penyegaran strain Lactobacillus sp F213
Lactobacillus sp F213 disegarkan dari stok beku (-50oC). Strain di segarkan dalam MRS broth dan diinkubasi dalam keadaaan anaerob selama 24 jam pada suhu 37oC.
Setelah tumbuah, strain di streak pada MRS agar dan koloni yang tumbuah (Gambar 4A) diisolasi secara tunggal (single colony isolation) untuk menjamin kemurnian strain yang dipergunakan dalam penelitian ini. Konfirmasi strain dilakukan dengan mengamati pembutukan gas pada MRS broth serta pengecatan Gram (Gambar 4B).
Gambar 3A. Morfologi koloni Lactobacillus sp F213 pada media MRS agar
Gambar 3B. Morfologi mikroskopik Lactobacillus sp F213 pada media MRS Both
Keseragaman koloni pada MRS agar dan sel setelah dilakukan pewaranaa dnegan metilen biru, menunjukkan bahwa LbF213 dalam keadaan murni. Sel yang telah murni ini diisolasi satu koloni (singel colony isolation) dan diinokulasi dalam 5 ml MRS broth, diinkubasi selama 24 jam. Selanjutnya dipergunakan untuk inokulum pada pembuatan asa sel yang cukup dipergunakan untuk enkapsulasi. Masa sel yang diperoleh dari 1 lt
dengan cara dijenuhkan selama semalam dan selanjutnya dilakukan pemanasan sehingga maltodeksrin larut diserai dnegan pengadukan. Setelah suhu maltodektrin sekitar 55oC dicampur dengan masa sel yang tekah disuspensikan dalam larutan salin.
Gambar 4. Kapsul LbF213
Enkapulasi dilakukan sambil diaduk selama 3 jam sehinga sel terlindungi oleh enkapsulan. Sebanyak 100 ml sel yang sudah dienkapsulasi dimasukkan ke dalam tabung gelas dan dimasukkan ke dalam freezer sehingga sel LbF213 yang telah dienkapsulasi membeku dengan cepat. Setelah beku dimasukkan ke dalam freeze drier dan dibekukan selama 24-48 jam pada suhu -80oC. Sel yang telah kering beku selanjutnya digerus dan dimasukkan ke dalam cangkang kapsul (100 mg). Kapsul ini siap untuk diberikan kepada subjek penelitian.
Etik penelitian mempergunakan subyek manusia
Pada penelitian dneagn mempergunakan subyek manusia, dianggap sebagai penelitian uji klinik fase I. Pada penelitian uji klinis ada bebrapa persyaratan yang harus dilakukan termasuk Peneliti harus melibatkan dokter denagn sertifikat Good Clinical Practices.Disaming itu rancangan penelitian harus direvisi sehingga mengurangi resiko kalau terjadi dampak yang merugikan pada subyek manusia.
Gambar 4. Penjelasan penelitian kepada subyek, untuk enelitian biosafety (clinical trial tahan 1).
Penghitungan Populasi LbF213 setelah enkasulasi
Popuasi LbF213 pada sel setelah dienkapsulasi berkisar antara 106-108 cfu/gr.
Populasi ini sangat rendah sehingga perlu ditemuakan teknik pengeringan sel yang lebih baik. Di samping itu, kelemhana enkapsulasi dneagn memeprgunakan maltodektrin adalah masa yang sangat keras sehingga sulit untuk ditumbuhkan secara langsung.
Gamnbar Kapsul..
Pemberian LbF213 dan pengaruhnya terhadap profile bakteri saliarn pencernaan
Gambar..Pengaruh pemberian Lactobacillus sp F213 pada komposisi bakteri saluran pencernaan manusia.
Hasil analisis ini menujukkan bahwa pemberian LbF213 pada subyek manusia sehat, dapat meningkatakn lingkungan kondisi saluran pencernaan sehingga profl bakteri saluarn cerna semakin beragam, walaupun tidak menunjukkan perbedaan secara nyata.
Dengan kata lain LbF213 tda secara dramastis merubah bakteri saluran pencernaan manusia sehat. Namun semikian, emngingat metode yang dipergunakan masih kasar, di mana hanya beberapa spesies bakteri saja yg dapat dideteksi melalui PCR ini dan hanya satu kali un PCR dengan 30 siklus sehingga hanay bakteri dominat yang dapat
saluran yang lebih baik maka dalam penelitian ini juga sedang dilakukan metagenomik analisis, dengan pyrosequencing. PCR dan analisis metagenomic akan dilakukan di 1rst Bases (PT. Genetika Science Indonesia) dengan 3000 kali run secara berulang memmeprgunakan mesin NGS Ilumina Applied Biosystems. Analisis yang akan dilakukan alfa indices analisis untuk melihat perbedaan diverstas antar spesies dan beta indices untk melihat diverstas antar individu. Hasil ini akan menghasilkan data yang sangat akurat mengani pengarus pemberian LbF213 terhadap perubahan komposisi bakteri saluran pencernaan manusia.
V. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
Pemberian Lactobacillus sp F213 menyebabkan sedikit perubahan pada konsorsium bakteri saluran pencernan manusai.
Lactobacillus sp F2131 terdeteksi pada feces subyek yang mengkonsumsi probiotik Lactobacillus sp F213
Lama waktu kolonisasi Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan manusia belum dapat ditentukan secara pasti dengan metode yang dipergunakan (DGGE).
Saran
Perlu dilakukan analsisi metagnomik dengan pyrosequencing untuk memnentukan scara pasti kolonisasi Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan manusia.
DAFTAR PUSTAKA
Agerbaek, M. Gerdes, L.U., Richeslsen, B. 1995. Hyphoschelesterolemic effect of a new fermented milk product in healthy middle-aged men. Eur.J. Clin, Nutr., 49:
346-352.
Anonimous. 2001. Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria, Food and Agriculture Organization for the United Nations (FAO) and World Health Organization (WHO).
Anonimus. 2006. Pedoman teknis penemuan dan tatalaksana penyakit hipertensi.
Direcktoral Pegendalian Tidak Menular, Direktoral Jenderal PP dan PL, Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Aryantini, P.D. 2008. Isolasi dan karakterisasi bifidobacterium dari feces bayi. PS Ilmu Kesehatan Mayarakat. Univiersitas Udayana, Denpasar.Skripsi.
Artatai, LPSA. 2009. Karakteristik Probiotik dari lactobacillus sp F212 dan F213 serta kemampuan kompetisi pelekatannya dengan Eschericia coli O157 pada enterosit Mencit. Skrip PS Farmasi, FMIPA Unud.
Begley, M., Hill, C., Gahan, C.G.M. 2006. Bile salt hydrolase activity in probiotics.
Appl. Environ. Microbiol. 72: 1729-1738.
Bertolami, M.C., Faludi, A.A., Batlouni, M. 1999. Evaluation of the effect of a new fermented milk product (Gaico) on rimary hypercholesterolemia. Eur.J. Clin, Nutr., 53: 97-101.
Debruyne, P.R., Bruyneel, E.A., Li, X., Zimber, A., Gespach, C., Mareel., M.M. 2001.
The role of bile acids in carcigonesis. Mutation Res. 359-369.
De Smet, I., van Hoorde, I., De Saeyer, M., Vande, W.M., Verstraete, W. 1994. In vitro study of bile salt hydrolase (bsh) activity of bsh isogenic Lactobacillus plantarum 80 strains and estimation of cholesterol lowering through enhanced BSH activity.
Microbiol. Ecol. Haelth Dis., 7:315-329.
De Smet, I., De Boever, P., and Versetraete, W. 1998. Cholesterol lowering in pigs through enhanced bacterial bile salt hydrolase activity. Br. J. Nutr. 79:185-194.
De Rose, Nicole M and Martijin B. Katan. 2000. Effect of probiotic bacteria on diarrhea, lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and 1998. Am J. Clin. Nutr. 71: 405-411.
Dwipayanti, N.M., Suariani, Pt., K.A. Nocianitri. 2007. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari susu kuda sumbawa. PS Ilmu Keseahatn MAsyarakat Universitas Udayana. Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.
Dwipayanti, N.M., Suariani, Pt., K.A. Nocianitri. 2008. Identifikasi bakteri asam laktat dari susu kuda sumbawa. PS Ilmu Keseahatn Masyarakat Universitas Udayana.
Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.
Gilliand, S.E., Nelso, C.R. and Maxwell, C. 1985. Assimilataion of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ. Microbiol. 49: 377-381.
Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T.J. 1990. PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications. Academic Press. San Diego, New York.
Jasper, D.A., Massey,, L.K., and Luedecke, L.O. 1984. Effect of consuming yoghurt prepared with three culture strains on human serum lipoproteins. J. Food Sci., 49:1178-1181.
Klaver, F.A.M. and van der Meer, R. 1993. The assume assiliation cholesterol by lactobacilli dan Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt-deconjugation activity. Appl. Environ. Microbiol. 59: 1120-1124.
Kurdi, P., Tanaka, H., van Veen, H., Asano, K., Tomita, F., Yokota, A 2003. Cholic acid accumulation and its deminuation by short chain fatty acids in bifidobacteia.
Microbiology 149:2031-2037.
Kurdi, P., Van Veen, H, Tanaka, H., Mierau, I, Konings, W.N., Tannock, G.W., Tomita, F., Yokota, A. 2000. Cholic acid is accumulated spontaneously, driven by membrane ▲pH, in many lactobacilli. J. Bact. 182:6525-6528.
Larson, L.A., Raben, A., Haulrik, N., Hansen, A.S., Manders, M., Astrop, A. 2000.
Effetct of 8 weeks intake of probiotic milk products on risk factors for cardiovascular diseases. Eur.J. Clin, Nutr., 54: 288-297.
Liong, M.T. and Saha, N.P. 2005. Bile slat deconjugation ability, bile salt hydrolase activity and cholesterol co-precipitation ability of lactobacilli strains. Int. Dairy J., 15:391-398.
Lovegrove, J. and Jackson, K. 2003. Coronary heart diseases. In: Mattila-Sandholm, T.
and Saarela, M. (Ed), Functional Dairy Products. Woodhead Pub.Limited, Sambridge, Englan. Pp: 54-87.
Mattilla-Shandholm, T., Blum, S., Collins, J.K., Crittenden, R., de Vos, W., Dunne, C., Fonden, R., Grenov, G., Isolaury, E., Kiely, B., Marteau, P., Morelli, L., Ouwehand, A., Reniero, R., Saarela, M., Salminen, S., Shanahan, F., Vaughan, E., von Wright, A. 1999. Probiotics: towards demosntrating efficacy. Trend Food. Sci.
Technol., 10:393-399.
Nocianitri, K. A., dan I.D.G.M. Permana. 2006. Seleksi Bakteri Asam Laktat Sebagai Galur Probiotik Untuk Bayi Alergi Susu Formula. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan
Nocianitri, K. A., dan I.D.G.M. Permana. 2008. Identifikasi Lactobacilus sp. F16 dan Lactobacillus sp. BY85 dan kemampuan adhesinya pada epitel saluran pencernaan mencit. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.
Nocianitri, K.A., Aoyama, Y. 2001. Different response to choline deficiency of the serum ornithine carbamoyltransferase activity in four strains of rats. J. Biosci.
Biophysics Biochem. 65: 935-938.
Nocianitri, K.A. Sakata, S., Kanno, T., Kikuchi, H., Kurasaki, M., Aoyama, Y. 2002.
Influence of dietary methionine level on the liver metallothionein mRNA level in rats. J. Biosci. Biophysics Biochem. 66:2465-2470.
Nursini, W., NP. Desy Aryantini, K.A. Nocianitri, Y. Ramona, W. Redi Aryanta and I N Sujaya. Colonization of Lactobacillus sp. F2 in the Intestinal Tract and its
Functional Effect to Reduce Blood Cholesterol Content of Rats (Rattus
Norvegicus). The 2nd International Conference on Bioscience and Biotechnology, Udayana University, Bali, Indonesai, 23-24 Sept. 2010.
Ramirez, M.I., Karaoglu, D., Haro, D., Barrilas, C., Bashirzadeh, Gil, G. 1994.
Cholesterol and bile acid regulate cholesterol 7a-hydroxylase expression at the ranscriptional level in culture and in transgenic mice. Mol. Cell. Biolog. 14: 2809- 2821.
Rayuda, M.A. 2006. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari berbagai sumber alami. Jur. Biologi, FMIPA, Universiats Udayana. Denpasar. Skripsi.
Sanders, M.E. 1998. Overview of functional foods: emphasis on probiotic bacteria. Int.
Dairy J. 8: 341-349
Schaafsma, G., Meuling, W.J.A., van Dokkum, W., Bouley, C. 1998. Effect of a milk product , fermented by Lactobacillus acidophilus and with fructo-oligosaccharides added, on blood lipid in male volunteers. Eur.J. Clin, Nutr., 52: 436-440.
Sugita, I.M., Wijaya, N.K., Sujaya, I N. 2007. Rekayasa Starter dan Pembuatan Tablet Kunyah DAKULI , Untuk Menekan Pertumbuhan Kanker Dan Penurun Kolesterol Darah.Ditjen Dikti, Penelitian Hibah Bersaing.
Sujaya, I N, Ramona, Y. , Widarini, NP., Suariani, NP, Dwipayanti, N.M.U, Nocianitri, K.A., Nursini, N.W. 2008a. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Susu Kuda Sumbawa. J. Vet. 9:33-40.
Sujaya, I.N., Dwipayanti, N.M.U., Suariani, N.L.P., Widarini, N.P., Nocianitri, K.A., Nursini, N.W., 2008b. Uji in vitro ketahanan Lactobacillus spp. isolat susu kuda Sumbawa pada model saluran pencernaan. J. Vet. 9:52-59.
Sujaya, I N. Amachi, S. Yokota, A. Asano, K. and Tomita, F. 2001. Identification and characterization of lactic acid bacteria in ragi tape. W. J. .Microbiol. Biotechnol., 17: 349-357.
Sujaya, I N., D.M. Sukrama, K.J.P. Pinatih. 2006. Efek bifidogenik pisang secara in vitro dalam usaha pengembangan probiotic bifidobacterium. Laporan hasil penelitian Riset Pembinaan Ilmu dan Teknologi Kedokteran (RISBIN IPTEKDOK-2006) (unpublished)
Sujaya, I N. 2010. Development of Probiotic for Diarrheagenic Pathogens. International Symposium on Bioscinece and Biotechnology, Udayana University, 14-17 Sepet.
2010
Sujaya, I.N, DWM Sukrama, Y. Ramona, K.A Nocianitri, T Sone, K Asano. 2012.
Resistantce of Lactobacillus sp. F213 in human gastrointestinal tract as reveal by Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of fecal microbiome. (Hlaporan peneklitian Kerja sama luar negeri, Unud).
Sujaya, I.N, DWM Sukrama, Y. Ramona, K.A Nocianitri, T Sone, K Asano. 2013.
Resistantce of Lactobacillus sp. F213 in human gastrointestinal tract as reveal by Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of fecal microbiome. (Hlaporan peneklitian Kerja sama luar negeri, Unud).
Tannock, G. 1999. Introduction. In: Tannock, G.W. (Ed).Probiotics: A Critical Review.
Horizon Scientific Press. Norfolkm UK. Pp:1-4.
Torano, M.P., Medici, M., Perdigon, G., Ruiz Holgado, A.P., Valdae, G.F. 1998.
Efidennce of hypocholesterolemic effect of Lactobacillus reuteri in hypercholesterolemic mice. J. Dairy Sci., 81:2336-2340.
Yustiantara, PS. 2009. Aspek Keamanan dari lactobacillus sp F213 dalam penegmabngannya sebagai probiotik endogen Indonesia. Skripsi PS Farmasi, FMIPA Unud.
