Lampiran 2. Alur Mikroenkapsulasi, Metode Analisis ELISA Sandwich dan PCR. 1. Alur Proses Mikroenkapsulasi Probiotik E.

(1)

Lampiran 2. Alur Mikroenkapsulasi, Metode Analisis ELISA Sandwich dan PCR

1. Alur Proses Mikroenkapsulasi Probiotik E. faecium IS 27526

Diaduk

2,5 gram sel bakteri E. faecium IS 27526 9 gram susu skim

98,5 gram Avicel (diberi sedikit demi sedikit)

100 gram pelet didispersi

Dikasih aquades hingga diperoleh pelet yang kalis terhadap air

Pelet diekstruksi ± 280 rpm dan sferonisasi ± 800

Pelet dioven pada suhu < 35 ^oC

Dilakukan penyalutan dengan Na-alginat melalui metode FBD suhu 35⁰C, 2-3 atm

Dilakukan penyalutan dengan CaCl₂ melalui metode FBD suhu 35⁰C, 2-3 atm

Diperoleh pelet akhir yang telah di enkapsulasi sebanyak 57 gram dari 100 gram awal

10 gram pelet yang ada diambil dan diuji secara mikrobiologis

Total Plate Count (TPC) Kapang-khamir BAL

(2)

2. ELISA Sandwich

Metode Analisis sIgA fekal (Peters IR et al. 2004, modifikasi)

Metoda yang digunakan untuk menganalisis jumlah antibody sIgA fekal pada contoh adalah sandwich ELISA. Tahapan pertama yang dilakukan adalah optimasi range kurva standar sIgA manusia (0,0003125 µg/µl; 0,000625 µg/µl;

0,00125 µg/µl; 0,0025 µg/µl; 0,005 µg/µl; dan 001 µg/µl) dan analisis pengenceran sampel yang optimum dari beberapa tingkat pengenceran (1x, 2x, 3x dan 4x). Selanjutnya tahapan analisa konsentrasi sIgA contoh adalah 1) ekstraksi immunoglobulin sampel dan 2) ELISA

2.1. Ekstraksi Sampel

Sampel sebanyak 1 g (bb) diekstrak dengan 10 ml buffer (0,01 M phosphat-buffered saline; PBS pH 7,4 dan 0,5% tween Sigma-Aldrich dan 0,05%

sodium azida), kemudian dihomogenisasi dengan menggunakan kombinasi pengocokan manual dan homogenisasi mekanis menggunakan vorteks.

Kemudian suspensi disentrifus dengan kecepatan 1500 rpm selama 20 menit pada suhu 5⁰

Sebanyak 1 ml supernatan dipindahkan ke tabung efendorf steril yang telah berisi 10 μl koktail inhibitor protease (Sigma-Aldrich). Selanjutnya diforteks dan disentrifus pada 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tabung efendorf steril dan disimpan pada suhu -20

C.

0

2.2. Enzim-linkage immunosorbent assays (ELISA)

C sebelum dilakukan analisa.

Sebanyak 96 sumur mikroplat Maxisorp dilapisi dengan 100 μl anti-human IgA (1:4000) yang diencerkan dengan buffer karbonat, dan diinkubasi selama semalam pada suhu 4⁰C. Kemudian dicuci sebanyak tiga kali dengan larutan pencuci PBS-Tween 20 0,05% dan dua kali dengan larutan akuabides. Setelah itu ke dalam setiap sumur ditambahkan 100 μl larutan blocking (PBS-skim 5%), diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37⁰C dan dicuci. Pengenceran sampel yang optimum adalah 1 kali. Sampel dan standar human-IgA ditambahkan ke dalam plat sebanyak 100 μl (masing-masing diulangi 2 kali), diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37⁰

Kemudian ditambahkan 100 μl anti-human IgA-peroxidase conjugate 1:4000 yang diencerkan dengan PBS, diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37

C dan dicuci. Kisaran konsentrasi standar IgA manusia yang digunakan adalah 0,0003125 - 001 µg/µl.

0C dan dicuci. Selanjutnya ke dalam setiap sumur ditambahkan 100 μl larutan

(3)

substrat tetramethylbenzidine (TMB) dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37⁰

2.3. Larutan pereaksi dan antibodi untuk ELISA

C sehingga terbentuk warna biru dan kerapatan optik langsung diukur pada panjang gelombang 615 nm dengan menggunakan ELISA reader. Kurva standar IgA dibuat dari nilai rata-rata OD standar IgA pada setiap konsentrasi. Rata-rata OD yang diperoleh dari setiap sampel diplotkan terhadap kurva standar sehingga didapat nilal konsentrasi IgA sampel (µg/µl), kemudian dikonversi dengan faktor pengenceran dan diubah satuannya ke dalam µg/g bb feses.

a. Larutan stock PBS 10X (Phosphat Buffer Saline, pH 7,4)

Sebanyak 137,8 g disodium hydogen orthophosphate (Na2HPO4, BM 358,15) dan 15,9 sodium dihydrogen orthophosphate monohydrate (NaH2PO4.H2

b. Larutan PBS 1X

0, BM 137,90) dan 90 g sodium chloride (NaCl) ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam 500 ml aquabides dan ditepatkan volumenya hingga 1 liter.

Sebanyak 50 ml larutan stock PBS 10X ditambahkan aquabides sebanyak 450 ml dan disimpan pada suhu 4⁰

c. Larutan pencuci PBS-Tween 20 0,05%

C.

Sebanyak 0,5 ml tween 20 dilarutkan dengan 1 liter PBS 1X.

d. Larutan buffer karbonat-bikarbonat

Satu kapsul karbonat-bikarbonat ( Sigma) dilarutkan dalam 100 ml aquabidest, kemudian dihomogenkan.

e. Larutan blocking PBS-skim 5%

Sebanyak 5 g susu skim dilarutkan dengan larutan PBS 1X hingga volume 100 ml.

f. Substrat TMB

Satu tablet 3,3’, 5,5’-tetramethyl-benzidine dilarutkan dalam 9 ml phosphate citrate-buffer dan 1 µl larutan hydrogen peroksidase 30 %.

Kemudian ditambahkan dimehyl sulfoksida kemurnian 99,9% sebanyak 1ml.

(4)

3. METODE Polymerase Chain Reaction (PCR)

3.1. Ekstraksi DNA E. coli, Bifidobacteria dan Enterococcus faecium dari feses.

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan QIAmp Stool Mini Kit (Qiagen, Jerman), dengan langkah sebagai berikut :

Sampel feses sebanyak 0,5 gram dimasukkan ke dalam tabung 15 ml steril dan ditambahkan buffer ASL sebanyak 5 ml, kemudian divorteks selama 1 menit sampai sampel feses homogen. Lysate diambil sebanyak 2 ml dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian dilakukan pemanasan dalam waterbath pada suhu 80 ^oC selama 5 menit. Selanjutnya larutan tersebut divorteks selama 15 detik dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Supernatan diambil sebanyak 1,2 ml dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian ditambahkan 1 tablet InhibitEX dan divorteks sampai tablet tersebut terlarut, selanjutnya diinkubasikan pada suhu kamar selama 1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit. Semua supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf , selanjutnya disentrifugasi kembali dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit. Proteinase K sebanyak 15 µl dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang baru, kemudian supernatan tersebut diatas diambil 200 µl dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang mengandung proteinase K. Setelah itu ditambahkan buffer AL sebanyak 200 µl dan divorteks selama 15 detik, diinkubasikan selama 10 menit pada suhu 70 ^oC (dalam waterbath). Selanjutnya lysate ditambah dengan 200 µl etanol 96 % dan divorteks untuk mencapur larutan tersebut. Larutan tersebut diambil 500 µl dan dimasukkan ke dalam QIAmp spin column yang dilengkapi dengan tabung koleksi, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit dan tabung koleksi yang mengandung filtrat dibuang. QIAmp spin column tersebut diambil kembali dan dipasang lagi dengan tabung koleksi yang baru. Selanjutnya buffer AW1 sebanyak 500 µl dimasukkan ke dalam column tersebut dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit dan tabung koleksi yang mengandung filtrat dibuang. QIAmp spin column tersebut diambil kembali dan dipasang lagi dengan tabung koleksi yang baru. Selanjutnya buffer AW2 sebanyak 500 µl dimasukkan ke dalam column tersebut dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit dan tabung koleksi yang

(5)

mengandung filtrat dibuang. QIAmp spin column tersebut diambil kembali dan dipasang lagi dengan tabung eppendorf. Kemudian buffer AE sebanyak 200 µl dimasukkan ke dalam column tersebut, diinkubasikan selama 1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit dan tabung eppendorf yang mengandung filtrat diambil, kemudian disimpan pada suhu - 20 ^o

3.1.1. Amplifikasi DNA E. coli menggunakan primers universal stress protein A (uspA)

C.

Prosedur amplifikasi PCR fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan primers uspA, forward : 5’- CCG ATA CGC TGC CAA TCA GT -3’ dan reverse : 5’- ACG CAG ACC GTA AGG GCC AGA T -3 (Chen & Griffiths,1998, dimodifikasi). PCR dilakukan dengan total volume 50 µl larutan reaksi yang terdiri dari 30.65 µl nuclease free water (Applichem), 5 µl 10 X PCR buffer (Vivantis), 4 µl MgCl₂ (Vivantis, 25 mM), 1 µl dNTP (Vivantis, 10 mM), 2 µl primers (Midland, 10 pmol/µl), 0,35 µl Taq Polymerase (Vivantis, 5 U/µl ) dan 5 µl DNA templat. Kontrol positif dan negatif harus diikutkan dalam setiap amplifikasi. PCR dilakukan menggunakan mesin ABI 9700 dengan siklus sebagai berikut, 1 siklus pada suhu 94 ôC selama 5 menit, 35 siklus pada suhu 94 ôC selama 1 menit, 60 ôC selama 1 menit dan pada suhu 72 ôC selama 1 menit, dan dilanjutkan dengan 1 siklus pada suhu 72 ô

Produk PCR (amplikon) diambil 10 µl dan dicampur dengan 2 µl loading dye (Vivantis), selanjutnya diseparasi menggunakan 2 % agarose (Promega) yang telah ditambahkan ethidium bromide (Applichem) 0,5 µg/ml pada tegangan 120 V selama 50 menit dengan menggunakan marker 100 bp DNA ladder (Vivantis). Hasil elektroforesis selanjutnya dilihat dengan menggunakan Gel Documentation System (Vilber Lourmat).

C selama 5 menit.

3.1.2. Amplifikasi DNA Bifidobacteria primers g-Bifid

Prosedur amplifikasi PCR fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan primers g-Bifid, forward : 5’- CTC CTG GAA ACG GGT GG-3’dan reverse : 5’- GGT GTT CTT CCC GAT ATC TAC A -3’ (Matsuki et al, 2002, dimodifikasi).

PCR dilakukan dengan total volume 50 µl larutan reaksi yang terdiri dari 30.65 µl nuclease free water (Applichem), 5 µl 10 X PCR buffer (Vivantis), 4 µl MgCl₂ (Vivantis, 25 mM), 1 µl dNTP (Vivantis, 10 mM), 2 µl primers (Midland, 10 pmol/µl), 0,35 µl Taq Polymerase (Vivantis, 5 U/µl ) dan 5 µl DNA templat.

Kontrol positif dan negatif harus diikutkan dalam setiap amplifikasi. PCR

(6)

dilakukan menggunakan mesin ABI 9700 dengan siklus sebagai berikut, 1 siklus pada suhu 94 ôC selama 5 menit, 35 siklus pada suhu 94 ôC selama 1 menit, 55 ôC selama 1 menit dan pada suhu 72 ôC selama 1 menit, dan dilanjutkan dengan 1 siklus pada suhu 72 ô

C selama 5 menit.

3.1.3. Amplifikasi DNA Enterococcus faecium primers EM1

Prosedur amplifikasi PCR fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan primers EM1, forward (EM1A): 5’- TTG AGG CAG ACC AGA TTG ACG-3’dan reverse (EM1B): 5’- TAT GAC AGC GAC TCC GAT TCC-3’ (Cheng et al, 1997, dimodifikasi). PCR dilakukan dengan total volume 50 µl larutan reaksi yang terdiri dari 34.25 µl nuclease free water (Applichem), 5 µl 10 X PCR buffer (Vivantis), 1.5 µl MgCl₂ (Vivantis, 50 mM), 1 µl dNTP (Vivantis, 10 mM), 1.5 µl primers (Midland, 10 pmol/µl), 0,25 µl Taq Polymerase (Vivantis, 5 U/µl ) dan 5 µl DNA templat. Kontrol positif dan negatif harus diikutkan dalam setiap amplifikasi. PCR dilakukan menggunakan mesin ABI 9700 dengan siklus sebagai berikut, 1 siklus pada suhu 94 ôC selama 2 menit, 35 siklus pada suhu 94 ôC selama 1 menit, 55 ôC selama 1 menit dan pada suhu 72 ôC selama 1 menit, dan dilanjutkan dengan 1 siklus pada suhu 72 ô

C selama 7 menit.

(7)

3.2. Optimasi PCR

3.2.1. Polymerase Chain Reaction (PCR) E. coli Primers Universal Stress Protein A (uspA)

No Reagen 1 Konsentrasi Jumlah Reagen 2 Konsentrasi Jumlah 1 PCR Buffer

10X

1 x 5 ul PCR Buffer 10X

1 x 5 ul

2 MgCl2 (25 1.5 mM mM)

3 ul MgCl2 (25 2 Mm mM)

4 ul 3 dNTP mix (10

mM)

200 uM 1 ul dNTP mix (10 mM)

200 uM 1 ul

4 Primers Primers

uspA F 15 pmol 1.5 ul uspA F 20 pmol 2 ul

uspA R 15 pmol 1.5 ul uspA R 20 pmol 2 ul

5 Tag DNA Polymerase

1.25 U 0.25 ul Tag DNA Polymerase

1.75 U 0.35 ul 6 Nuclease Free

Water

- 32.75

ul

Nuclease Free Water

- 30.65

ul

7 Template - 5 ul Template - 5 ul

PCR Reaction (cycle) : 1 (94 ôC, 5 menit), 35 (94 ôC, 1 menit; 60 ôC, 1 menit; 72 ôC, 1 menit), 1 (72 ôC, 5 menit dan 4 ô

C)

Hasil Optimasi PCR Primers uspA

Kolom : 1 -2 Reagen 1 (E.coli dan ddwater) dan 3-4 Reagen 2 (E.coli dan ddwater)

(8)

3.2.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) Bifidobacteria Primers g-Bifid

No Reagen 1 Konsentrasi Jumlah Reagen 2 Konsentrasi Jumlah 1 PCR Buffer

10X

1 x 5 ul PCR Buffer 10X

1 x 5 ul

2 MgCl2 (25 1.5 mM mM)

3 ul MgCl2 (25 2 mM mM)

4 ul 3 dNTP mix (10

mM)

200 uM 1 ul dNTP mix (10 mM)

200 uM 1 ul

4 Primers Primers

g-Bifid F 15 pmol 1.5 ul g-Bifid F 20 pmol 2 ul g-Bifid R 15 pmol 1.5 ul g-Bifid R 20 pmol 2 ul 5 Tag DNA

Polymerase

1.25 U 0.25 ul Tag DNA Polymerase

1.75 U 0.35 ul 6 Nuclease Free

Water

- 32.75

ul

Nuclease Free Water

- 30.65

ul

7 Template - 5 ul Template - 5 ul

PCR Reaction (cycle) : 1 (94 ôC, 5 menit), 35 (94 ôC, 1 menit; 55 ôC, 1 menit; 72 ôC, 1 menit), 1 (72 ôC, 5 menit dan 4 ôC)

Hasil Optimasi PCR Primers g-Bifid

Kolom : 1 -2 Reagen 1 (Bifido dan ddwater) dan 3-4 Reagen 2 (Bifido dan ddwater)

(9)

3.2.3. Polymerase Chain Reaction (PCR) E. faecium Primers EM1A-EM1B

No Reagen Konsentrasi Jumlah

1 PCR Buffer 10X 1 x 5 ul

2 MgCl2 (50 mM) 1.5 mM 1.5 ul

3 dNTP mix (10 mM) 200 uM 1 ul

4 Primers

EM1A 1.5 pmol 1.5 ul

EM1B 1.5 pmol 1.5 ul

5 Tag DNA Polymerase 1.25 U 0.25 ul

6 Nuclease Free Water - 34.25 ul

7 Template - 5 ul

PCR Reaction (cycle) : 1 (94 ôC, 2 menit), 35 (94 ôC, 1 menit; 55 ôC, 1 menit; 72 ôC, 1 menit), 1 (72 ôC, 7 menit dan 4 ôC)

Kolom : 1 (isolat E.faecium BCC 0729), 2 (isolat E.faecium ATCC 19434), 3 (kontrol negatif-nuclease free water)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

Lampiran 3. Hasil Analisis Statistik

1. Kepatuhan Konsumsi Biskuit

Descriptives total biskuit

N Mean

Std.

Deviation Std. Error

95% Confidence Interval

for Mean Minimum Maximum

Lower Bound

Upper Bound

Lower Bound

Upper Bound

Lower Bound

Upper Bound

Lower Bound

Upper Bound

0 18 300.31 72.646 17.123 264.18 336.43 111 360

1 15 276.00 102.840 26.553 219.05 332.95 87 360

2 16 294.13 77.422 19.355 252.87 335.38 137 360

3 18 325.28 48.443 11.418 301.19 349.37 216 360

4 16 296.50 61.706 15.426 263.62 329.38 154 360

Total 83 299.40 73.714 8.091 283.31 315.50 87 360

Test of Homogeneity of Variances total biskuit

Levene

Statistic df1 df2 Sig.

4.566 4 78 .002

ANOVA total biskuit

Sum of

Squares Df Mean Square F Sig.

Between Groups 20861.798 4 5215.450 .958 .435

Within Groups 424700.43

1 78 5444.877

Total 445562.22

9 82

Bulan ke 1

ANOV A tkt patuh1

2390.192 4 597.548 1.337 .264

34863. 091 78 446.963

37253. 283 82

Between Groups W ithin Groups Total

Sum of

Squares df Mean S quare F Sig.

(17)

Bulan ke 2

Bulan ke 3

2. Status Gizi (BB, TB, Z skor BB/U) Berat Badan

Test of Homogeneity of Variances

deltaBBAkhir Levene

.452 4 78 .771

ANOVA

deltaBBAkhir

Sum of

Between Groups 2.467 4 .617 3.944 .006

Within Groups 12.198 78 .156

Total 14.665 82

1719.392 4 429.848 .878 .481

38177. 599 78 489.456

39896. 990 82

Between Groups W ithin Groups Total

Sum of

1216.291 4 304.073 .438 .781

54203. 389 78 694.915

55419. 681 82 Between Groups

W ithin Groups Total

Sum of

(18)

Tinggi Badan

Test of Homogeneity of Variances deltaTbAkhir

Levene

3.360 4 78 .014

ANOVA deltaTbAkhir

Sum of

Between Groups 4.426 4 1.106 1.013 .406

Within Groups 85.164 78 1.092

Total 89.589 82

Multiple Comparisons Dependent Variable: deltaB BAk hir

-.2383 .1383 .089 -.514 .037

-.2750* .1359 .046 -.546 -.004

-.5083* .1318 .000 -.771 -.246

-.3563* .1359 .011 -.627 -.086

.2383 .1383 .089 -.037 .514

-.0367 .1421 .797 -.320 .246

-.2700 .1383 .054 -.545 .005

-.1179 .1421 .409 -.401 .165

.2750* .1359 .046 .004 .546

.0367 .1421 .797 -.246 .320

-.2333 .1359 .090 -.504 .037

-.0813 .1398 .563 -.360 .197

.5083* .1318 .000 .246 .771

.2700 .1383 .054 -.005 .545

.2333 .1359 .090 -.037 .504

.1521 .1359 .266 -.118 .423

.3563* .1359 .011 .086 .627

.1179 .1421 .409 -.165 .401

.0813 .1398 .563 -.197 .360

-.1521 .1359 .266 -.423 .118

(J) Perlakuan 1

2 3 4 0 2 3 4 0 1 3 4 0 1 2 4 0 1 2 3 (I) Perlakuan 0

1

2

3

4 LS D

Mean Difference

(I-J) St d. E rror Sig. Lower Bound Upper Bound 95% Confidenc e Int erval

The mean difference is significant at the .05 level.

*.

(19)

Selisih (Delta) Z skor (BB/U. TB/U,BB/TB) menurut perlakuan

P0 Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean

Std.

Deviation Variance

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic

Std.

Error Statistic Statistic

DeltaBBu 18 .65 -.36 .29 -.0278 .04506 .19117 .037

DEltaTBu 18 1.0 -.4 .5 .052 .0607 .2574 .066

DeltaBBTB 18 1.37 -.82 .55 -.0856 .09628 .40850 .167

Valid N (listwise) 18

P1 Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean

Std.

Deviation Variance

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic

Std.

Error Statistic Statistic

DeltaBBu 15 1.31 -.63 .68 .1193 .07752 .30025 .090

DEltaTBu 15 .8 -.5 .3 .070 .0523 .2027 .041

DeltaBBTB 15 2.21 -1.12 1.09 .1027 .13731 .53180 .283

Multiple Comparisons Dependent Variable: deltaTbAkhir

-.1767 .3653 .630 -.904 .551

-.5442 .3590 .134 -1.259 .171

-.6028 .3483 .087 -1.296 .091

-.2760 .3590 .444 -.991 .439

.1767 .3653 .630 -.551 .904

-.3675 .3755 .331 -1.115 .380

-.4261 .3653 .247 -1.153 .301

-.0994 .3755 .792 -.847 .648

.5442 .3590 .134 -.171 1.259

.3675 .3755 .331 -.380 1.115

-.0586 .3590 .871 -.773 .656

.2681 .3694 .470 -.467 1.004

.6028 .3483 .087 -.091 1.296

.4261 .3653 .247 -.301 1.153

.0586 .3590 .871 -.656 .773

.3267 .3590 .366 -.388 1.041

.2760 .3590 .444 -.439 .991

.0994 .3755 .792 -.648 .847

-.2681 .3694 .470 -1.004 .467

-.3267 .3590 .366 -1.041 .388

(J) Perlakuan 1

2 3 4 0 2 3 4 0 1 3 4 0 1 2 4 0 1 2 3 (I) Perlakuan 0

1

2

3

4 LSD

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound 95% Confidence Interval

(20)

P2

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation Variance

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic Statistic

DeltaBBu 16 1.36 -.73 .63 .0025 .08963 .35852 .129

DEltaTBu 16 1.2 -.5 .7 .163 .0800 .3199 .102

DeltaBBTB 16 2.03 -1.15 .88 -.1350 .15762 .63049 .398

P3

DeltaBBu 18 1.11 -.08 1.03 .3089 .07320 .31056 .096

DEltaTBu 18 2.5 -1.1 1.4 .219 .1298 .5508 .303

DeltaBBTB 18 2.77 -1.10 1.67 .2628 .16453 .69804 .487

P4

DeltaBBu 16 1.13 -.30 .83 .2156 .07815 .31260 .098

DEltaTBu 16 .6 -.2 .4 .141 .0493 .1974 .039

DeltaBBTB 16 1.57 -.39 1.18 .2094 .12512 .50047 .250

3. Imonoglobulin A Sekretori (sIgA)

Test of Homogeneity of Variances

DeltaIgA Levene

.827 4 67 .513

ANOVA DeltaIgA

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 8.064 4 2.016 4.385 .003

Within Groups 30.804 67 .460

Total 38.868 71

(21)

4. Morbiditas (Diare dan Ispa)

Episode ISPA 4 bulan

Test of Homogeneity of Variances episode ispa dalam 4 bulan

Levene

1.115 4 78 .356

ANOVA episode ispa dalam 4 bulan

Sum of

Between Groups 21.404 4 5.351 2.050 .095

Total 224.964 82

Multiple Comparisons Dependent Variable: DeltaIgA

-.23056533 ******** .363 -.73350594 .27237527 -.31619280 ******** .214 -.81913340 .18674781 -.91772689* ******** .000 -1. 41192003 -.42353374 -.69524658* ******** .007 -1. 19818719 -.19230598 .230565335 ******** .363 -.27237527 .73350594 -.08562746 ******** .739 -.59716597 .42591104 -.68716155* ******** .008 -1. 19010216 -.18422095 -.46468125 ******** .074 -.97621975 .04685725 .316192799 ******** .214 -.18674781 .81913340 .085627464 ******** .739 -.42591104 .59716597 -.60153409* ******** .020 -1. 10447469 -.09859348 -.37905379 ******** .144 -.89059229 .13248472 .917726887* ******** .000 .42353374 1.41192003 .687161552* ******** .008 .18422095 1.19010216 .601534088* ******** .020 .09859348 1.10447469 .222480302 ******** .380 -.28046030 .72542091 .695246585* ******** .007 .19230598 1.19818719 .464681250 ******** .074 -.04685725 .97621975 .379053786 ******** .144 -.13248472 .89059229 -.22248030 ******** .380 -.72542091 .28046030 (J) Perlakuan

1 2 3 4 0 2 3 4 0 1 3 4 0 1 2 4 0 1 2 3 (I) Perlakuan 0

1

2

3

4 LS D

Mean Difference

*.

(22)

Diare

Test of Homogeneity of Variances episode diare dalam 4 bulan

Levene

1.342 4 78 .262

ANOVA

episode diare dalam 4 bulan

Sum of

Between Groups 67.237 4 16.809 6.692 .000

Total 263.157 82

Multiple Comparisons

Dependent Variable: episode ispa dalam 4 bulan LS D

1.311* .565 .023 .19 2.44

.194 .555 .727 -.91 1.30

.500 .538 .356 -.57 1.57

1.132* .555 .045 .03 2.24

-1. 311* .565 .023 -2. 44 -.19

-1. 117 .581 .058 -2. 27 .04

-.811 .565 .155 -1. 94 .31

-.179 .581 .758 -1. 34 .98

-.194 .555 .727 -1. 30 .91

1.117 .581 .058 -.04 2.27

.306 .555 .584 -.80 1.41

.938 .571 .105 -.20 2.07

-.500 .538 .356 -1. 57 .57

.811 .565 .155 -.31 1.94

-.306 .555 .584 -1. 41 .80

.632 .555 .258 -.47 1.74

-1. 132* .555 .045 -2. 24 -.03

.179 .581 .758 -.98 1.34

-.938 .571 .105 -2. 07 .20

-.632 .555 .258 -1. 74 .47

(J) Perlakuan 1

2 3 4 0 2 3 4 0 1 3 4 0 1 2 4 0 1 2 3 (I) Perlakuan 0

1

2

3

4

Mean Difference

*.

(23)

Multiple Comparisons Dependent Variable: episode diare dalam 4 bulan

LS D

2.400* .554 .000 1.30 3.50

2.021* .545 .000 .94 3.10

2.111* .528 .000 1.06 3.16

2.146* .545 .000 1.06 3.23

-2. 400* .554 .000 -3. 50 -1. 30

-.379 .570 .508 -1. 51 .75

-.289 .554 .604 -1. 39 .81

-.254 .570 .657 -1. 39 .88

-2. 021* .545 .000 -3. 10 -.94

.379 .570 .508 -.75 1.51

.090 .545 .869 -.99 1.17

.125 .560 .824 -.99 1.24

-2. 111* .528 .000 -3. 16 -1. 06

.289 .554 .604 -.81 1.39

-.090 .545 .869 -1. 17 .99

.035 .545 .949 -1. 05 1.12

-2. 146* .545 .000 -3. 23 -1. 06

.254 .570 .657 -.88 1.39

-.125 .560 .824 -1. 24 .99

-.035 .545 .949 -1. 12 1.05

(J) Perlakuan 1

2 3 4 0 2 3 4 0 1 3 4 0 1 2 4 0 1 2 3 (I) Perlakuan 0

1

2

3

4

Mean Difference

*.

(24)

Lampiran 4 Analisis Ekonomi

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

Lampiran 5. Dokumentasi Kegiatan

1. Sosialisasi Penelitian di Dinas Kesehatan Kab. Sukabumi, Puskesmas dan Kader

2. Skrening Balita Contoh

(30)

3. Pengadaan PMT Biskuit Fungsional

a. Pembuatan tepung ikan lele dumbo

b. Mikroenkapsulasi probiotik

c. Pembuatan Biskuit Fungsional

(31)

d. Paket PMT Biskuit Fungsional

4. Distribusi PMT Biskuit Fungsional di Lapangan

5. Pemantauan Selama Intervensi

(32)

6. Partisipasi Balita dan Pengasuh dalam Penelitian

7. Partisipasi Kader, Puskesmas dan Dinas Kesehatan dalam Penelitian

8. Pengumpulan Data, Sampel fekal

(33)

Lampiran 2. Alur Mikroenkapsulasi, Metode Analisis ELISA Sandwich dan PCR. 1. Alur Proses Mikroenkapsulasi Probiotik E.